Name: Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a co-impressão de componentes sintéticos e biológicos para criar scafolds de engenharia tecidual usando PCL e matrizes descelularizadas. Este método melhora as condições de cultivo celular.

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Este projeto foi parcialmente financiado por um subsídio do pediátrico ortopédico sociedade da América do Norte (POSNA) e o National Institutes of Health conceder NIBIB R21EB025378-01 (bolsa de pesquisa exploratória bioengenharia).

1. obtenção e pré-processamento de microesferas
<ol><li>Microesferas de produzir com a matriz desejada encapsulado (PLA-DM)2. Nota: É imperativo que as microesferas são de tamanho uniforme. Por esta razão, é essencial peneirar os microesferas antes de usar. Apesar de encapsulamento e decellularization matriz tem sido detalhados em anteriores Publicações2, segue um breve resumo do processo.<ol>
<li>Primeiro, colha cartilagem plugues de suínos membros posteriores. Decellularize da cartilagem em uma série de lavagens com 0,05% tripsina/0.5 mm tetrassódico etilenodiaminotetracético ácido (EDTA), Dulbecco modificada do águia médio (DMEM) e 1,5% de ácido peracético e 2,0% Triton X-100 para 4 h com lavagens de água destilada antes e após cada etapa2.</li>
		<li>Escorra a matriz decellularized, congelá-lo, lyophilize, triturar e dissolver-se solução de pepsina. Após a dissolução, misture a solução de pepsina com PLA que foi dissolvido em diclorometano.</li>
		<li>Adicione a mistura de gota a gota em um álcool polivinílico 3% em solução aquosa. Centrifugar as microesferas resultantes, enxaguar, dreno e lyophilize novamente. Nota: Para obter detalhes completos sobre o processo de ver o protocolo publicado anteriormente no2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peneire as microesferas.<ol>
<li>Certifique-se de que todas as placas de peneira foram cuidadosamente limpos e secos antes da utilização. Se necessário, limpar peneiras usando limpador ultra-sônico para garantir que todas as esferas são retiradas da peneira.</li>
		<li>Monte o agitador de peneira com o 106 criva µm no topo, bandeja do 53 µm após isso e a peneira bandeja na parte inferior.</li>
		<li>Coloque microesferas secas na bandeja da peneira superior e coloque a tampa na bandeja superior. Ligue o peneiramento grosso de 8 a 10 min. repetir na multa por 8 a 10 min. Nota: Os tempos de peneira podem precisar ser aumentado ou diminuído dependendo do lote.</li>
		<li>Cuidadosamente, retirar as placas de peneira um por um e colocá-los de cabeça para baixo em um papel de grande pesar. Bata nos lados suavemente para garantir que a maioria das esferas caíram fora da peneira e no papel.</li>
		<li>Descartar as esferas de grandes dimensões (> 106 µm) e esferas subdimensionadas (< 53 µm). Adicione esferas que estão na faixa de tamanho de 53 a 106 µm para um tubo de centrifugação rotulados com o tipo e o lote número, em seguida, coloque no congelador-20 ° C até nova utilização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. controle da qualidade microesfera avaliações
Nota: Consulte a Figura 1.
<ol><li>Realize a avaliação macroscópica/visual para verificar que as microesferas são uniformes e esférico, com presentes não agregados.</li>
	<li>Avalie as microesferas usando uma varredura micrografia eletrônica (SEM).<ol>
<li>Por isso, microesferas de lugar para um SEM o chuck e salpicar o casaco com ouro-paládio em atmosfera de argônio usando um sputter coater para uma espessura de 4 nm.</li>
		<li>Observar as características da superfície, morfologia e diâmetros das microesferas usando um 10 kV acelerando a tensão e uma distância de trabalho de 10 mm para garantir que a produção e peneiramento das microesferas foi bem sucedida.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. o filamento criação para impressão 3D
<ol><li>Medir e registrar a massa das microesferas obtidas as etapas 2 e 3; pelo menos 25 g é necessária.</li>
	<li>Adicione o pó de policaprolactona (PCL) para as microesferas para uma relação de peso de 1:4 de microesferas para PCL.</li>
	<li>Misture a mistura de pó em um misturador de rolamento miniatura a 20 rpm por 5 min e depois virar o recipiente e misture a 20 rpm para um adicional 5 min (ver Figura 2).</li>
	<li>Muitos extrusoras comercialmente disponíveis (consulte a Tabela de materiais) tem jaquetas isolantes porque as suas temperaturas de trabalho pretendido são para filamentos de deposição fundida tradicional modelagem (FDM). Modificar a extrusora (se necessário), removendo o material de isolamento e usá-lo em combinação com fãs de área de trabalho (que soprar ar ambiente para a extrusora e filamentos extrudados) usar da extrusora a baixas temperaturas. Nota: Desktop fãs que soprar ar ambiente para arrefecer a extrusora e filamentos são úteis para este procedimento.</li>
	<li>Instalação a instalação de equipamentos para extrusão. Veja a Figura 3.<ol>
<li>Instalação da extrusora para que sua saída é ~ 60 cm a partir da entrada para o spooler, com um caminho direto para a entrada de spooler da tomada da extrusão. Nota: O spooler pode opcionalmente ser Erguido 3-4 polegadas do banco se encontra-se que o filamento está se inclinando a ponto de tocar a bancada.</li>
