Name: Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a analisar redes de actomiosina em células epiteliais individuais e tecidos curvos usando Fiji. Este protocolo acessível não requer conhecimento de programação e é ideal para pesquisadores iniciantes em biologia celular.

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Os autores são muito gratos a Miriam Osterfield por compartilhar seu Conselho sobre a vida in vitro de imagens de câmaras de ovo usando uma abordagem adotada a partir do laboratório Celeste Berg4. Agradecemos também a Sebastian Tosi pelo roteiro de Fiji que permite a segmentação de células.

<ol><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).</li>
<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li>
<li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li>
<li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers%3A+A+History+and+Adaptable+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%2C+Volume+1%22">The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li>
<li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044(2013).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li>
<li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511(2014).</li>
<li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li>
<li>Haase, R. Surface manager. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018).</li>
<li>Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018).</li>
<li>Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017).</li>
<li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigDataViewer%3A+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li>
<li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li>
<li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cartography%3A+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li>
<li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Etapas críticas e solução de problemas para a dissecação e cultivo de câmaras de ovo
Se muitas moscas são colocadas em um pequeno frasco, o alimento mosca pode virar lamacento após 2 – 3 dias devido a grandes quantidades de larvas de alimentação e moscas adultas ficando presos no alimento mosca. Nesse caso, vire o resto dessas moscas em um novo frasco com alimentos frescos e reduzir seu número. Em particular, excluir as fêmeas que estavam presas na comida.
<p class="jove_c...

O desenvolvimento contínuo de novas tecnologias de imagem e software com aplicações nas ciências da vida tem proporcionado um enorme impacto na compreensão dos princípios básicos da vida. Um dos principais desafios é a visualização confiável dos processos de desenvolvimento em combinação com sua imagem ao vivo em vários tecidos. Os tecidos são partes de órgãos e corpos e, como tal, a maioria não são facilmente acessíveis para a imagem. Portanto, protocolos que permitam sua dissecção e cultivo in vitro foram desenvolvidos para Visualizar eventos biológicos que refletem suficientemente a situação in vivo dentro de um corpo vivo.
Ao longo das últimas décadas, a cultura e a imagem ao vivo de câmaras de ovos de Drosophila , estruturas acinares semelhantes a órgãos primitivos, contribuiu imensamente para a compreensão dos princípios básicos do desenvolvimento de órgãos primitivos1 , 2. º , 3. atualmente, existem vários protocolos de cultivo disponíveis, e seu uso depende do tempo de aquisição, tipo de célula a ser imaged, e sua acessibilidade (por exemplo, germline interior vs. linha somática externa)4.
Uma característica comum em todos estes protocolos de cultivo é a necessidade para a imobilização de câmaras de ovo analisadas que exibem uma atividade contrátil elevada nos meios líquidos. A atividade contrátil das câmaras de ovos é causada principalmente pela folha muscular que abrange uma longa seqüência de câmaras de ovo conectadas5,6,7. Portanto, para conseguir a imobilização adequada das câmaras de ovo jovens, várias abordagens foram desenvolvidas, envolvendo a cobertura de câmaras de ovo com coberturas6,8,9 ou cobertores flexíveis4, 10 ou encaixá-los em agarose de ponto de fusão baixa3,11. Estas aproximações são populares porque igualmente permitem a imagem latente de um plano Visual maior devido ao aplainamento subtil da superfície circunferencial das câmaras de ovo.
Entretanto, recentemente, mostrou-se que as câmaras de ovo novas (estágio 1-8) giram em torno de seu eixo anterior-posterior6 e que este movimento do tecido está alimentado por uma rede fina do actomiosina perto da superfície circunferencial destas câmaras de ovo novas 12. portanto, a alteração artificial da superfície celular causada por um achatamento sutil deste tecido pode ter um impacto negativo sobre o comportamento da maquinaria de actomiosina geradora de força. O contraponto é que se o tecido da câmara do ovo não é aplainado, a imagem latente microscópica das proteínas na superfície circunferencial de câmaras de ovo torna-se ainda mais limitada pelo tamanho diminuído do plano da aquisição.
Por isso, combinámos protocolos de Prasad et al.9 e o laboratório de Celeste Berg4,10 e modificou-os ainda mais para que não se utilizava lamínula/manta flexível/agarose no método desenvolvido. As câmaras do ovo de Drosophila são cultivadas livremente nos meios e o protocolo apresentado aqui aplica-se somente a microscopia invertida. Há duas partes no protocolo. A primeira parte é focada na análise de sinais de actomiosina na escala celular local (até 15 células) dentro das câmaras de ovo. Na segunda parte, focamos em superar as limitações associadas a um pequeno plano de aquisição causado pela livre cultivo de câmaras de ovos. A este respeito, desenvolvemos um novo método computacional baseado em Fiji com uma interface de usuário gráfica semiinterativa que extrai e desdobra seletivamente camadas definidas de uma superfície circunferencial do tecido. Isso é seguido por um protocolo que descreve como analisar a actomiosina na escala tecidual (i.e., > 50 células). Como a extração seletiva de uma camada fina definida de tecidos epiteliais curvados não foi facilmente possível usando uma projeção de pilha z clássica (Figura 1), este método Easy-to-use serve como um pré-requisito importante para compreender compreensivamente o comportamento de uma rede de actomiosina fina (< 1 μm) na escala tecidual em câmaras de ovos de Drosophila .
Além disso, para facilitar o protocolo, fornecemos exemplos de filmes de lapso de tempo (TLMs) e arquivos de amostra de comportamento de myosin II convencional sem músculo fluorescentamente marcados (ver arquivo complementar 3). Myosin II é uma proteína do motor e representa a parte contrátil ativa da maquinaria do actomiosina. Para a imagem de myosin II, utilizamos linhas de Drosophila transgênicas que contêm uma cadeia leve regulatória modificada de miosina II denominada mrlc:: GFP (ver tabela de materiais para detalhes)12,13. A fim de visualizar as membranas celulares, o protocolo é baseado em corantes comerciais (ver tabela de materiais). Este protocolo é apropriado não somente para a análise de mrlc subcellular pequeno:: sinais de GFP12 mas também para todas as partículas subcellular de tamanho semelhante em torno de ± 300 μm, tais como aquelas observadas com vida-ato:: GFP12,14.
Embora ambos estes protocolos sejam apresentados usando in vitro as câmaras de ovo cultivadas da Drosophila , a aquisição de sinais do actomiosina podem igualmente ser executadas usando outros tecidos em cima da optimização dos meios cultivando e dependendo da disponibilidade de proteínas com marcas fluorescentamente marcadas com corantes comerciais correspondentes ou, por exemplo, microinjeções de mRNA para obter perfis transitórios de expressão gênica. Similarmente, o protocolo Fiji-baseado para a extração de uma camada fina de uma superfície circunferencial pode ser aplicado mais geralmente aos elipsóide e órgão-como tecidos.

