Name: Um protocolo personalizáveis para String Assembly gRNA clonagem (STAgR) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda o método STAgR para clonagem multiplex de gRNAs em aplicações CRISPR/Cas9. Esta técnica utiliza Gibson Assembly para gerar vetores de expressão de gRNA de forma eficiente, personalizável e econômica em uma única etapa.

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Os autores gostaria de agradecer sua entrada ao Prof. Dr. Stephan Beck e Prof. Dr. Jovica Ninkovic, ajuda e suporte no desenvolvimento do método STAgR. Tobias Klötzer, Anna Köferle e Valentin Baumann para comentários úteis. O trabalho foi apoiado pelo DFG (STR 1385/1-1).

1. projeto de STAgR estratégia de clonagem
<ol><li>Decida sobre quantos gRNA cassettes será incluídos no vetor de uma expressão e em que ordem. Determinar quais promotores e gRNA andaimes devem ser usados para cada um do gRNAs. Desenha o gRNAs usando qualquer ferramenta on-line (por exemplo, www.benchling.com).</li>
</ol>2. projeto de STAgR clonagem Primers com saliências
Nota: A sequência de protospacer sentido de gRNA o passado e o antisentido de gRNA o primeiro respectivamente são adicionados para os primers PCR utilizados para a amplificação do backbone vector (Figura 1). As sequências restantes são amplificadas de cadeias de caracteres, assim anexar o sentido e antisentido gRNAs na ordem desejada. A primeira sequência de peça é amplificada com um primer frente contendo o primeiro gRNA N20 sequência como uma saliência e um primer reverso com a gRNA segunda sequência N20 (complemento reversa) como uma saliência. Todas as peças seguintes são geradas em conformidade.
<ol><li>Adicione N20 gRNA sequências para os primers de amplificação para a frente para sequência de ADN STAgR como saliências (tabela 1). Adicione sequências de gRNA sentido 5' para a frente da primeira demão "scf-FP" (para um andaime convencional) ou "sam-FP" (para um andaime contendo MS2). As primeiras demão FP anneal para a cadafalso/MS2 parte da cadeia de caracteres respectivos STAgR (Figura 1).</li>
	<li>Adicione o complemento reverso N20 gRNA sequência para as sequências de inversa da primeira demão. Escolha as primeiras demão RP dependendo dos promotores específicos e cadeias de caracteres usadas (RP-hU6, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).</li>
</ol>3. geração de STAgR clonagem de fragmentos
<ol><li>Para gerar os fragmentos individuais de clonagem para montagem de Gibson, executar PCRs pela criação de 10 µ l de tampão de alta fidelidade (HF), 1 µ l de dNTPs 10 mM, 0,25 µ l de saliência-primer (100 µM), 10 ng de polymerase de ADN modelo (cadeia de caracteres ou vetor), 0,5 µ l HF , 1,5 µ l de Dimetilsulfóxido (DMSO) e adicionar o H2O para fazer um volume final de 50 µ l. Nota: Use o plasmídeo "STAgR_Neo" como um modelo para a espinha dorsal do PCR para incorporar o andaime gRNA para a gRNA ontem, se o SAM Scaffold é escolhido, use "STAgR_SAM". Para um plasmídeo STAgR com gRNA seis fitas por exemplo, seis PCRs são necessárias, que cinco com DNA de sequências de caracteres como modelos e um com a espinha dorsal de vetor como o modelo.</li>
	<li>Incubar as reações em um thermocycler usando as seguintes condições: 1 ciclo de 98 ° C por 1 min 30 s; 38 ciclos de 98 ° C por 10 s, 59 ° C (para andaime gRNA) / 68 ° C (para loop de SAM) por 10 s, 72 ° C por 30 s (para inserções) / 1 min 30 s (para vetores); 1 ciclo de 72 ° C por 10 min.</li>
	<li>Remover a 5,5 µ l da reação de PCR, Adicionar corante de carregamento e analisar os fragmentos amplificados em um gel de agarose 1%. Uma escada de DNA apropriada para dimensionamento (100 bp DNA escada/1 kb DNA ladder) e executar o gel em um gel de adequada execução de carga Reserva (por exemplo, buffer TLE) em 120 V por 30 min.</li>
	<li>Enquanto o gel está em execução, adicione 5 µ l de buffer fornecido com a enzima de restrição e 0,5 µ l DpnI (10 unidades) para a reação de PCR restante 44,5 µ l e incube por 30 min a 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Realize a purificação de DNA usando esferas magnéticas.<ol>
<li>Adicionar 1,8 grânulos de magnético µ l por 1 µ l de produto do PCR e misture pipetando para cima e para baixo. Incube durante 2 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Contas separadas e fragmentos de DNA de líquido residual com um ímã. Lave grânulos duas vezes com etanol 70% enxaguando a pelota sem resuspending completamente.</li>
		<li>Remover todos os etanol com uma pipeta e seque ao ar da pelota.</li>
		<li>Dissolva a pelota em 15 – 20 µ l H2O pipetando para cima e para baixo e separar os grânulos do líquido usando um ímã. Transferi o sobrenadante claro para um tubo novo. Nota: Alternativamente, kits de limpeza reação baseada na coluna podem ser usados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine as concentrações de DNA usando um spectrophotometer conforme descrito em outro lugar,29.</li>
</ol>4. Gibson Assembly reação e transformação bacteriana
Nota: As etapas a seguir são adaptadas de Gibson et al . 30.
<ol><li>Prepare uma Gibson caseiro reação misturar ou usar um kit de clonagem comercial Gibson.<ol>