		<li>Coloque um ventilador desktop ~ 15 cm desde a jaqueta de aquecimento e direccioná-la para a jaqueta de aquecimento para oferecer resfriamento com ar ambiente em toda a produção de filamento. Coloque um segundo ventilador aproximadamente a meio caminho entre a extrusora e spooler e direccioná-la para o extrudate para ajudar a refrigerar o filamento com ar ambiente.</li>
		<li>Ajuste o posicionamento conforme necessário durante todo o processo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definir a extrusora modificada aquecimento elemento a 52 ° C, o desktop ventiladores de refrigeração e deixe o instrumento vir ao equilíbrio de 20 a 30 min.. Certifique-se de que o bocal adequado é anexado para a extrusora.</li>
	<li>Pouco antes do início, encha o funil da extrusora com a mistura de microesfera/PCL da etapa 3.3. Ative o spooler e o trado de extrusora para iniciar a extrusão do filamento.</li>
	<li>Quando o filamento inicial é extrudado, manualmente puxar o extrudate da tomada da extrusão com fórceps e alimentá-lo para o spooler do filamento.</li>
	<li>O filamento desejado levará algum tempo para sair o spooler. Utilizando bobinas separadas ou fita, marca claramente quando a composição de filamento aparece visualmente uniforme.</li>
	<li>Acompanhar de perto o processo e modificar parâmetros conforme necessário. Ajuste a temperatura da extrusora, velocidade de extrusão do eixo helicoidal e velocidade de spooler para obter um filamento de diâmetro de 1,75 mm, medida por pinças. Ajuste os fãs conforme necessário para esfriar o filamento corretamente para evitar cortes transversais de filamento não circular. Misture e volte a encher o depósito de lixo, se necessário. Nota: Muita atenção é necessária durante este processo de obtenção de filamento adequado para posterior impressão 3D. Os parâmetros acima irão mudar dependendo das condições ambientais, o nível de preenchimento e a uniformidade da mistura no funil e a dinâmica de termodinâmica e fluxo dos lotes específicos de PCL e microesferas.</li>
	<li>Continue expulsando até todo o pó tem sido utilizado e o funil está quase vazio. Adicione o pó PCL (sem microesferas) para o funil para expulsar a mistura de microesfera que está atualmente na extrusora. Continue adicionando pó PCL para o depósito de lixo até não mais microesferas são visíveis no extrudate.</li>
	<li>Certifique-se de rotular e separam o filamento que contém as microesferas na concentração desejada, como quando o filamento é arrefecido é mais difícil de distinguir o filamento uniforme de filamento não-uniforme.</li>
	<li>Continuar até que haja pó mínimo deixada no funil de extrusão e, em seguida, desligue o spooler, trado de extrusora, elemento de aquecimento da extrusora e fãs.</li>
</ol>4. impressão com o filamento
<ol><li>Desenha uma geometria da forma desejada e formulário usando um software de desenho auxiliado por computador. Em seguida cortar o modelo e ditar o toolpath usando software de corte que é compatível com a máquina de impressão 3D sendo usada.</li>
	<li>Carrega o filamento da etapa 3 para qualquer impressora padrão do FDM, equipado com bicos padrão do diâmetro desejado (normalmente de 0,4 mm). Começa a impressão (normalmente a 65-70 ° C e 300 mm/min velocidade linear), como o filamento personalizado é camada por camada depositada pela máquina.</li>
	<li>Certifique-se de uma atenção especial para a primeira camada e ajuste as configurações conforme necessário para obter uma boa qualidade de impressão. Nota: Podem ser feitos ajustamentos para a velocidade de impressão, impressão da temperatura, temperatura de plataforma, multiplicador de extrusão e outros parâmetros. Referir-se a impressora e o guia de solução de problemas de corte do fabricante para obter assistência adicional.</li>
</ol>5. avaliação do controle da qualidade
<ol><li>Coloque as construções impressas SEM mandris e salpicar o casaco com ouro-paládio em atmosfera de argônio usando um sputter coater para uma espessura de 4 nm.</li>
	<li>Observar ao microscópio usando um 10 kV acelerando a tensão e uma distância de trabalho de 10 mm para verificar as características da superfície e a presença ou ausência de microesferas, se aplicável.</li>
</ol>6. teste funcional das construções de impressas
Nota: A fosfatase alcalina (FAL ou ALP) pode ser usada como um substituto para a matriz de decellularized para determinar se proteínas encapsuladas são biologicamente ativas, após o processo de produção do filamento. ALP é usado porque ela catalisa uma reação de um substrato, p-nitrofenil fosfato, para mudar de incolor a amarelos subprodutos, p-nitrofenol e fosfato inorgânico, mas somente se ALP é a conformação funcional.
<ol><li>Imprimir uma geometria (n = 3) que tem uma massa final de pelo menos 400 mg com o filamento de microesfera ALP (PLA-ALP/PCL) usando parâmetros de impressão idênticos como os andaimes de PLA-DM/PCL. Também de impressão PCL-única (PCL(-)) andaimes de mesma geometria como os andaimes de PLA-ALP/PCL. Mergulhe-os em 1 mL de tampão de Tris-HCl e incubar por 24 h a 37 ° C e 110 rpm rotação para permitir a difusão de enzima.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de fosfato p-nitrofenil de 1 mg/mL, dissódico hexa-hidratado em Tris-HCl. Incubar a 37 ° C, 110 rpm para um adicional h 10. ler a absorbância sobrenadante no 415 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. <a target="_blank" href="https://www.astm.org/DIGITAL_LIBRARY/STP/PAGES/STP15307S.htm">Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone.</a> Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).</li>
