8,386 Views
•
00:10 min
•
September 11, 2019
DOI:
O objetivo geral do protocolo é gerar um modelo de camundongo humanizado com sistema imunológico humano funcional e fígado usando células-tronco hematopoiéticas humanas e sítio hepato. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave em camundongos humanizados do fígado genético. Este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar a imunopatologia causada pelo HIV, como observado nas pessoas.
A demonstração do processo será de Yimin Sun, supervisor do departamento de patologia e microbiologia, juntamente com Weimin Wang e Edwrd Makarov, tecnólogo de pesquisa. Para começar, transfira o sangue do cordão umbilical coletado em tubos heparinizados para um armário de fluxo laminar estéril. Adicione PBS até que o volume seja aumentado para 35 mililitros.
Coloque a amostra em cima do meio de separação do linfócito e centrífuga 400 vezes G e a quatro graus celsius por 35 minutos sem quebras. Em seguida, remova cuidadosamente a camada de plasma superior e use uma pipeta de transferência para transferir a interface do casaco branco para um novo tubo. Suspenda o casaco de polimento em 30 a 40 mililitros de tampão gelado.
Usando uma pipeta, combine 20 microliters da suspensão celular com 20 microliters de 0,4% de tripano azul. Pipeta 10 microliters desta mistura na abertura externa de qualquer uma das duas câmaras de um slide de contagem, e inserir o slide em um contador automatizado de células para contar as células. Centrifugar as células a 300 vezes G e a 4 graus celsius por 10 minutos.
Aspire cuidadosamente o supernascer e adicione 300 microliters de tampão frio de gelo. Adicione 100 microliters de reagente de bloqueio de receptor FC humano e 100 microliters de anticorpos anti-humanos cd34 conjugados de camundongos monoclonais microesferas para até 100 milhões de células. Incubar por 30 minutos a quatro graus celsius.
Adicione 10 mililitros de tampão gelado para lavar as células e centrífugas 300 vezes G e quatro graus celsius por 10 minutos. Remova cuidadosamente o supernascer e suspenda a pelota em 500 microliters de tampão gelado. Depois disso, coloque uma coluna LS de seleção positiva no campo de triagem celular ativada magnética e passe-a com três mililitros de tampão gelado.
Carregue a amostra na coluna LS que pode prender microesferas ligadas a células positivas CD34 humanas em amostras, e permitir que ela flua sob a influência da gravidade para o tubo de coleta. Lave a coluna três vezes com tampão gelado e colete o eluent no mesmo tubo de coleta. Em seguida, mergulhe a coluna com cinco mililitros de tampão gelado para aludir as células positivas cd34 em um novo tubo de coleta.
Repita o procedimento para alcançar uma pureza de mais de 90%, use corante azul trypan e um hemócitometro para contar as células positivas CD34 iludidas. Após a contagem, centrifugar as células a 300 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernascer e suspenda as células em 125 microliters de PBS para uma injeção a ser usada imediatamente no transplante.
Para verificar a pureza do eluente positivo CD34, pegue 50 microliters da suspensão e incuba-o com 10 microliters de anticorpo CD34 conjugado de PE a quatro graus celsius por 30 minutos. Depois disso, lave e suspenda as células em PBS e prossiga para realizar a citometria de fluxo. Após a aquisição, analise os dados conforme descrito no protocolo de texto.
Primeiro, recuperar e descongelar os hepatócitos criopreservados, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, remova a tampa biológica e despeje os hepatócitos descongelados em um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio de descongelamento aquecido. Balance o tubo à mão por alguns segundos para suspender as células.
Pelota as células a 100 vezes G e à temperatura ambiente por oito minutos. Lave as células pelleted em PBS com 0,1%BSA e lavonha-as com HSPCs frescos ou descongelados em PBS a um volume final de 80 microliters por mouse. Primeiro, conecte uma extremidade de um tubo de extensão estéril a uma agulha calibre 30 e a outra extremidade a uma seringa de um mililitro.
Encha a seringa com a suspensão de HEPs agrupados e HSPCs. Coloque a seringa no entalhe de uma pipeta de distribuição repetitiva e ajuste o dispensador para dispensar 10 microliters em cada prensa. Raspe cada rato como descrito no protocolo de texto e esfregue o lado esquerdo do corpo de cada rato com iodo de 10% povidone seguido de álcool isopropílico de 70%.