<li>Combine 3 mL de 1 M Tris (Tris (hidroximetil) aminometano)-HCl pH 7,5, 300 µ l de 1 M de MgCl 60 µ l de 100 mM dGTP (Desoxiguanosina trifosfato), 60 µ l de 100 mM dATP (Desoxiadenosina trifosfato), 60 µ l de 100 mM dTTP (cromatografia trifosfato), 60 µ l de 100 mM dCTP ( Desoxicitidina trifosfato), 300 µ l de 1 M DTT (ditiotreitol), 1,5 g de 8000-PEG (polietileno glicol), 300 µ l de 100mm NAD (dinucleótido de nicotinamida e adenina) e adicionar o H2O para obter 6 mL de tampão de reação isotérmica × 5. Nota: Aliquotada tampão pode ser armazenado a-20 ° C durante pelo menos 12 meses.</li>
		<li>Para o mestre de montagem Gibson misturar, combinar 320 µ l de tampão de reação isotérmica x 5 com 697 µ l de H2O e adicionar 3 µ l de 10 do exonuclease T5 U / µ l, 20 µ l de 2 U / µ l de DNA polimerase e 160 µ l de 40 ligase do ADN de Taq U / µ l. Nota: Esta mistura pode ser aliquotadas e armazenado a-20 ° C durante pelo menos 12 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use 7,5 µ l do mix de mestre de montagem com 2,5 µ l de inserção e vetor. Para uma reação de x STAgR 2 usa um vetor de molar para inserir a proporção de 1:1, mas não mais de 0,2 pmol de DNA total. Por mais de 2 fitas de expressão gRNA, usar um vetor para inserir a proporção de 1:3 mas não exceda uma quantidade de DNA total de 0,5 pmol. Nota: Todas as fitas de expressão amplificada gRNA devem ser usadas em montantes equimolar. Inclua um controle de shRNA com o montante idêntico do vetor, mas sem inserções de controle para o modelo não digerida vector (e/ou ligadura self).</li>
	<li>Incube as amostras a 50 ° C para amostras de 45 a 60 min. loja no gelo ou a-20 ° C para posterior transformação. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Diretamente transforme metade da mistura em bactérias quimicamente competentes.<ol>
<li>Descongele quimicamente competentes TOP10 Escherichia coli bactérias no gelo.</li>
		<li>Adicione 5 µ l do mix Gibson para 50 µ l de bactérias competentes. Misture suavemente por agredir o fundo do tubo. Incube no gelo por 30 min.</li>
		<li>Executar um choque térmico, colocando o tubo no banho maria a 42 ° C ou um bloco de calor por 45 s.</li>
		<li>Calce os tubos de gelo. Adicionar 250 µ l de meio SOC para as bactérias e deixá-los a recuperar a 37 ° C numa incubadora de agitação por 30-45 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a recuperação, placa as bactérias transformadas em placas de ágar de caldo (LB) 1,5% lisogenia contendo ampicilina (100 µ g / mL) e incubar durante uma noite a 37 ° C.</li>
</ol>5. seleção de Clones de STAgR por PCR de colônia bacteriana
<ol><li>Prepare pelo menos dois conjuntos de 200 µ l reação da polimerase (entre 3 e 24) para cada construção, que são rotulados de forma idêntica.</li>
	<li>Preencher um conjunto com meio LB 100 µ l contendo 100 µ g / ampicilina mL.</li>
	<li>Use uma ponta de pipeta estéril para raspar o material biológico de uma colônia bacteriana e espalhá-lo no fundo do tubo de reação de PCR de 100 µ l vazio. Transferi imediatamente a ponta para o segundo tubo de reação correspondente, contendo o meio LB.</li>
	<li>A ponta ao redor agitar suavemente o frasco para assegurar algumas bactérias são transferidas para a mídia LB e incubam a 37 ° C para uso posterior.</li>
	<li>Prepare uma mistura de mestre de PCR (10 µ l por reação).<ol>
<li>Para 10 reações, combinar 10 µ l de buffer de Taq , 2 µ l 10mm dNTPs, 0,5 µ l de primer (100 µM), 0,5 µ l de Taq polimerase e adicionar um volume de 100 µ l de H2O.</li>
		<li>Use os seguintes primers: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 10 µ l da mistura mestre PCR para os tubos de reação de PCR rotulados sem a mídia LB.</li>
	<li>Incubar as reações em um thermocycler usando as seguintes condições: 1 ciclo de 94 ° C por 5 min, 38 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 2 min; 1 ciclo de 72 ° C por 10 min. Nota: O tempo de alongamento (etapa de 72 ° C) deve ser aumentado com o número de fitas de expressão gRNA. Calcular tamanho teórico de inserções usando a tabela 2 e usar 1 min por 1 kb a 72 ° C.</li>
	<li>Adicionar corante de carregamento e analisar os fragmentos amplificados em um gel de agarose a 1%. Carregar uma escada de DNA apropriada para dimensionamento (1kb DNA Ladder) e executar o gel apropriado em reserva (por exemplo, o Buffer) em execução em 120 V por 30 min.</li>
	<li>Calcule o tamanho teórico do amplicon com a ajuda da tabela 2 por somando os tamanhos individuais de promotores usados, gRNA andaimes e número de sequências de N20. Partir dos resultados da colônia do PCR, identifica os clones bacterianos baseados o tamanho correto da banda e se eles são propensos a abrigar vetores corretos.</li>
	<li>Inocule a cultura correspondente de 100 µ l, configurada anteriormente, uma cultura LB 2,5 mL durante a noite (com 100 ampicilina µ g/mL). Incube a 37 ° C, durante 12 h.</li>
	<li>Extrair o DNA do plasmídeo usando um kit de mini plasmídeo comercial e de instruções do fabricante31.</li>
	<li>Sequenciar os plasmideos usando os seguintes primers: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) e StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) por sequenciamento Sanger.</li>
</ol>

