Detecção baseada em plaquetas de óxido nítrico no sangue, medindo-se a fosforilação VASP

Este protocolo aborda o uso potencial de plaquetas como sensor de óxido nítrico altamente sensível tanto in vitro quanto in vivo dentro do sangue. O aumento da fosforproteína estimulada por vasodilatador ou serina P-VASP 239 em óxido nítrico plaquetas tem algumas vantagens, incluindo a capacidade de detectar a presença de óxido nítrico em linhagens nanomolares. Dentro de duas horas após a coleta de 30 a 50 mililitros de sangue inteiro de um doador saudável, adicione cinco alíquotas mililitros do sangue no número apropriado de tubos cônicos de 15 mililitros para centrifugação.

Use uma pipeta de transferência de plástico para coletar cuidadosamente o plasma rico em plaquetas da porção superior dos supernantes. Pellule as plaquetas ricas em plasma com uma segunda centrifugação e lave suavemente as pelotas em cinco mililitros de tampão CGS. Centrifugar a 400 g por 10 minutos em temperatura ambiente.

No final da centrifugação, resuspenque as pelotas em três mililitros de tampão Tyrode modificado. Use um hemótmetro para contar e ajuste a densidade das suspensões plaquetas para três vezes 10 para as oitavas células por mililitro em tampão Tyrode fresco. Em seguida, incubar as suspensões plaquetas por uma hora a 37 graus Celsius.

Enquanto isso, colete os glóbulos vermelhos das camadas de plasma livres de placas de amostras de sangue inteiros por centrifugação, seguido por quatro lavagens em cinco mililitros de PBS por lavagem. Após a última lavagem, descarte os supernacantes e misture os glóbulos vermelhos com um mililitro das plaquetas ricas em plasma no hematocrit experimental apropriado em garrafas de polipropileno fechadas com rolhas de borracha. Insira uma agulha conectada a um tanque de gás hélio em cada septa e insira 26 agulhas de calibre para fazer saídas de gás.

Em seguida, gire lentamente as garrafas à temperatura ambiente e use um oxímetro para medir a pressão parcial de oxigênio para o monitoramento do processo de desoxigenação. A taxa de diminuição do oxigênio depende da taxa de fluxo de hélio e da velocidade de agitação. Portanto, o tempo da oxigenação deve ser otimizado antes de iniciar um experimento, pois isso é altamente dependente da geometria da configuração experimental.

Para a redução do nitrito de glóbulos vermelhos, use uma microsinga para injetar nitrito através do septo nas amostras desoxigenadas de PRP e RBCs para que uma concentração final de 10 micromolars seja alcançada. Incubar as amostras por pelo menos 10 minutos a 37 graus Celsius e transferir um mililitro de cada amostra em um tubo de microcentrifuuga para centrifugação. Transfira 300 microliters de suspensão plaqueta da porção superior dos supernantes em novos tubos de microcentrifuuagem e adicione dextrose citrato ácido a cada tubo em uma proporção de um a nove.

Centrifugar as plaquetas novamente e resuspensar as pelotas em 80 microliters de tampão de lise gelada contendo coquetel inibidor de protease três para cada tubo. Em seguida, carregue 15 microgramas de proteína de cada amostra para dois géis separados de 10% SDS-PAGE. Execute os géis a 120 volts por 1,3 horas.

No final da corrida, transfira os géis para membranas individuais de celulose nitrosa e bloqueie qualquer ligação inespecífica com um volume apropriado de leite seco de 5% sem gordura. Incubar as membranas com os anticorpos primários apropriados durante a noite a quatro graus Celsius seguidos de rotulagem com um anticorpo peroxidase de rabanete secundário apropriado por 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, exponha as membranas com um imager para quantificar a densidade da banda com um programa de análise de imagem apropriado.

Amostras de sangue venoso saudáveis têm valores parciais de pressão de oxigênio entre 50 e 80 milímetros de mercúrio. A desoxgenação por hélio diminui rapidamente a pressão parcial do oxigênio para 25 milímetros de mercúrio em 10 minutos. Uma maior diminuição da pressão parcial de oxigênio pode ser alcançada com um tempo de desoxigenação aumentado.

O aumento da desoxigenação leva ao aumento dos níveis de hemólise, como indicado pelo plasma de cor cada vez mais vermelho. Este é um efeito da desoxigenação e não é causado por mexer-se como indicado pela falta de hemólise em amostras agitadas sem hélio. Tanto a fosfoproteína estimulada vasodilator quanto os níveis de expressão VASP e Phosphorylated-VASP em plaquetas diminuíram com o aumento do hematocríto em amostras desoxigenadas detectadas pela mancha ocidental.

O tratamento com um doador de óxido nítrico de curta duração aumenta a expressão de fosfoproteína estimulada por vasodilatador em plaquetas dentro de 10 segundos de tratamento. Além disso, os níveis de Phosphorylated-VASP ou P-VASP permaneceram estáveis até 10 minutos após a incubação do doador NO com plasma rico em plaquetas indicando que há tempo suficiente para separar RBCs de plaquetas sem afetar os níveis P-VASP existentes. O nitrito também aumenta os níveis P-VASP da plaqueta na presença de RBCs desoxigenados.

Aqui a razão entre P-VASP e VASP total depende do nível de hematócrito. VASP é altamente expresso em plaqueta e é rapidamente fosfoilado na presença de óxido nítrico. Portanto, este protocolo fornece um método para estudar a indução de óxido nítrico por vários estímulos fisiológicos.

Com este método, temos usado com sucesso o aumento P-VASP em plaqueta como um marcador de estimulação de óxido nítrico por nitrito inalado in vivo. Não se esqueça que trabalhar com plaquetas com um espécime biológico deve ser sempre realizado usando o equipamento de proteção pessoal adequado.