<li>Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29394158">Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold.</a> Biofabrication. , (2018).</li>
<li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li>
<li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11071603">Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.</a> Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).</li>
<li>Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+biodegradable+lumbar+interbody+fusion+cage+design+and+fabrication+using+integrated+global-local+topology+optimization+with+laser+sintering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering.</a> Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).</li>
<li>Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00158-010-0508-8">Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity.</a> Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).</li>
<li>Lin, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+bone+engineering+using+ex+vivo.+gene+therapy+and+topology-optimized%2C+biodegradable+polymer+composite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).</li>
<li>Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interbody+Fusion+Cage+Design+Using+Integrated+Global+Layout+and+Local+Microstructure+Topology+Optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization.</a> Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).</li>
<li>Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresorbable+Airway+Splint+Created+with+a+Three-Dimensional+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).</li>
<li>Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamenting+3D+printed+scaffolds+with+cell-laid+extracellular+matrix+for+bone+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration.</a> Biomaterials. 37, 230-241 (2015).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interface+microstructure+on+interfacial+shear+strength+for+osteochondral+scaffolds+based+on+biomimetic+design+and+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing.</a> Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).</li>
<li>Williams, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15763261">tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering.</a> Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).</li>
<li>Monibi, F. A., Cook, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Derived+Extracellular+Matrix+Bioscaffolds%3A+Emerging+Applications+in+Cartilage+and+Meniscus+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).</li>
<li>Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs%3A+Current+Problems+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).</li>
<li>Sutherland, A. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Microsphere-Based+Scaffolds+Containing+Decellularized+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage.</a> Macromolecular Bioscience. , (2015).</li>
<li>Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naturally+derived%2C+cytocompatible%2C+and+architecturally+optimized+scaffold+for+tendon+and+ligament+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration.</a> Biomaterials. , (2007).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+strain+on+tensile+properties+of+a+naturally+derived%2C+decellularized+tendon+scaffold+seeded+with+allogeneic+tenocytes+and+associated+messenger+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+surgical+orthopaedic+advances%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression.</a> Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+process+for+optimizing+musculoskeletal+allograft+tissue+to+improve+safety%2C+ultrastructural+properties%2C+and+cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+-+Series+A%22%5BJournal%5D)">A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration.</a> Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).</li>
<li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21362080">Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment.</a> Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).</li>
<li>Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li>
<li>Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+kidneys+as+a+source+of+ECM+scaffold+for+kidney+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration.</a> Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).</li>
<li>Dean, R. L. <a target="_blank" href="https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bmb.2002.494030060138">Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Ambos decellularized matrizes e 3D impresso PCL andaimes independentemente foram mostrados para permitir a adesão e proliferação de células, validando seu uso para osteocondrais reparar10,11,12. O uso da matriz decellularized em abordagens de engenharia para reparação tecidual tem sido um assunto de muito interesse e sucesso no recente passado2,3,<sup class="x...

Técnicas de engenharia de tecido atual para aplicações clínicas tais como reconstrução de osso, cartilagem, tendão e ligamento usam autoe aloenxertos para reparar tecidos danificados. Cada uma dessas técnicas é de executada rotineiramente como um "padrão ouro" na prática clínica, pela primeira colheita do tecido do doador do paciente ou uma partida de fetos morta e em seguida, colocando o tecido do doador para o local do defeito2. No entanto, estas estratégias são limitadas pela morbidade local doador escassez local doador para grandes defeitos, risco de infecção e a dificuldade em encontrar enxertos que correspondem a geometria desejada. Além disso, estudos têm mostrado que usado para a reconstrução de aloenxertos reduziram propriedades mecânicas e biológicas, quando comparado com o tecido nativo3. Com estas considerações em mente, os engenheiros de tecido recentemente giraram para três dimensional bioprinting (3D) para produzir personalizadas, complexas geometrias que são biologicamente ativos e projetado para acomodar o tamanho do defeito e forma ao fornecer suficiente Propriedades mecânicas até remodelar biológica é completa.
Idealmente, um andaime 3D-impresso consistiria de um backbone de polímero que pode manter a estabilidade mecânica necessária do tecido nativo enquanto os biologics incorporados oferecem sinais bioquímicos ao redor de células, levando à sua migração, proliferação, diferenciação e produção de tecido2,5. Infelizmente, a maioria das construções que contêm componentes biológicos são feitas com gel ou polímeros que são demasiado fracos para suportar forças na vivo vividas por tecidos alvo para reconstrução de auto/aloenxerto. Outros polímeros tais como o ácido polilático (PLA) são biorreabsorvível, 3D para impressão e estruturalmente som, mas são impressos em temperaturas igual ou superior a 210 ° C - tornando-se impossível para ser impresso co durante a fabricação de produtos biológicos. Policaprolactona (PCL) é outro FDA-desmarcada, biorreabsorvível polímero que pode ser 3D imprimido em uma temperatura mais baixa (65 ° C), que se tornou cada vez mais popular na fabricação de implantes de paciente específico com morfologias complexo5,6 ,7,8,9. No entanto, a maioria dos bioprinters usando tecnologia pneumática impossibilitam a impressão PCL a temperaturas mais baixas, onde atividades biológicas podem ilesos. Até à data, a integração destes polímeros com auto/aloenxertos em um romance printable biomaterial ainda tem de ser realizado. Na ausência de um material, uma abordagem de engenharia de tecidos verdadeiro para reconstrução de tecidos é improvável. Portanto, temos procurado combinar PLA, PCL e decellularized matrizes aloenxerto (DM) para utilizar as vantagens de cada material para fabricar uma construção viável capaz de reconstruir tecidos complexos. Este processo seria fornecer resistência mecânica inicial necessária para resistir a forças na vivo e a estabilidade térmica para acomodar fabricação aditiva em uma construção que induz a formação do tecido desejado.
Em uma recente tentativa de abordar os obstáculos acima mencionados, nós mostramos que é viável para encapsular a matriz extracelular da cartilagem decellularized dentro de uma barreira PLA termicamente protetora que pode ser extrudada dentro de filamentos PCL, mantendo a capacidade de DM para influenciar as células circundantes de host2. Isso inspirou-na procurar abordagens clinicamente eficazes para reconstrução de tecidos. No estudo atual, nós utilizamos a tecnologia de plataforma para construir andaimes de tudo-em-um que incluem PLA, DM e PCL (PLA-DM/PCL).
Nosso objetivo é melhorar a eficácia e a utilidade dos enxertos usando a técnica de biofabrication romance proposto com mais precisão recapitular tecido nativo, para, finalmente, usá-los em várias aplicações.

<table><tbody><tr><td>Máquina de peneira</td><td>Haver & Boecker Tyler</td><td>Ro-Tap RX 29-E Peneira Pura</td><td></td></tr><tr><td>90 um</td><td>Fisherbrand</td><td>170328156</td><td>No. 170</td></tr><tr><td>Peneira 53 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162513588</td><td>No. 270</td></tr><tr><td>Peneira 106 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162018121</td><td>No. 140</td></tr><tr><td>Revestidor por pulverização catódica</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura</td><td>Hitachi, EUA</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filabot EX2</td><td>Filabot.com</td><td>FB00061</td><td></td></tr><tr><td>Filabot Spooler</td><td>Filabot.com</td><td>FB00073</td><td></td></tr><tr><td>CAPA 6506</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr>Fan <td>Comfort Zone</td><td>de 6",</td> Amazon <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Banho de água ultrassônico</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-08895-13</td><td></td></tr><tr><td>Dreamer</td><td>FlashForge</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Mixer de Bateria</td><td>Feito sob medida</td><td>n/a</td><td>Equipamento similar: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no& gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Micro Balance</td><td>Mettler Toledo, Fisher Scientific</td><td>01-913-851</td><td></td></tr><tr><td>Simplify3D</td><td>Simplify3D</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>SolidWorks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas</td><td>Produzido internamente, veja simultaneamente submissão JoVE submissão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenil fosfato, sal dissódico, hexahidrato</td><td>Millipore</td><td>4876-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase, alcalina</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10 713 023 001</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de Absorbância</td><td>Tecan</td><td>Sunrise</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Agitador aquecido</td><td>Novo Brunswick Scientific</td><td>Excella E24</td><td></td></tr></tbody></table>

novo processo de impressão 3d decellularized matrizes

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Bioprinting 3D visa criar andaimes personalizados que são biologicamente ativos e acomodar o tamanho desejado e geometria. Um backbone de termoplástico pode fornecer estabilidade mecânica semelhante ao tecido nativo enquanto agentes biológicos oferecem pistas composicionais de células progenitoras, levando a sua migração, proliferação e diferenciação para reconstituir os tecidos originais / órgãos1,2. Infelizmente, muitos compatível com impressão 3D, polímeros biorreabsorvível (tais como o ácido polilático, PLA) são impressas em temperaturas de 210 ° C ou superior - temperaturas que são prejudiciais para produtos biológicos. Por outro lado, policaprolactona (PCL), um tipo diferente de poliéster, é uma matriz, material para impressão 3D que tem uma temperatura de impressão mais suave de 65 ° C. Portanto, foi hipotetisado que decellularized da matriz extracelular (DM) contido dentro de uma barreira PLA termicamente protetora poderia ser impresso dentro do filamento PCL e permanecem na sua conformação funcional. Neste trabalho, osteocondrais reparação foi a aplicação para a qual foi testada a hipótese. Como tal, cartilagem porcina foi decellularized e encapsulada em ácido polilático (PLA) microesferas que então foram extrudadas com policaprolactona (PCL) em filamento para produzir construções 3D através de fundidos modelagem de deposição. As construções com ou sem as microesferas (PLA-DM/PCL e PCL(-), respectivamente) foram avaliados para diferenças nas características da superfície.

Depois de peneirar, microesferas devem aparecer uniformes e ser livre de agregados. Sob SEM, as microesferas peneiradas podem ter pequenos poros em sua superfície, mas caso contrário vão ser esférica e Lisa, como mostrado na Figura 1. Todos os filamentos extrudados devem ser de diâmetro uniforme e seção transversal circular. Um filamento que contém microesferas (PLA-DM/PCL) terá um ligeiramente mais fosco terminar enquanto um PCL-only (filamento PCL(-)) ficar...

Este protocolo descreve a produção de filamento policaprolactona (PCL) com microesferas de (PLA) de ácido polilático incorporado que contêm matrizes decellularized (DM) para impressão 3D estruturais de engenharia de tecidos construções.

Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Este método permite a co-impressão de sintéticos estruturais e componentes biológicos para andaimes projetados por tecidos. Esses andaimes podem replicar o ambiente de tecido nativo com mais precisão, o que pode ser benéfico para células cultivadas. A principal vantagem desta técnica é que ela pode imprimir estruturas mecanicamente sólidas sem danificar o material biológico encapsulado dentro dos andaimes em uma técnica all-in-one para engenharia de tecidos.Produzir microesferas com a matriz desejada encapsulada. Essas microesferas foram feitas com cartilagem descelularizada de membros traseiros suínos. Eles variam de tamanho.Trabalhe com uma máquina de peneira para obter microesferas de tamanho uniformizado. Certifique-se de que as três bandejas de peneira foram completamente limpas e secas antes de serem usada. Monte o agitador de peneira com a bandeja de malha maior por cima e a bandeja de malha menor no meio.Coloque a panela de peneira na parte inferior. Coloque microesferas secas na bandeja mais alta. Em seguida, coloque a tampa na bandeja.Peneira grosseira por 8 a 10 minutos. Em seguida, peneira fina por oito a dez minutos. Enquanto espera, organize papel de pesar para as esferas peneiradas.Quando a peneira estiver completa, remova cuidadosamente uma bandeja de peneira. Coloque a bandeja de cabeça para baixo no papel de pesagem. Toque suavemente nas laterais para garantir que a maioria das esferas caia.Com todas as placas de peneira esvaziadas sobre papel de peso, descarte as esferas superdimensionadas e subdimensionadas. As demais esferas têm o tamanho correto para uso em etapas subsequentes. Coloque essas esferas em um tubo de centrífuga rotulado.Armazene o tubo em um congelador de 20 graus Celsius até que seja necessário. Pesar o material necessário para fazer o material de filamento. Faça uma relação de peso de um a quatro de microesferas para pó de policaprolactona com pelo menos 25 gramas de microesferas.Transfira a mistura em pó para uma batedeira em miniatura. Misture o pó a 20 rotações por minuto durante cinco minutos. Após cinco minutos, pare a rotação e gire o recipiente.Em seguida, misture a 20 rpm por mais cinco minutos. Para continuar, leve a mistura para uma configuração extrusora e spooler. Configure a extrusora para que sua tomada esteja a cerca de 60 centímetros da entrada de um spooler.Em seguida, no elemento de aquecimento extrusor, certifique-se de que não há jaqueta isolante. Coloque um ventilador de desktop a meio caminho entre o extrusor e o spooler para esfriar o extrudato. Coloque outro ventilador perto da jaqueta de aquecimento para esfriá-lo com ar ambiente.Em seguida, certifique-se de que o bocal adequado está preso à extrusora e defina a temperatura do elemento de aquecimento. Inicie os ventiladores de resfriamento e permita que o instrumento atinja um estado estável. Após 20 a 30 minutos, pegue a mistura de PCL da microsfera e encha o funil extrusor.Ligue o spooler e o extrusor para iniciar a extrusão do filamento. Use fórceps e puxe manualmente o filamento extrudado inicial. Alimente o filamento para o carretel de filamento.Como é extrudado, observe o filamento para identificar sua composição. Depois de algum tempo, a composição do filamento aparecerá uniforme que é desejado. Enrole fita em volta do filamento para marcar o início da região do uniforme.Além dos rolos de carretel, monitore o diâmetro do filamento. Use pinças para testar se o diâmetro está próximo dos 1,75 mm desejados. Ajuste o carretel e extrusão velocidades e temperaturas conforme necessário.Para ajustar o diâmetro do filamento, primeiro altere as velocidades do carretel e extrusor. Você também pode alterar a temperatura extrusora, embora isso geralmente não seja necessário. Continue reabastecendo o funil e extrudando até que todo o pó seja usado.Quando o funil estiver quase vazio, adicione pó PCL ao funil para retirar a mistura da microesfera. Monitore a extrudação enquanto adiciona o pó PCL. A princípio, as microesferas ainda serão visíveis no extrudato.Eventualmente, quando não houver mais microesferas visíveis, pare de adicionar o PCL. Separe e rotule o filamento com microesferas na concentração desejada. Quando houver pó mínimo no funil, pare de extrusão e desligue o equipamento.O filamento pode ser usado em uma impressora padrão de modelagem de deposição fundida. Coloque o filamento na impressora equipada com bicos do diâmetro desejado. Com o modelo carregado, ajuste a temperatura e a velocidade linear para a impressão e comece a depositar o filamento.O filamento personalizado é depositado camada por camada. Preste atenção especial à primeira camada e ajuste as configurações conforme necessário. Estes dois andaimes impressos em 3D são difíceis de distinguir nesta escala.Um deles tem filamento contendo policapralactona, somente PCL. O outro tem filamento PCL com microesferas incorporadas de ácido polilático e matrizes desceluarizadas. Visto usando microscopia eletrônica de varredura, o andaime somente PARA PCL parece mais suave.Em contraste, para os outros filamentos, as microesferas incorporadas no PCL são visíveis em toda a amostra. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que microesferas acima ou subdimensionadas podem impactar a dinâmica de fluxo do material na extrusora. Por essa razão, certifique-se de preparar adequadamente suas microesferas antes de usar.Para minimizar o desperdício, é aconselhável criar um grande lote de filamentos necessários para todos os experimentos, em vez de criar lotes menores com mais frequência. A experiência na produção de filamentos virá com o tempo. Os andaimes produzidos após este procedimento podem ser avaliados in vitro e in vivo para responder a perguntas adicionais sobre indução aprimorada e resistência mecânica em comparação com outros andaimes bio-impressos.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de engenharia de tecidos explorarem a indução contragênica da matriz suína desceluarizada dentro dos andaimes 3D. Não se esqueça que trabalhar com pequenas partículas pode apresentar riscos respiratórios. O uso de uma pequena máscara de partículas durante este procedimento é encorajado.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

A matriz extracelular específico do tecido (ECM) é um mediador chave da função das células. Este artigo descreve métodos para a síntese de espumas e microtransportadores que são estáveis em cultura sem a necessidade de reticulação química para aplicações em 3D avançada em modelos de cultura celular in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos derivado de ECM puros.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Este protocolo descreve a decellularization completa do miocárdio humano preservando seus componentes de matriz extracelular. Transformação dos resultados da matriz extracelular na produção de micropartículas e um hidrogel de auto-montagem de tilacoides.

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

Decellularized andaimes derivado de cartilagem podem ser usados como um andaime para guia de reparação da cartilagem e como um meio para regenerar o tecido osteocondral. Este documento descreve o processo de decellularization em detalhes e fornece sugestões para usar estes andaimes em configurações in vitro.

Fabricação de matriz de cartilagem-derivado Decellularized andaimes

O objetivo do presente protocolo é a produção de fibras da matriz extracelular toda alvejado para reparação da ferida que são apropriados para avaliação pré-clínicos como parte de um implante de andaime regenerativa. Estas fibras são produzidas pela cultura de fibroblastos nas membranas de fibra oca e extraídas por dissolução das membranas.

Produção de fibras da matriz extracelular através de cultura de células de membrana de fibra oca Sacrificial

A matriz extracelular descelularizada (dECM) pode fornecer pistas microambientais adequadas para recapitular as funções inerentes dos tecidos-alvo em uma construção projetada. Este artigo elucida os protocolos para a descelularização do tecido pancreático, avaliação do bioink dECM derivado do tecido pancreático e geração de construções de tecidopanpático 3D usando uma técnica de bioimpressão.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

Este protocolo destaca um método para avaliar rapidamente a biocompatibilidade de uma nanocelulose cristalina (CNC)/agarose tinta biomaterial de hidrogel composto com células de mastro derivadas da medula óssea em termos de viabilidade celular e expressão fenotípica dos receptores de superfície celular, Kit (CD117) e receptor IgE de alta afinidade (FcεRI).

Fabricação de uma nanocelulose cristalina incorporada tinta biomaterial agarose para cultura de célula de mastro derivada da medula óssea

Neste trabalho, um protocolo de decelularização foi otimizado para obter matrizes descelularizadas do músculo esquelético fetal de camundongos. Os mioblastos C2C12 podem colonizar essas matrizes, proliferar e diferenciar-se. Este modelo in vitro pode ser utilizado para estudar o comportamento celular no contexto de doenças musculares esqueléticas, como as distrofias musculares.

Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular

O protocolo elucida duas metodologias distintas de decelularização aplicadas a tecidos pulmonares bovinos nativos, fornecendo um relato abrangente de suas respectivas caracterizações.

Desenvolvimento e caracterização de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada

A matriz descelularizada do baço (DSM) tem aplicações promissoras no campo da engenharia de tecidos hepáticos. Este protocolo descreve o procedimento para preparar o DSM de ratos, que inclui a coleta de baços de ratos, descelularizando-os por meio de perfusão e avaliando o DSM resultante para confirmar suas características.

Fabricação de matriz de baço descelularizada derivada de ratos

Este protocolo descreve a fabricação de construções ósseas 3D utilizando osteócitos humanos embutidos em hidrogéis de gelatina metacrilada (GelMA) suplementados com matriz extracelular descelularizada. O método é de baixo custo, escalável e compatível com equipamentos laboratoriais básicos, fornecendo uma plataforma translacional para o estudo dos processos de doenças musculoesqueléticas.

Uma plataforma de cultura óssea 3D usando osteócitos humanos e matriz extracelular descelularizada para modelagem de doenças musculoesqueléticas

Aprenda a co-impressão de componentes sintéticos e biológicos para criar scafolds de engenharia tecidual usando PCL e matrizes descelularizadas. Este método melhora as condições de cultivo celular.

Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes

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