Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da neurociência de sistemas. Como a atividade dos conjuntos neuronais suporta o processamento sensorial e cognitivo no cérebro. A principal vantagem desta técnica é que ela facilita o direcionamento preciso de proteínas optogenéticas como a rodopsina chan e GCaMP para regiões de interesse cerebral, sem exigir um procedimento separado de injeção de vírus.

A demonstração visual deste método é fundamental, pois a deposição de seda e vírus para pequenos implantes ópticos pode tomar alguma prática para alcançar resultados reprodutíveis. Primeiro, misture a AAV descongelada e de cinco a sete pontos cinco por cento de fibroin de seda aquosa em uma proporção de um para um em um tubo PCR de 200 microliter. Pipeta suavemente a solução várias vezes para misturar completamente o AAV e a fibroina.

Para depositar a seda/AAV, carregue uma pipeta de injeção com a quantidade de solução necessária para o número de implantes de fibras que estão sendo feitos, além de aproximadamente 30% extra para acomodar perdas devido ao entupimento da pipeta. Em seguida, monte um suporte de ferrule em um aparelho estereotaxico equipado com um microinjetor. Coloque o suporte de ferrule acima do microinjetor e aplique a mistura seda/AAV de baixo.

Manobrar a pipeta de injeção até que ela esteja tocando ou quase tocando o centro da superfície de fibra óptica, e ejete de 10 a 20 nanolitadores de solução de seda/AAV. Então, retire a pipeta. Em seguida, observe o bolus de seda/AAV na superfície plana que aparece como uma cúpula líquida que seca para uma película plana dentro de aproximadamente um minuto.

Repita as etapas anteriores até que a quantidade desejada de seda/AAV seja depositada. Ao preparar vários implantes, aplique a solução de seda/AAV em um implante e, em seguida, passe para revestir outros implantes, antes de retornar ao primeiro. Após uma hora de secagem, coloque todo o suporte de ferrule em uma câmara de vácuo e desmássee o vácuo durante a noite a aproximadamente 125 torr e quatro graus Celsius.

No dia seguinte, avalie a forma e a posição do filme de seda resultante sob um microscópio de alta potência. Certifique-se de que os filmes estão confinados à ponta da superfície de fibra óptica, relativamente fina e simétrica. Para o revestimento de fibras ópticas afiladas, posicione a pipeta de injeção de seda/AAV contra a lateral da fibra óptica no início do taper, certificando-se de que a pipeta está tocando a fibra óptica.

Ejete 20 nanoliters de seda/AAV para iniciar o processo de revestimento, garantindo que a gota adere à fibra óptica e permaneça na interface da fibra e pipeta. Leve a gota no final da ponta da fibra à medida que a seda/AAV seca, e mantenha a pipeta de injeção em contato com a gota de secagem para evitar entupir a ponta da pipeta. Quando o primeiro bolus estiver quase completamente seco, ejete outros 20 nanolitadores e continue ateando a gota ao longo da fita.

Repita a etapa anterior ejetando pequenas quantidades de seda/AAV e secando gradualmente a solução até o lado do afunilador. Após a secagem, avalie a forma e a posição do filme de seda resultante sob um microscópio de alta potência. Para revestir implantes de lentes GRIN, deposite seda/AAV em uma única injeção em um implante de lente GRIN.

Após a secagem, avalie a forma e a posição do filme de seda resultante sob um microscópio de alta potência para garantir que o filme cubra a superfície da lente. Para revestimento de janelas cranianas de vidro, pipeta manual uma gota de cinco microliter de seda/AAV sobre a superfície de um deslizamento de cobertura redonda de três milímetros de modo que a gota se espalhe para cobrir toda a superfície de vidro. Após a secagem, armazene as fibras ópticas revestidas de seda/AAV em um desiccador de vácuo resfriado a 125 torr e quatro graus Celsius antes de implantar os dispositivos.

Imagens de fluorescência de proteínas optogenéticas marcadas por fluoróforo forneceram uma medida da extensão da expressão dos filmes de seda/AAV, e as fibras ópticas típicas podem facilmente acomodar 200 nanoliters de seda/AAV. