Estabelecimento e análise do Tumor fatia Explants como um pré-requisito para o teste de diagnóstico

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em pesquisas pré-clínicas, onde estudos de resposta a medicamentos em explants de fatias de tumores podem servir para fins diagnósticos. A principal vantagem dessa técnica é que as explanações de fatias podem por uma pequena janela de tempo modelar a biologia complexa dos tecidos nativos, incluindo funções espacialmente distribuídas. Embora este método possa fornecer informações sobre o uso de fatias de tumores pulmonares murinos, ele também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos, incluindo tecidos humanos.

Para começar, prepare o vibratome e realize um VibraCheck de acordo com as instruções fornecidas no manual. Em seguida, encha cada poço da placa de 24 poços com um mililitro da solução de sal balanceado hank-s complementada com penicilina e estreptomicina e mantenha a placa no gelo. Insira agulhas de calibre 25 nas quatro patas de um rato eutanizado colocado em uma tampa de isopor para que o peito seja exposto e o animal seja esticado.

Pulverizar 70% de álcool na superfície da pele exposta. Use uma tesoura colocada em posição angulada para cortar a pele do abdômen em direção ao peito e até a região do pescoço. Estique a pele de ambos os lados usando fórceps e insira agulhas de calibre 25.

Abra a região abdominal. Em seguida, abra a caixa torácica e o diafragma para expor o pulmão e o coração. Exponha a traqueia cortando o tecido circundante.

Dissecar os pulmões, junto com o coração. Coloque os tecidos em um tubo de 50 mililitros contendo 30 mililitros de HBSS gelado suplementado com Pen-Strep colocado no gelo e prossiga para o próximo passo o mais rápido possível. Agora transfira os pulmões portadores de tumores para uma placa de cultura tecidual de 10 centímetros.

Use tesouras estéreis e fórceps para separar os lóbulos pulmonares e selecionar lóbulos com tumores na superfície para cortar. Coloque um lobo pulmonar com um tecido tumoral em um pedaço de papel filtro para evitar escorregar e cortar parte do pulmão normal ou tecido tumoral adicional que envolve o tumor usando um bisturi estéril para gerar uma superfície de peça de tecido plano. Mergulhe o lado plano em uma gota de adesivo de cianoacrilato e monte-o no suporte da amostra de vibratome para que o tumor fique de frente para a lâmina em uma posição vertical, e deixe secar por dois a três minutos.

Coloque o suporte da amostra vibratome na bandeja de tampão de metal. Encha a bandeja com HBSS frio suplementado com Pen-Strep até que o tecido esteja imerso no tampão. Cubra a bandeja de tampão com a tampa plexiglas que é fornecida com o instrumento e coloque a bandeja em um banho de gelo branco e adicione gelo para manter o tecido frio durante o corte.

Coloque o banho de gelo branco no vibratome. Em seguida, selecione as configurações de corte adequadas e comece a cortar. Leve a lâmina vibratome para a posição de corte e ajuste a janela de corte.

Use fórceps estéreis para coletar as fatias em uma placa de 24 poços cheias de um mililitro de HBSS suplementado com Pen-Strep por poço e manter no gelo. Enquanto acompanha a ordem de corte, marque cada poço da placa de 24 poços de acordo com o plano experimental. Colete uma fatia de tecido adjacente às fatias cultivadas como uma referência zero horas ou não cultivada.

Colete pelo menos três fatias de referência para representar a parte superior, central e inferior do tecido. E uma vez que o corte é concluído, continue com a fixação e processamento. Depois disso, prepare uma placa de seis poços contendo 2,5 mililitros de cultura média por poço colocando grades de titânio nele.

Certifique-se de que não se formem bolhas de ar entre a rede de titânio e o meio. Para carregar uma fatia na grade mantenha a placa de seis poços em uma posição angular para que uma parte do meio cubra a grade. Em seguida, coloque a fatia no meio na grade e use fórceps para espalhá-la.

Após colocar as fatias, carregue as placas de seis poços na unidade de incubação rotativa colocada dentro de uma incubadora umidificada mantida a 37 graus Celsius com 95%02 e 5%CO2. Inicie o ciclo de rotação. Para o cultivo de longo prazo reabastecer o meio de cultura todos os dias usando fórceps estéreis para levantar a grade contendo as fatias de tecido e colocá-la em um poço vazio da placa de seis poços.

Substitua 70% do meio por meio de cultura fresca e coloque a grade de volta. Continue o ciclo de rotação como anteriormente. Para o tratamento medicamentoso nas fatias tumorais adicione 2,5 mililitros de mídia com a droga diluída ou controle do veículo na placa de seis poços.

Coloque as grades de titânio nos poços e, em seguida, coloque as fatias nas grades como feito anteriormente. Após a realização dos tratamentos por 24 horas, continue com a fixação e o processamento. Para começar a fixar a fatia desejada transfira-a cuidadosamente usando fórceps em uma placa de 10 centímetros contendo um papel de filtro encharcado cheio com PBS de dois a três mililitros e deixe-o flutuar.

Em seguida, levante o papel filtro com um par de fórceps e coloque-o em um histo. Transfira o papel do filtro para uma fita histo. Adicione uma gota de hematoxilina diluída em cima da fatia de tecido para marcar a posição da fatia para os passos subsequentes.

Feche o e transfira-o para uma solução de formalina tamponada 4% neutra e deixe durante a noite a quatro graus Celsius. Após a lavagem e processamento do, conforme descrito no protocolo, abra o histo e use um bisturi para levantar cuidadosamente a fatia fixa do papel filtro. Descarte o papel do filtro e transfira a fatia em um molde contendo parafina líquida.

Use um peso plano para pressionar o tecido contra a parte inferior do molde de incorporação para garantir a secção uniforme. Coloque a parte inferior do histo em cima do molde. Adicione parafina líquida em cima dela.

E deixe o molde esfriar em uma placa fria por 30 minutos. Depois disso, separe o molde resfriado do bloco de parafina. Use um microtoma para preparar seções finas de quatro micrômetros dos blocos de fatia de tecido FFPE.

Corte o excesso de parafina ao redor do tecido. Para obter seções uniformes ao longo do tecido ajuste o ângulo do bloco para que a superfície do bloco seja orientada horizontalmente em relação à lâmina. Utilizando uma escova fina coletar sequenciais sequenciais sequenciais seções da fatia de tecido embutido na parafina, começando na parte superior das lâminas de vidro.

Continue coletando as seções das camadas de tecido mais profundas para o meio, seguido pela parte inferior das lâminas de vidro. A coleta de seções de diferentes camadas de cada fatia de tecido aos slides do objeto é feita para permitir a captura de gradientes potenciais induzidos pela cultura em viabilidade, migração celular ou expressão biomarcadora. Após a coleta das seções continuam com seu processamento e análises posteriores, conforme descrito no protocolo.

A espessura da fatia de tecido pode influenciar a viabilidade de fatias cultivadas. Neste caso, fatias de 250 micrômetros de espessura mostram aumento dos gradientes de necrose em comparação com fatias de 200 micrômetros de espessura devido a fatias mais grossas se tornando propensas a deficiências de oxigênio ou difusão de nutrientes nas fatias. No entanto, fatias finas de 160 micrômetros contêm grandes áreas necróticas provavelmente causadas pelo manuseio técnico durante o posicionamento das fatias, pois estas são frágeis e tendem a enrolar.

A análise do NKX2-1, um marcador de adenocarcinoma pulmonar bem diferenciado, mostra que sua expressão não é significativamente alterada em fatias cultivadas em comparação com zero hora de fatias não cultivadas. A análise quantitativa da expressão NKX2-1 confirmou ainda que a expressão não foi significativamente alterada em fatias cultivadas versus não cultivadas, sugerindo que o processo de cultivo não afeta visivelmente o status de diferenciação do tecido adenocarcinoma. Para testar se as fatias de tecido tumoral podem ser usadas para avaliar a eficácia de medicamentos-alvo, foram tratadas com DMSO ou quantidades tituladas de compostos.

Quando tratado com um dactolisib micromolar que tem como alvo a fosforilação da via mTOR de 4EBP1 foi inibida. 0,5 micromolar selumetinib que tem como alvo a via quinase MAP foi eficaz na inibição da fosforilação de ERK1/2. Depois de assistir a este vídeo você deve ter uma boa compreensão de como trabalhar e analisar criticamente fatias recém-cortadas de tecidos tumorais preciosos.

Nossa ex-pós-doutora, Katja Narhi, contribuiu significativamente para o estabelecimento desse método em colaboração com colegas da Plataforma de Fatia de Tecido do Consórcio Predect IMI.