Utilizando tesouras do tipo Vannas, faça uma pequena incisão na pele, músculo e peritônio à esquerda da parede peritônio para entrar na cavidade peritoneal aproximadamente 5 milímetros abaixo da borda inferior da caixa torácica. Localize o baço e use fórceps para puxá-lo ligeiramente para a área de operação para fácil acesso e inserir a agulha de calibre 30 no polo inferior do baço. Em seguida, desbloqueie o êmbolo da pipeta de distribuição e dispense 10 microliters do volume por vez, com um limite de 60 a 80 microliters por baço.
Retraia a agulha lentamente e corte o baço com clipes ligantes usando um aplicador de ligadura. Em seguida, use aplicadores de ponta de algodão molhados com PBS estéril para empurrar o baço de volta para a cavidade corporal. Use um padrão de sutura interrompido para fechar a camada muscular da parede abdominal.
Realize o fechamento da pele com um padrão de sutura interrompido usando suturas não absorvíveis. Transfira todos os materiais necessários para uma instalação designada para o Nível Dois Plus. Use equipamentos de proteção pessoal, incluindo uma capa descartável de todos os vestidos, capas de sapato, uma máscara facial e luvas duplas, incluindo luvas resistentes a cortes, em todos os momentos enquanto trabalha com o vírus.
Selecione camundongos com uma reconstituição de mais de 15% das células positivas de CD45 humanos e com presença de albumina humana no soro para infecção pelo HIV-1. Injete intraperitoneally os camundongos com doses infecciosas de 1.000 a 10.000 de cultura tecidual de 50 HIV-1 ADA em um volume de 100 a 200 microliters por rato. Depois de eutanásia dos camundongos, extiria o fígado de cada rato como descrito no protocolo de texto.
Coletar e fixar os fígados em 4% de paraformaldeído durante a noite. O estabelecimento de um modelo de camundongo humanizado duplo com fígado humano e células imunes pode ser facilmente monitorado a cada passo com ELIZA muito simples e citometria de fluxo, respectivamente. A citometria de fluxo é realizada regularmente para avaliar o desenvolvimento de um sistema imunológico funcional e para ver o efeito da infecção pelo HIV nas células imunes.
Em camundongos humanizados duplos, o desenvolvimento de células imunes funcionais pode variar de 15 a 90% do portão linfócito. Para a avaliação do engrafamento dos hepatócitos humanos, eliza para níveis de albumina específicos humanos é realizada mensalmente no soro do rato. Camundongos engrafados com HSPCs e HEPs mostram níveis de albumina específicos do homem que variam de aproximadamente sete microgramas por mililitro a 377 microgramas por mililitro em um mês, continuando a crescer ao longo do tempo de observação.
O efeito da infecção pelo HIV em células imunes humanas no sangue de camundongos humanizados duplos é monitorado pela citometria de fluxo e nos HEPs no fígado pela albumina específica humana ELIZA. Em cinco semanas, o HIV-1 causa uma diminuição nos níveis de albumina humana no soro e há um esgotamento dos hepatócitos positivos ck18 humanos nas seções hepáticas de camundongos humanizados duplos. Uma menor proporção de CD4 para CD8 é tipicamente observada no sangue e fígado de camundongos infectados pelo HIV, em comparação com os níveis observados no mesmo camundongo antes da infecção.
O sangue deve ser colocado cuidadosamente em cima do meio de separação do linfócito para isolamentos de casaco buffy. Para a cirurgia, segure o baço suavemente e insira a agulha no polo inferior do baço. Após o isolamento de células-tronco hematopoiéticas, é crucial verificar a pureza das células-tronco hematopoiéticas positivas cd34 para evitar células positivas CD3 e injeções agudas de hepatócito de diferentes doadores.
Como os camundongos humanizados mostram aspecto fisiológico do sistema imunológico humano e do fígado, os camundongos desenvolvidos poderiam ser utilizados para estudar a fisiopatênese do HIV e infecções físicas e cirrose.
Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.
Read Article
Cite this Article
Dagur, R. S., Wang, W., Makarov, E., Sun, Y., Poluektova, L. Y. Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis. J. Vis. Exp. (151), e58645, doi:10.3791/58645 (2019).
Copy