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<li>Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+CRISPR%2FCas9+multiplex+editing+capability+with+the+endogenous+tRNA-processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para STAgR permitindo a geração rápida e simples de plasmídeo de expressão gRNA de tamanhos variados. Este protocolo pode ser usado para a geração de uma etapa de gRNA plasmídeos com fitas de expressão de gRNA 2 – 8 (com ou sem duas aptamers MS2 RNA) para o vetor de expressão de gRNA STAgR_Neo e o uso de U6 humano, rato U6, 7sK humano e humano H1 promotores28 ,de32,33. Se mais de quatro fitas são desejadas, é recomendável usar pelo menos dois tipos diferentes de promotor/andaime para aumentar a eficiência. Outros vetores, promotores e combinações do promotor, bem como mais de 8 fitas gRNA também podem ser viáveis; no entanto, isso não foi testado. Embora em nossa experiência, o método funciona reproducibly e confiável, nós determinamos passos críticos e estratégias de resolução de problemas o resultado esperado não imediatamente caso ocorra. Em nossa experiência, alguns passos são cruciais para o sucesso da abordagem: primeiro e acima de tudo, é importante usar os rácios molares correctos de pastilhas para o backbone de vetor na etapa de montagem Gibson (3:1). No entanto, notamos que uma proporção de 1:1 de inserções de vetor é benéfica, mesmo quando o número de gaveta gRNA exceda dois para alguns conjuntos de gRNA. Em segundo lugar, o período da reação montagem Gibson deve ser suficientemente longo (pelo menos 45 min recomendado).
STAgR pode ser empregado com um grande número de modificações. Direcionamento de sequências, gRNA números e andaimes, promotores e backbones de vetor podem ser personalizados e livremente combinados. No entanto, cada combinação pode ter requisitos ligeiramente diferentes. Em nossa experiência, se médio ou elevado números de gRNA cassettes (> 4) são desejados, mas não obteve imediatamente, geralmente o caminho mais rápido para superar este problema é para alterar a ordem das fitas gRNA individuais do vetor. Da mesma forma, combinar diferentes gRNA promotores e andaimes melhora a eficiência (e, portanto, reduz o número necessário de colônia PCRs que têm de ser marcados) quando muitos gRNA fitas são clonadas. Nós achamos que clones incorretas são geralmente gerados pela conjunção espontânea de sequências repetidas durante a montagem de Gibson. Embora isto pode reduzir a eficiência do método, isto também resulta na geração simultânea de vetores com gRNA funcional subconjuntos28.
Geração de multiplexação gRNA vetores que contenham mais de uma gaveta de expressão gRNA tem sido relatada com um número de diferentes métodos21,22,23,24,25, 26,,27. Enquanto alguns empregam simultânea ou sequencial de clonagem de gRNA pares22,34, outros dependem de montagem de Golden Gate e vários sequencial clonagem passos25,35. Uma abordagem especial tem sido usada por Xie et al., empregando o sistema de processamento de tRNA celular endógena para cortar várias gRNAs de um único progenitor transcrição36. O advangetage desse método é a exigência de apenas um promotor; a desvantagem é a necessidade de fragmentos de DNA recém sintetizados para cada combinação de gRNA. Cada gRNA multiplexação método tem vantagens e desvantagens; STAgR combina simplicidade com eficiência, o elevado número de possíveis gRNA cassettes com baixo custo.
STAgR (e outros sistemas de multiplexação) provavelmente será instrumentais no sentido de permitir interrupção eficiente (e simultânea) de vários genes na vivo, como foi o pioneiro no zebrafish cérebros28. Uma outra aplicação futura de multiplexação vetores gRNA é a promessa para a manipulação de programas completos de transcriptional em contraste com a indução ou repressão de genes único. Provavelmente, essas abordagens permitirá transformar células e órgãos em vão a um grau muito maior do que é possível hoje.

