Um modelo de linfoma de célula B Syngeneic Mouse para avaliação pré-clínica de pilhas de T de carro CD19
16 de outubro de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e testes pré-clínicos de murino células CD19 carro T por transdução retroviral e utilização como uma terapia contra linfoma de célula B A20 syngeneic estabelecida em camundongos BALB/c com ou sem lymphodepleting pré-condicionamento.
Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave no campo da imunoterapia de células CAR T, como a modificação genética das células CAR T e a combinação com outras terapias imunológicas. A principal vantagem desta técnica é que permite comparações entre o Lympho repleto e as configurações esgotadas de Lympho. Isso nos permite ver o papel das células imunes endógenas tanto na progressão da doença quanto em sua interação com as células T do CAR terapêutico.A implicação dessa técnica como 10 para a terapia no diagnóstico de tumor sólido porque as lições aprendidas neste modelo podem ser traduzidas diretamente para a casa dos doces com outros alvos, como o CEA. Para começar este procedimento. Primeiro, prepare todas as mídias e células necessárias, conforme descrito no protocolo de texto. No primeiro dia, no DMEM completo para 15 pratos quadrados de cultura de centímetros. Sementes 7,5 milhões de E-Cells de platina nestes pratos e incubar durante a noite em 37
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a produção de células T CAR CD19 murinas por meio de transdução retroviral. Explora-se sua aplicação como terapia contra linfoma de células B A20 alogênico estabelecido em camundongos BALB/c, com ou sem condicionamento prévio linfoablativo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunoterapia
- Oncologia
- Biologia Celular
Contexto
- A terapia com células T CAR é uma abordagem promissora no tratamento do câncer.
- Compreender a interação entre as células T CAR e as células imunes endógenas é fundamental.
- O estudo concentra-se na comparação entre condições linforepletas e linfodepletadas.
- Os conhecimentos obtidos podem ser aplicáveis a tumores sólidos e outros alvos terapêuticos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para a geração de células T com CAR anti-CD19.
- Avaliar a eficácia dessas células no tratamento do linfoma.
- Investigar o papel do ambiente imunológico nos resultados da terapia.
Métodos Utilizados
- Preparação de meios e células conforme o protocolo descrito.
- Plaqueamento de células E-platina em placas de cultura.
- Incubação das células em condições controladas.
- Avaliação da funcionalidade de células T com receptor de antígeno quimérico em diferentes ambientes imunológicos.
Resultados Principais
- Produção bem-sucedida de linfócitos T CAR CD19 murinos.
- Demonstração de diferenças na eficácia terapêutica com base no condicionamento imunológico.
- Compreensão do papel das células imunes endógenas na resposta ao tratamento.
- Implicações potenciais para aplicações mais amplas em oncologia.
Conclusões
- O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa com células T CAR.
- Os achados contribuem para o entendimento das interações de células T CAR in vivo.
- Estudos futuros podem expandir esses achados para aprimorar terapias contra o câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a avaliação pré-clínica de células T com receptor de antígeno quimérico (CAR) contra CD19 em um modelo murino de linfoma alogênico, apoiando a validação do alvo e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de imuno-oncologia. Ao comparar condições de linforepletividade e linfodepleção, o protocolo fornece subsídios para prever com confiança a eficácia das células T CAR e suas interações com o microambiente imune. O modelo auxilia decisões precoces em descobertas de construtos de células T CAR e terapias combinadas antes dos estudos habilitadores para pedidos de autorização clínica (IND).
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de construtos de células T com receptor de antígeno quimérico contra linfoma de células B estabelecido para validar o engajamento do alvo e a especificidade antigênica.
- Valor Operacional: Fornece um sistema reprodutível para avaliar a funcionalidade de células T com receptor de antígeno quimérico ex vivo utilizando citometria de fluxo, luminometria e ELISA.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera células T CAR murinas validadas para triagem subsequente de modificações genéticas e armamento com citocinas (por exemplo, IL-12).
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de produção retroviral e transdução utilizando células Plat-E, construtos MP71 e centrifugação assistida por fibronectina.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Avalia a atividade de células CAR T in vivo por meio de imagem de bioluminescência e rastreamento da progressão da doença em modelos sistêmicos de linfoma.
- Valor Operacional: Permite a comparação entre condições linfo-repletas e linfo-depletadas para reduzir riscos dos mecanismos terapêuticos e orientar estratégias de combinação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se na continuidade entre descoberta e pré-clínico, apoiando a identificação de candidatos promissores de designs de células T com receptores quiméricos de antígeno (CAR T) e orientando a validação pré-clínica por meio da modelagem do contexto imunológico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos de células CAR T e interações com células imunes endógenas no linfoma.
- Triagem: Fornece produtos padronizados e quantificáveis de células CAR T para condições reprodutíveis de ensaio.
- Análises: Utiliza bioluminescência, citometria de fluxo e ELISA para gerar leituras comparativas entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Modela a relevância da doença em hospedeiros singênicos para conectar a descoberta científica à avaliação de eficácia pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar iterações de células CAR T, combinações de citocinas e terapias complementares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos e compreensão mecanicista da dinâmica entre células T CAR e o microambiente imunológico.
- Valor Operacional: Produção reprodutível de células T CAR e validação funcional por meio de leituras ex vivo e in vivo.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou interromper o desenvolvimento, revelando eficácia dependente de linfodepleção e potencial de terapias combinadas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a células T CAR com base na resposta ao contexto imunológico.
Considerações de Implementação
- Experiência na produção de vetores retrovirais, cultivo celular e ensaios imunológicos.
- Acesso a células platina E, fragmentos recombinantes de fibronectina e infraestrutura de nível de biossegurança 2.
- Padronização da eficiência de transdução e validação da expressão do CAR entre diferentes lotes.
- Considerações de adaptação para diferentes construtos de CAR, antígenos-alvo e modelos de linfoma murino.
- As limitações práticas incluem a expressão de antígenos específicos do modelo e as diferenças entre o sistema imunológico murino e a fisiologia humana.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
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Days 1 & 2: Preparation and Transfection of Plat-E Retroviral Packaging Cell Line
2:11
Day 3: Preparation of Virus-Containing Supernatant for Transduction and Isolation and In Vitro Activation of Mouse Splenic T Cells
4:27
Day 4: Transduction of Mouse T Cells
6:43
Day 5: Round 2 of Transduction
8:33
In Vitro Validation of CAR T Cell Activity
9:53
Results: Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells
11:32
Conclusion