<table><tbody><tr><td>Schneider Medium</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td>[+]-Glutamina</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;[ +] 10.000 Unidades/mL Penicilina [+] 10.000 &micro; g/mL de Estreptomicina</td></tr><tr><td>Fetal Bovino Serum</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; Solução de</td> Insulina <td>Inativada por Calor</td>F135</tr><tr><td>Human</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; I9278</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon de 50 mL</td> Filtro <td>estéril</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV</td><td>Millipore</td><td>SLGV033NS</td><td>33 mm</td></tr><tr><td>Pratos de micropoços com fundo de vidro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Placa de Petri de 35 mm, Micropoço de 14 mm, vidro de cobertura nº 1.5</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>A. Dumont & Fils</td><td></td><td>&nbsp;#55</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red (corante de membrana celular)</td><td>Invitrogen</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64 (corante de membrana celular)</td><td>ThermoFisher/Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de dissecção de depressão</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-560B</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento microscópico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steromicroscope</td><td>por exemplo, Zeiss</td><td></td><td>Stemi SV 6</td></tr><tr><td>Microscópio confocal invertido</td><td>, por exemplo, Zeiss/Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de disco giratório</td><td>, por exemplo, Zeiss/Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vidro microscópico/vidro de cobertura</td><td>, por exemplo, Thermo Scientific/Menzel Glas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cactus tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wironit porta-agulhas</td><td>Hammacher</td><td>9160020</td><td></td></tr><tr><td>Espinha de cacto</td><td>Echinocactus grusonii / cacto</td><td></td><td></td> de barril</tr> <tr><td>Drosophila estoques usados no manuscrito</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AX3 / AX3; sqh-MRLC :: GFP / sqh-MRLC :: GFP</td><td></td><td></td><td>Para obter detalhes, consulte Rauzi et al.: Os fluxos contráteis de actomiosina polarizada planar controlam a remodelação da junção epitelial. Natureza 2010, Vol. 468, pág. 1110-1115.</td></tr><tr><td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C</td><td></td><td></td><td>Para detalhes, consulte Viktorinova et al.: A rotação epitelial é precedida pela quebra da simetria planar da actomiosina e protege o tecido epitelial das deformações celulares. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Edição 11, pág. e1007107.</td></tr></tbody></table>

análise da dinâmica da actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de drosophila cultivadas