Sequência de caracteres conjunto gRNA clonagem (STAgR) é um método permitindo eficiente durante a noite geração de vetores de expressão que contém a expressão de gRNA várias fitas em um único clonagem passo. O protocolo de STAgR não depende de conhecimentos especializados ou materiais e oferece várias opções de personalização.
A proteína bacteriana CRISPR Cas9 tem uma capacidade única. É capaz de encontrar e ligam seletivamente apenas aquelas sequências de DNA codificadas em crRNAs naturais ou gRNAs engenharia1. A sua utilização como uma ferramenta molecular permitiu que um grande número de abordagens que eram impossível, impraticável ou limitado apenas para alguns modelos de celulares até recentemente. Estes incluem de mutações do gene alvo2, genoma engenharia3, Epigenoma edição4,5,6, ativação transcricional e7,8de silenciamento do gene. Tanto quanto sabemos que CRISPR é universalmente destacável, como relatórios de sua aplicação existem para uma grande variedade de espécies, tipos de células e sites de destino. No entanto, muitos aplicativos CRISPR dependem directa ou indirectamente a entrega de vários gRNAs, incluindo uma série de manipulações genômicas (translocações9,10, médio11 e alterações genômicas em grande escala 12 , 13), engenharia de genoma (uso de Cas9 nickases14), geração de alelos condicional11,15 ou mutações série16e traçando estratégias17. Além disso, para outras abordagens (transcriptional engenharia18, Epigenoma engenharia19,20) vários sites de segmentação não são estritamente obrigatório, no entanto atingirem seu máximo efeito muitas vezes apenas sob este condição.
Foram descritos vários métodos úteis para gerar vetores gRNA contendo mais de uma gRNA expressão gaveta21,22,23,24,25,26, 27. Aqui, apresentamos um protocolo para STAgR, sequência montagem gRNA clonagem, que é excelente em sua combinação de simplicidade e velocidade (apenas uma noite passo clonagem é necessário), baixo custo (como modelos de DNA podem ser reutilizados várias vezes), personalização (para gRNA diferentes sistemas e promotores) e eficácia (permite a geração de vetores contendo números elevados de gRNA cassettes)28.
STAgR pode, em princípio, ser utilizado para gerar vetores de expressão com alguns (1 – 2 gRNAs), vários (3 – 5 gRNAs) e alguns de maior número de fitas de expressão relataram até agora (6 – 8 gRNAs)28. Da mesma forma, STAgR é aplicável para qualquer sequência de gRNA, espinha dorsal ou promotor. Desde que no entanto, STAgR é principalmente baseado em reações em cadeia do polymerase (PCR) e montagem Gibson, gRNAs com similaridades de sequência alta devem ser geradas usando um método alternativo.

