qKAT: quantitativa coeficiente digitação de assassino-célula Genes de receptores de imunoglobulina-como
6 de março de 2019
Pilha de assassino quantitativa imunoglobulina-como receptor (KIR) semi-automático digitação (qKAT) é um método simples, alto rendimento e baixo custo para copiar números genes KIR de tipo para sua aplicação em estudos de associação de população e a doença.
Este método pode responder a perguntas-chave sobre a genética do receptor de células NK, como a diversidade do haplotipo e como isso se relaciona com a doença. A demonstração visual deste método ajudará a definir o protocolo em seu laboratório, incluindo o processo de automação e análise de dados. As principais vantagens dessa técnica são que, ao contrário dos métodos convencionais, o qKAT, que significa digitação automatizada kir quantitativa, é de alto rendimento e fornece número de cópia genética.
qKAT pode fornecer insights sobre associação de doenças. As implicações dessa técnica podem ser úteis para a terapia para infecções virais como HIV e hepatite C, no câncer, no transplante de células-tronco e distúrbios da gravidez. qKAT também pode ser aplicado no estudo da genética populacional, bem como na exploração da expressão e interações funcionais entre moléculas kir e HLA.
qKAT consiste de 10 reações multiplex que visam especificamente exons dos dois genes KIR e um gene de referência. Neste protocolo, primers específicos são projetados para detectar os alelos do gene dado e os resultados do PCR em amplicons curtos. Depois disso, sondas de hidrólise específicas de dupla rotulagem são usadas para monitorar a amplificação do PCR em tempo real.
A análise de números de cópia usa quantificação relativa dos genes KIR alvo para um gene de referência. qKAT é projetado e configurado para ser uma técnica de alta produtividade. Assim, cada reação pode ser realizada em pouco menos de 1.000 amostras.
As etapas a seguir mostram os passos envolvidos na preparação e revestimento de cada placa de DNA de 96 poços. Para começar, depois de quantificar o DNA, diluir o DNA em uma placa de poço de 96 poços profundos. Inclua pelo menos uma amostra de controle com um número de cópia conhecido e um controle não-modelo.
Centrifugar a placa a 450 gs por dois minutos. Em seguida, dispense cada amostra em quadruplicação em placas qPCR de 384 poços. Depois disso, o ar seca o DNA em uma área limpa à temperatura ambiente por 24 horas.
Para configurar uma reação qKAT para 10 placas de 384 poços, primeiro, descongele o buffer qPCR, primer e alíquotas de sonda a quatro graus Celsius. Prepare a mistura mestre no gelo de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, use uma pipeta multicanal para distribuir a mistura mestre uniformemente através de uma placa de 96 poços profundos.
Distribua 9,5 microliters da mistura mestre em cada poço da placa com as amostras de gDNA secas. Depois disso, sele a placa com papel alumínio e armazene-a imediatamente a quatro graus Celsius. Lembre-se de realizar uma lavagem de água curta para limpar as agulhas do sistema de manuseio líquido se dispensar a mistura mestre em mais de uma placa de DNA de 384 poços.
Centrifugar a placa com as amostras de gDNA a 450 gs por três minutos. Em seguida, incubar a placa a 4 graus Celsius para resuspensar o DNA e dissipar quaisquer bolhas de ar. Depois de incubar a placa durante a noite, repita a centrifugação para dissipar quaisquer bolhas de ar.
Em seguida, coloque a placa na doca de armazenamento refrigerado. Conecte a máquina qPCR a um manipulador de microplacão. Em seguida, programe o manipulador de microplacões de acordo com o protocolo de texto.
Uma vez que a corrida esteja completa, peça ao robô para coletar a placa da máquina qPCR e colocá-la na doca de descarte. Após concluir a amplificação, abra o software qPCR. Sob a guia Navegador, abra o arquivo de experimento de reação salvo para uma placa.
Em seguida, abra a janela Criar novas análises e selecione as configurações apropriadas para o método 2º Derivative Max. Em seguida, selecione Filter Comb e certifique-se de que os dados coletados para STAT6 sejam selecionados. Selecione a compensação de cores apropriada.
Clique em Calcular e, em seguida, clique em salvar arquivo. Para analisar os dados com o método Ajustar pontos, abra a nova janela de análise e selecione as configurações apropriadas para o método Fit Points. Em seguida, selecione os filtros corretos e compensações de cores para STAT6.
Defina a faixa de ruído para excluir o ruído de fundo. Depois disso, abra a guia Análise e defina os pontos de ajuste para três e selecione Mostrar pontos de ajuste. Salve as alterações e repita as etapas com configurações apropriadas para fit point e análise 2ª Derivada para os genes KIR.
Abra a guia Navegador no software qPCR e selecione Exportação em lote de resultados. Em seguida, abra a pasta contendo os arquivos de experimento e transfira-os para o lado direito da janela. Clique em A seguir e selecione o nome e a localização do arquivo de exportação.
Depois disso, selecione o tipo de análise de interesse e clique em Seguir. Certifique-se de que o nome do arquivo, da pasta de exportação e do tipo de análise estão corretos antes de clicar em "Próximo" para iniciar o processo de exportação. Quando o status de exportação mudar para OK, a tela passará automaticamente para a próxima etapa.
Certifique-se de que todos os arquivos selecionados foram exportados com sucesso e clique em "Feito". Em seguida, use os scripts no protocolo de texto para dividir as placas exportadas em reações individuais e converter os arquivos em um software legível pelo software de análise de números de cópia. Em seguida, abra o software de análise de números de cópia e selecione Importar arquivo de resultados pcr em tempo real para carregar os arquivos de texto criados pelos scripts.
Por fim, selecione Analisar e realizar a análise selecionando o número de cópia da amostra mais frequente. Neste protocolo, a digitação semi-automatizada, ou qKAT, foi usada para copiar genes kir tipo número. O número de cópia mais frequente para KIR2DL4 foi de duas cópias, enquanto o número de cópia mais frequente para KIR3DS1 era zero.
Ao tentar este procedimento, é extremamente importante garantir que o DNA seja quantificado com precisão, para conduzir todos os passos no gelo e para garantir que os reagentes estejam cobertos de luz. Também é importante realizar verificações minuciosas sobre os dados brutos para amostras que não estão de acordo com as regras LD conhecidas para genes KIR. Após esse procedimento, outros métodos como sequenciamento podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, por exemplo, presença de genes de fusão, ou identificação de novos alelos.
Após seu desenvolvimento, este método abriu caminho para pesquisadores do campo da imunogenética explorarem o papel do KIR na biologia celular NK, resistência a doenças e reprodução humana.
Visão Geral
O método quantitativo e semi-automatizado de tipagem de receptores tipo imunoglobulina de células assassinas (qKAT) é uma abordagem de alto rendimento para a tipagem de genes KIR. Esta técnica auxilia na compreensão da genética dos receptores de células NK e suas implicações em diversas doenças.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunogenética
- Genética de populações
- Biologia celular
Contexto
- Os genes KIR desempenham um papel crucial na resposta imune.
- Compreender a diversidade de haplótipos é importante para estudos de associação com doenças.
- Métodos convencionais são frequentemente de baixo rendimento e onerosos.
- qKAT fornece informações sobre o número de cópias gênicas de forma eficiente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de alto rendimento para tipagem genética de KIR.
- Explorar a relação entre genética de KIR e doenças.
- Facilitar pesquisas em imunogenética e estudos populacionais.
Métodos Utilizados
- Desenho de primers específicos para a detecção de genes KIR.
- Uso de reações multiplex direcionadas a genes KIR e um gene de referência.
- PCR em tempo real para monitoramento da amplificação.
- Análise de dados por meio de software especializado para avaliação do número de cópias.
Resultados Principais
- O qKAT pode processar quase 1.000 amostras em um único ensaio.
- Foram identificados os números de cópias mais frequentes para KIR2DL4 e KIR3DS1.
- O método demonstrou confiabilidade na quantificação dos números de cópias gênicas de KIR.
- Facilitou a exploração adicional do papel de KIR em doenças.
Conclusões
- qKAT é uma ferramenta valiosa para pesquisadores em imunogenética.
- Ele aprimora a compreensão das funções dos genes KIR na saúde e na doença.
- O método pode ser adaptado para diversas aplicações em genética de populações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A genotipagem precisa de loci polimórficos de receptores imunes, como o KIR, é fundamental para reduzir riscos na validação de alvos em pesquisas de imunologia e transplante. O qKAT permite análise de número de cópias com alta resolução em grandes coortes, apoiando insights mecanicistas sobre a resistência mediada por células NK a doenças e a resposta terapêutica. Essa capacidade fortalece a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, ao associar variação genética a desfechos funcionais em modelos de doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da variação no número de cópias do gene KIR para esclarecer a diversidade de haplótipos e seu impacto na função do receptor de células NK.
- Valor Operacional: Oferece genotipagem semi-automatizada e de alto rendimento, compatível com formatos de 96 e 384 poços, para processamento escalonável de amostras.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Fornece dados quantitativos e reproduzíveis de número de cópias para todos os genes KIR utilizando PCR multiplex em tempo real com sondas de hidrólise.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio da normalização com gene de referência e fluxos de trabalho de análise pré-definidos (Máximo da Segunda Derivada, Pontos de Ajuste).
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a exploração das interações KIR-HLA em contextos de doenças como infecção viral, câncer e transplante.
- Valor Operacional: Gera dados informativos sobre haplótipos utilizáveis em sequenciamento posterior ou ensaios funcionais para a descoberta de novos alelos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
qKAT insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses sobre alvos até a validação pré-clínica, especialmente nos casos em que mecanismos efetores imunológicos influenciam a eficácia terapêutica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar o número de cópias de KIR à atividade das células NK em fenótipos associados a doenças.
- Triagem: Permite sistemas biológicos prontos para uso, com genótipos de KIR definidos, para triagem de compostos em modelos mediados pelo sistema imunológico.
- Análises: Fornece dados de quantificação relativa adequados para chamada de número de cópias e comparação estatística entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta o perfil genético à continuidade pré-clínica em modelos de reconstituição imunológica ou doença enxerto contra hospedeiro.
- Reutilização Empresarial: Projetada como uma plataforma de genotipagem reutilizável, aplicável em portfólios de imunologia, oncologia e saúde reprodutiva.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos imunológicos por meio de perfis genéticos de alta resolução de locos polimórficos.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio do manuseio padronizado de reagentes, preparação da mistura mestra em cadeia fria e processamento automatizado de placas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao permitir a estratificação genética em larga escala em estudos de fase inicial.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco mediante a identificação de haplótipos de KIR associados a respostas diferenciadas ao tratamento.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em configuração de PCR em tempo real, desenho de primers/probes e software de análise de número de cópias.
- Depende de instrumentação qPCR compatível com placas de 384 poços e manipuladores de microplacas para automação.
- Necessita padronização entre equipes quanto à quantificação de DNA, consistência no preparo de placas e controles de contaminação.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a modelos não humanos ou genes de referência alternativos.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de quantificação precisa de DNA, reagentes protegidos da luz e controle de qualidade de dados brutos para conformidade com a regra LD.