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Os ovos imaturos da Drosophila são chamados de câmaras de ovos, e sua estrutura se assemelha a órgãos primitivos que sofrem alterações morfológicas de uma rodada a uma forma elipsóide durante o desenvolvimento. Esse processo de desenvolvimento é chamado de oogênese e é crucial para gerar ovos maduros funcionais para garantir a próxima geração de moscas. Por estas razões, as câmaras de ovo serviram como um modelo ideal e relevante para compreender o desenvolvimento de órgãos animais.
Diversos protocolos in vitro da cultura foram desenvolvidos, mas há diversas desvantagens a estes protocolos. Um envolve a aplicação de várias coberturas que exercem uma pressão artificial nas câmaras de ovos imaged, a fim de imobilizá-los e aumentar o plano de aquisição imaged da superfície circunferencial das câmaras de ovos analisadas. Essa abordagem pode influenciar negativamente o comportamento da maquinaria de actomiosina fina que gera o poder de girar as câmaras de ovo em torno de seu eixo mais longo.
Assim, para superar esta limitação, nós cultura câmaras de ovo de Drosophila livremente na mídia, a fim de analisar de forma confiável a maquinaria de actomiosina ao longo da circunferência das câmaras de ovo. Na primeira parte do protocolo, fornecemos um manual detalhando como analisar a maquinaria de actomiosina em um plano de aquisição limitado na escala celular local (até 15 células). Na segunda parte do protocolo, fornecemos aos usuários um novo plugin baseado em Fiji que permite a extração simples de uma camada fina definida da superfície circunferencial das câmaras de ovos. O seguinte protocolo descreve então como analisar sinais da actomiosina na escala do tecido (> 50 pilhas). Finalmente, nós apontemos as limitações destas aproximações nas escalas locais do celular e do tecido e discutimos seu desenvolvimento futuro potencial e aplicações possíveis.

Este protocolo permite que os cientistas investiguem o comportamento das redes de actomiosina nos tecidos epiteliais. Isso só é possível quando uma análise detalhada do comportamento da actomiosina na escala celular local (algumas células) é combinada com uma análise semelhante na escala tecidual (muitas células). No entanto, os tecidos epiteliais são frequentemente curvados e a extração de uma fina camada desses tecidos não foi antes facilmente possível, como mostrado nas câmaras de ovos...

Este protocolo fornece uma metodologia Fiji-baseada, user-friendly junto com instruções diretas que explicam como analisar confiantemente o comportamento do actomiosina em pilhas individuais e em tecidos epithelial curvados. Nenhuma habilidade de programação é necessária para seguir o tutorial; todas as etapas são executadas de forma semiinterativa usando a interface gráfica do usuário de Fiji e plugins associados.

Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Nosso protocolo ajuda os cientistas a analisar a rede de actomiose subcelular em células epiteliais individuais e também permite que eles realizem análises semelhantes em escala multicelular em tecidos epiteliais curvos. Nosso protocolo é um bom exemplo de uma aplicação Fiji. Ele tem uma interface de usuário gráfica intuitiva, e não requer nenhum conhecimento de scripting.Portanto, é altamente adequado também para usuários iniciantes no campo. Embora nosso método tenha sido desenvolvido para câmaras de óvulos Drosophila, também é aplicável fora da epitélia de Drosophila. Encorajamos os cientistas a testar nosso protocolo em seus sistemas de modelos.Use os arquivos de teste acompanhados para se familiarizar com este protocolo. Ele vai ajudá-lo a decidir qual parte deste protocolo é adequado para sua pergunta de pesquisa individual. Esta parte do protocolo permite que os usuários segmentem células epiteliais em filmes com lapso de tempo e, posteriormente, analisem pulsos de actomiosina em células individuais ao longo do tempo usando o Surface Manager.Para começar, abra Fiji e importe o macro TissueCellSegmentMovie. ijm como descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, abra um arquivo TIFF corrigido por alvejante e divida os canais do arquivo corrigido pelo alvejante indo até a barra de menu, selecionando Imagem, seguido por Color e selecionando Canais Split.Execute o script carregado no canal de membrana celular ativa do filme de lapso de tempo selecionado pressionando o ícone Executar no script aberto. Para obter uma máscara celular agradável, ajuste o borrão gaussiano para 2.500 e a sensibilidade de detecção de células para menos um, e clique em OK. Em seguida, defina a tolerância de ruído estimada entre 10 e 20 para filmes de lapso de tempo adquiridos com o objetivo de 63x, e clique em OK. Uma máscara de célula gerada aparece no filme de lapso de tempo analisado, uma nova janela chamada ParticleStack aparece, e uma pequena janela chamada Action Required também aparece. A partir da máscara celular no filme time-lapse, concentre-se apenas nas células no centro e selecione aquelas que podem fornecer contornos completos e bem definidos ao longo do filme time-lapse.Quando as células selecionadas no centro correspondem bem às membranas celulares reais, salve particleStack como um arquivo TIFF. Abra o arquivo TIFF particleSack correspondente em Fiji. Com o plugin Surface Manager instalado em Fiji, abra o plugin.No Surface Manager, clique no botão De imagem de contorno de leitura e defina o índice Jaccard para 60% Carregar os contornos pode levar vários minutos dependendo do número de células. Uma vez carregada, cada célula receberá um número S e aparecerá na parte esquerda da janela Surface Manager. Clique no número S selecionado para que o esboço da célula importada de ParticleStack1.Tiff aparece no filme time-lapse. Verifique cada número S importado para obter qualidade de contorno celular durante todo o filme e remova células indesejadas que exibem contornos celulares incorretos. Para remover uma célula indesejada, destaque o contorno da célula e clique no botão Excluir.Use a ferramenta Pincel para corrigir contornos celulares. Quando terminar, salve as células corrigidas como um RoiSet. arquivo zip.Para identificar se os pulsos de actomyosina estão presentes no tecido analisado e entender o comportamento detalhado, bem como a direcionalidade dos sinais de actomyosina, começam pela abertura de Fiji. Abra um filme de lapso de tempo, carregue o ParticleStack1 salvo. máscara de célula de tiff e o filme de lapso de tempo corrigido por alvejante, em seguida, carregar o plugin Surface Manager e a região correspondente de interesse do RoiSet.arquivo zip. Em seguida, no Surface Manager, ative um canal com sinais de interesse. Clique no botão Estatísticas para obter a janela chamada Valor cinza médio Fatia por Fatia.As intensidades médias e medianas dos sinais de actomiose serão exibidas ao longo do tempo em unidades arbitrárias, bem como outros parâmetros relacionados à área e forma da célula. Salve os valores como um arquivo de planilha indo para a janela Estatísticas, clicando em Arquivo e selecionando Salvar As.Da mesma forma, gerar uma máscara celular e carregá-lo no Surface Manager, a fim de analisar pulsos de actomyosina na escala de tecido. Esta parte do protocolo permite que os usuários extraam seletivamente uma fina camada de actomiosina no tecido epitelial curvo ao longo do tempo.Essas etapas são fáceis de usar e baseadas em uma interface gráfica intuitiva. Abra Fiji e certifique-se de que o plugin Ellipsoid Surface Projection esteja instalado. Em seguida, abra uma foto de lapso de tempo e exporte-a como um arquivo XML/HDF5 clicando em Plugins, indo para o BigDataViewer e selecionando Export Current Image como arquivo XML/HDF5.Em seguida, abra o arquivo exportado no Ellipsoid Surface Projection indo para Plugins, clicando no BigDataViewer, seguido por Ellipsoid Surface Projection e selecionando arquivo XML. Isso abrirá uma nova janela com vistas sagidoras da câmara de ovos, e