<table><tbody><tr><td>Polimerase de DNA de alta fidelidade de Phusion</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Polimerase para Gibson Master Mix, bem como todos os PCRs</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0191</td><td>dNTPs para todos os PCRs</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Life Technology</td><td>R0141</td><td>dNTPs para Gibson Master</td></tr><tr><td>Mix dCTP</td><td>Life Technology</td><td>R0151</td><td>dNTPs para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Life Technology</td><td>R0161</td><td>dNTPs para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dTTP</td><td>Life Technology</td><td>R0171</td><td>dNTPs para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>443666A</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>para limpeza de DNA</td></tr><tr><td>Tris HCL</td><td>Roth</td><td>9090.2</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>TDT</td><td>Life Technology</td><td>R0861</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>VWR</td><td>RC- 077</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Cayman Chemicals Company</td><td>16077</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>T5 Exonuclease</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>para Gibson Master</td></tr><tr><td>Mix Ampicilin</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder 1 kb Plus</td> Kit Mini Plasmídeo <td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr>Sequências <td></td><td></td> de<td>Plasmídeos e Primers</td><td>Todas as sequências disponíveis na Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReacAppliChem</td><td>6381-92-6</td><td>para TLE</td></tr><tr><td>Buffer MgCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>M8266</td><td>para Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Top10 bactérias quimicamente competentes</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Yeast-Extract</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1625</td><td>para caldo lisogênico (LB Media)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td><td>para caldo lisogênico (LB Media)</td></tr><tr><td>Peptona</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td><td>para caldo lisogênico (LB Media)</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td><td>para caldo lisogênico (LB Media)</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerase</td><td>Quiagen</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo personalizáveis para string assembly grna clonagem (stagr)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

O sistema CRISPR/Cas9 bacteriano aumentou substancialmente opções metodológicas para os cientistas da vida. Devido à sua utilização, engenharia genética e genômica tornou-se aplicável a uma grande variedade de sistemas. Além disso, muitos transcriptional e abordagens de engenharia de epigenomic são geralmente viáveis agora pela primeira vez. Uma das razões para a ampla aplicabilidade do CRISPR reside na sua natureza bipartida. Pequenos gRNAs determinar os alvos genômicos do complexo, variantes da proteína Cas9 e as consequências locais moleculares. No entanto, muitas abordagens CRISPR dependem a entrega simultânea de múltiplos gRNAs em células individuais. Aqui, apresentamos um protocolo personalizável para sequência montagem gRNA clonagem (STAgR), um método que permite a geração simples, rápida e eficiente de gRNA multiplexado vetores de expressão em clonagem de um único passo. STAgR é rentável, desde que (no presente protocolo) as sequências alvos individuais introduzidas pela saliência curta primários enquanto os modelos de DNA longos das fitas de expressão gRNA possam ser reutilizados várias vezes. Além disso, STAgR permite a incorporação de passo a passo de um grande número de gRNAs, bem como combinações de gRNA diferentes variantes, vetores e promotores.

Seguindo o protocolo na mão faz a geração de personalizado multiplexação gRNA vetores viáveis (Figura 1). Resultados representativos das abordagens STAgR usando seis fitas de gRNA diferentes são representados na Figura 2. Figura 2 A mostra um resultado típico de PCRs usado para obter as peças STAgR (protocolo de 3.1-3.3). Os seis amplicons (BB, S1-S5) representam lineares pedaços de DNA que contém as sequências individuais gRNA N20 em suas extremidades. A espinha dorsal do plasmídeo (BB) é agora alargada com as sequências alvos de gRNA1 e gRNA6 e, portanto, possui as sobreposições necessárias para dois outros PCRs (S1 e S5) para montagem de Gibson (Figura 2, tabela 3). Após a purificação pode ser alcançado um rendimento de DNA de pelo menos 1 µ g para vetores e inserções.
Após a montagem de Gibson, transformação bacteriana deve resultar em 100 a 700 colônias bacterianas. Figura 2 B mostra uma análise representativa de 10 colônias bacterianas através de colônia PCR, seguindo um protocolo STAgR com seis gavetas de gRNA. Eletroforese em gel indica que três clones mostram o tamanho esperado amplicon para assembly completo (tabela 2). Outros clones provavelmente recebido STAgR vetores contendo fitas de gRNA de um a cinco anos, Considerando que um clone (Figura 2B, no. 18) está vazio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg"> Figura 1 : Visão geral do projeto da primeira demão de STAgR. Primeiro número gRNA e andaimes são escolhidos, então gRNA e promotor e a última, qual tipo de vetor deve ser usado. Para cada gRNA, destina-se um primer específico para a frente com a gRNA segmentação sequência na orientação de sentido e a parte comum do "scf-FP" ou "sam-FP". Da mesma forma, para gerar o primer reverso individual a correspondente sequência de promotor (RP) é fundido com o complemento reverso da sequência do próximo gRNA N20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg"> Figura 2 : Resultados representativos das abordagens STAgR usando seis fitas de diferentes gRNA. (A) exemplo representativo de um PCR de cinco inserções, bem como o vetor STAgR_Tomato. (B) PCR de colônia de um 6 x STAgR reação usando promotores de hU6 e mU6 e gRNA canônica, bem como SAM andaimes. 22 colônias bacterianas foram analisadas, dos quais 7 mostrou a banda esperada indicando o conjunto completo. Escada: 1kb e números em pares de bases (bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Encaminhar a cartilha para String e o vetor</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer reverso para String e o vetor</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Sequências de Primer para andaimes gRNA e promotores.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tamanhos de promotores e andaimes.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK</td>
			<td>245 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>andaime de gRNA</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAMloop + gRNA do andaime</td>
			<td>143 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Teóricos tamanhos de cada gaveta de expressão para calcular o resultado PCR de colônia.
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 bp</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>3722 bp</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Tamanhos de promotores e andaimes.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+74 bp</td>
			<td>+ 67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>428 bp</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: Calculados tamanhos das peças STAgR após a PCR.

Aqui, apresentamos a sequência montagem gRNA clonagem (STAgR), um método facilmente multiplexar gRNA vetores para CRISPR/Cas9 aproxima-se. STAgR faz a multiplexação de gRNA simples, eficiente e personalizável.

Um protocolo personalizáveis para String Assembly gRNA clonagem (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

O sistema bacteriano CRISPR-Cas9 aumentou substancialmente as opções experimentais para os cientistas da vida. No entanto, várias abordagens CRISPR dependem da entrega simultânea de RNAs guia múltiplos em células individuais. A clonagem de gRNA de montagem de string permite a geração simples e rápida de vetores de expressão multiplex gRNA em uma única etapa de clonagem.Mas o STAgR não é apenas simples, como também é eficiente, barato e fácil de personalizar. Para começar, adicione as sequências de gRNA N20 aos primers de amplificação para a frente para a sequência de DNA STAgR como saliências. Adicione sequências de gRNA de sentido cinco primos ao primer dianteiro, primer para frente do andaime, para um andaime convencional, ou para o primer avançado SAM para um andaime contendo MS2.Em seguida, adicione as sequências de gRNA de complemento reverso N20 às sequências de primer reversa, escolhendo primers RP, dependendo dos promotores e strings específicos utilizados. Para começar a gerar os fragmentos de clonagem individuais para a Gibson Assembly, transfira 10 microliters do buffer de alta fidelidade para um tubo. Adicione um microliter de 10 dNTPs milimolares e 0,25 microlitros de ambos os 100 primers de saliência de micromolar.Adicione 10 nanogramas da sequência de modelos de DNA, ou vetor, e 1,5 microliters de DMSO. Adicione água suficiente para trazer o volume final para 49,5 microliters e, em seguida, adicione 0,5 microliters de polimerase HF. Incubar as reações em um termociclador, conforme descrito no protocolo de texto.Depois disso, pegue uma alíquota de 5,5 microliter da reação do PCR. Adicione corante de carregamento a todas as alíquotas e carregue-o em um gel de 1% de agarose. Carregue uma escada de DNA apropriada para dimensionamento, e execute o gel em um buffer de gel apropriado a 120 volts por 30 minutos.Enquanto o gel estiver em execução, adicione cinco microliters do buffer fornecidos com a enzima de restrição, e 0,5 microliters DpnI aos 44,5 microliters restantes de reação pcr vetorial para remover o modelo de plasmídeo residual usado durante o PCR. Incubar a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Verifique se as amplicons são do tamanho correto.Para iniciar a purificação do DNA, adicione 1,8 microliters de contas magnéticas por um microliter de produto PCR, e misture por tubulação para cima e para baixo. Incubar em temperatura ambiente por dois minutos. Usando um ímã, separe as contas em fragmentos de DNA do líquido residual.Enxágüe a pelota com 70% de etanol sem resusususá-la totalmente, para lavar as contas. Repita esta lavagem mais uma vez. Usando uma pipeta, retire todo o etanol e deixe o ar da pelota secar.Em seguida, adicione 15 a 20 microliters de água, e pipeta para cima e para baixo para misturar e dissolver a pelota. Use um ímã para separar as contas do líquido. Transfira o supernatante claro para um novo tubo.Depois disso, use um espectrômetro para determinar as concentrações de DNA. Primeiro, prepare o buffer de reação isotemal 5x conforme detalhado no protocolo de texto. Para o Gibson Assembly Master Mix, combine 320 microliters do tampão de reação isoterálmica de 5x com 697 microliters de água.Adicione 3 microliters de exonuclease T5, 20 microliters de polimerase de DNA, e 160 mciroliters de ligase de DNA Taq. Transfira 7,5 microliters da Mistura Mestre de Montagem para um tubo fresco. Em seguida, adicione 2,5 microliters de inserção no vetor, conforme descrito no protocolo de texto.Incubar as amostras a 50 graus Celsius por 45 a 60 minutos. Depois disso, armazene amostras no gelo, ou a 20 graus Celsius, para posterior transformação. Quando estiver pronto para transformar as bactérias, descongele as bactérias TOP10 E.Coli quimicamente competentes no gelo.Em seguida, adicione cinco microliters do Gibson Mix a 50 microliters de bactérias competentes, e misture suavemente o fundo do tubo. Incubar no gelo por 30 minutos. Coloque o tubo em um banho de água de 42 graus Celsius ou bloco de calor por 45 segundos para aquecer as bactérias.Então, coloque os tubos de volta no gelo. Adicione 250 microliters de soc médio à bactéria, e deixe-os se recuperar a 37 graus Celsius em uma incubadora de agitação por 30 a 45 minutos. Depois que as bactérias se recuperarem, coloque-as em placas de ágar de 1,5%LB que contenham 100 microgramas por ampicillina mililitro.Incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Para começar, prepare pelo menos dois conjuntos de tubos de reação PCR de 200 microliter para cada construção. Encha um dos conjuntos de tubos de reação com 100 microliters LB médio, contendo 100 microgramas por mililitro de ampicillina.Usando uma ponta de pipeta estéril, raspe o material biológico de uma colônia bacteriana, e espalhe-o no fundo de um tubo de reação PCR vazio de 200 microliter. Transfira imediatamente a ponta da pipeta para o segundo tubo de reação correspondente que contenha meio LB. Gire a ponta para garantir que algumas das bactérias sejam transferidas para a mídia LB.Incubar a 37 graus Celsius para uso posterior. Em seguida, prepare 10 microliters de PCR Master Mix por tubo de reação, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 10 microliters do PCR Master Mix aos tubos de reação PCR rotulados, sem a mídia LB.Usando um termociclador, incubar as reações conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, adicione corante de carga aos fragmentos amplificados e carregue-os em um gel de 1% de agarose. Carregue uma escada de DNA apropriada para dimensionamento, e execute o gel em um buffer de gel apropriado a 120 volts por 30 minutos.Calcule o tamanho teórico do amplicon somando os tamanhos individuais dos promotores usados, andaimes de gRNA e número de sequências N20. A partir dos resultados da colônia PCR, identifique os clones bacterianos, com base no tamanho correto da banda, e se eles provavelmente abrigarão vetores corretos. Usando a cultura correspondente de 100 microliter, inocular uma cultura LB de 2,5 mililitros durante a noite contendo 100 microgramas por ampicillina mililitro.Incubar a 37 graus Celsius por 12 horas. Em seguida, use um mini-kit de plasmídeo comercial para extrair o DNA plasmídeo, de acordo com as instruções do fabricante. Neste procedimento, a clonagem de gRNA de montagem de string é usada para gerar rapidamente plasmídeos de expressão de gRNA.Um resultado típico dos PCRs usados para obter as peças STAgR é visto aqui. Os seis amplicons representam peças de DNA lineares, cada uma contendo as sequências individuais de gRNA N20 em suas extremidades. A espinha dorsal plasmida é estendida com as sequências de segmentação de gRNA1 e gRNA6, e, portanto, possui as sobreposições necessárias a dois outros PCRs para Gibson Assembly.Após a purificação, um rendimento de DNA de pelo menos um micrograma para vetores e pastilhas pode ser alcançado. Após a Montagem Gibson, a transformação bacteriana resulta em 100 a 700 colônias bacterianas. A análise representativa de 22 colônias bacterianas, via COLÔNIA PCR seguindo um protocolo STAgR com seis gRNA, indica que sete clones mostram o tamanho de amplicon esperado para montagem completa.Os outros clones provavelmente receberam vetores STAgR, contendo uma a cinco fitas gRNA, enquanto um clone está completamente vazio. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucas horas. Realizado corretamente, permite a geração de uma infinidade de vetores de expressão multiplex gRNA em menos de uma semana de trabalho.Ao tentar este procedimento, é importante prestar atenção à atribuição correta e combinação de primers de saliência N20. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como criar seus próprios vetores de expressão de RNA guia multiplex.

a-customizable-protocol-for-string-assembly-grna-cloning-stagr

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este trabalho descreve um novo método para alvejar seletivamente organelas subcelulares nas plantas, analisadas usando o BioRad Gene Gun.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

A síntese de plasmídeos personalizados é trabalhosa e demorada. Este protocolo descreve o uso da clonagem de montagem Gibson para reduzir o trabalho e a duração do procedimento de clonagem de DNA personalizado. O protocolo descrito também produz construções de proteínas marcadas confiáveis para a expressão de mamíferos a um custo semelhante à clonagem tradicional de DNA de cortar e colar.

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

Usando o conjunto de DNA, vectores de múltiplos CRISPR podem ser construídos em paralelo numa única reacção de clonagem, tornando a construção de um grande número de vectores CRISPR uma tarefa simples. Tomate raízes peludas são um excelente sistema modelo para validar vetores CRISPR e gerar materiais mutantes.

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A proteína Cpf1 associada ao CRISPR pode ser guiada por um ARN CRISPR especialmente concebido (crRAR) para escindir o DNA de cadeia dupla nos locais desejados, gerando extremidades pegajosas. Com base nessa característica, foi estabelecido um padrão de montagem de DNA (C-Brick), e um protocolo que detalha seu uso é descrito aqui.

Protocolos para Montagem Padrão de DNA C-Brick Usando Cpf1

Métodos para a geração de bibliotecas gRNA em larga escala devem ser simples, eficiente e econômica. Descreveremos um protocolo para a produção de bibliotecas de gRNA baseado na digestão enzimática de ADN alvo. Este método, CORALINA (geração de biblioteca gRNA abrangente através da actividade nuclease controlada) apresenta uma alternativa para síntese do oligonucleotide personalizado dispendiosos.

Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

Aqui, um simples, eficiente e cost-effective método de clonagem de sgRNA é descrito.

Guia de Clonagem de RNA para Sistemas de Mamíferos por CRISPR

Clonamos e analisamos genes de repórteres gerando RNAs circulares. Esses genes de repórter são maiores do que construções para analisar emendas lineares e conter elementos Alu. Para investigar os RNAs circulares, os construtos são transfeccionados em células e o RNA resultante é analisado usando RT-PCR após a remoção do RNA linear.

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

O objetivo deste protocolo é fornecer um guia detalhado passo a passo para a montagem de construções multigênicas usando o sistema de clonagem modular baseado na clonagem golden gate. Ele também dá recomendações sobre etapas críticas para garantir a montagem ideal com base em nossas experiências.

Montagem rápida de construções multigênicas usando clonagem modular de golden gate

Um módulo de clonagem molecular adaptável da Gibson Assembly foi empregado em um formato de experiência de pesquisa de graduação (CURE) baseado em curso para alunos do curso de laboratório de biologia molecular. A avaliação dos resultados de aprendizagem dos alunos mostrou melhor compreensão e confiança na clonagem molecular após a conclusão do CURE, e novos plasmídeos foram clonados para pesquisa de biossíntese de produtos naturais.

Melhorando os resultados dos alunos com uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso de clonagem molecular adaptável

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo demonstrando como a Clonagem Modular (MoClo) pode ser adaptada para a clonagem de operons policistrônicos.

Montagem modular padronizada de operons policistrônicos com clonagem modular (MoClo) usando o kit de ferramentas In-Cloning

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Um protocolo personalizáveis para String Assembly gRNA clonagem (STAgR)

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