um diálogo para orientar o usuário através do processamento aparecerá. A janela de diálogo, chamada Projeção de Ovários, tem várias abas.Na primeira guia de diálogo, chamada de caixa de delimitamento, defina as bordas x e y de uma câmara de ovo no filme de lapso de tempo juntamente com a largura z da caixa de delimitação e pressione o conjunto. As partes selecionadas da câmara de ovos são destacadas em rosa. Em seguida, defina o tamanho das bolhas de sinal na guia de diálogo chamada encontrar bolhas na janela projeção dos ovários.Defina o sigma e o valor mínimo de pico. Em seguida, pressione a computação para identificar os sinais de actomiose, que aparecerão como bolhas verdes. Tente novamente esta etapa com diferentes parâmetros até que cerca de 100 pontos sejam encontrados.Identificar os sinais de actomiose é um passo crucial. Depende da qualidade do sinal e do tamanho correto das bolhas detectadas. Se não houver manchas verdes visíveis na imagem, então o próximo passo não funcionará.Para projetar o elipsoide, continue com a aba chamada fit ellipsoid. Defina amostras aleatórias para 10.000, a distância de corte externa/interna para um a 10 e, em seguida, clique em calcular. Depois disso, a guia chamada projeção será aberta automaticamente e permite a definição da extração da superfície.Na guia de projeção, configure uma distância mínima e máxima de projeção como a largura do elipsoide desejado. A distância mínima e máxima de projeção deve caber para que a região elipsoide definida rosa inclua toda a camada externa da câmara de ovos. Em seguida, defina a distância da fatia como uma só.Certifique-se de que a região rosa do elipsoide com o definido com na câmara de ovo é visível antes de pressionar a computação. Ajuda a avaliar a qualidade de um novo elipsoide. Em seguida, defina uma largura de saída do elipsoide para maior ou igual a 800 e uma altura maior ou igual a 400.Em seguida, defina a duração da extração da superfície e escolha uma projeção esférica ou cilíndrica. Se necessário, vire Z e alinhe a computação Y.Press para obter uma extração de superfície para ambos os canais em novas janelas chamadas imagem. Ajuste o brilho e o contraste das janelas de imagem obtidas para poder ver os sinais de actomyosina projetados clicando em Imagem, indo ajustar e selecionando Brilho/Contraste.Se a extração de superfície parecer boa, salve ambos os canais separadamente como arquivos TIFF. Além disso, salve o arquivo da janela Log para referência futura sobre como a superfície desta câmara de ovo em particular foi extraída. Em seguida, mescle os canais com um código de cor preferido em Fiji e salve os resultados como arquivos TIFF.Este protocolo permite que os cientistas investiguem o comportamento das redes de actomiose em tecidos epiteliais. Isso só é possível quando uma análise detalhada do comportamento da actomyosina na escala celular local é combinada com uma análise semelhante na escala tecidual. Aqui são mostrados exemplos representativos do comportamento dinâmico da minosina II na escala celular local e na escala de tecido para controle e fat2 mutante câmaras de ovos Drosophila.No plano único basal, a cadeia de luz regulatória modificada verde dos sinais de miosina II movem-se perpendiculares para o eixo anterior-posterior das câmaras de ovos de controle. Esta polaridade é perdida em câmaras de ovos mutantes fat2 e leva a pulsos de miosina anisotropic II, oscilações No nível tecidual, a cadeia de luz regulatória modificada verde da minosina II na amostra de controle gera a força sincronizada necessária para promover a rotação epitelial. Em contraste, o epitélio folículo de uma câmara de ovo mutante fat2 pulsa fortemente no lado basal e não consegue gerar a força sincronizada necessária para promover a rotação epitelial.Em uma região apical fina da câmara de ovos Drosophila, o mutante fat2 também apresenta o comportamento dinâmico alterado da cadeia de luz regulatória modificada verde da minosina II.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como analisar uma rede de actomiose na escala local e tecidual em câmaras de ovos Drosophila usando Fiji. Para mais dicas práticas e solução de problemas, consulte a parte de discussão após o protocolo. Se você tiver alguma dúvida relacionada a Fiji ou nossos plugins, consulte as respectivas páginas da Web ou entre em contato conosco.

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Biologia do Desenvolvimento

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A Mecânica das Redes de Actomiosinas (Poro-)Contráteis Elásticas como Sistema Modelo do Citoesqueleto Celular

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Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Aprenda a analisar redes de actomiosina em células epiteliais individuais e tecidos curvos usando Fiji. Este protocolo acessível não requer conhecimento de programação e é ideal para pesquisadores iniciantes em biologia celular.

Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas (Vídeo) | JoVE Journal

Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

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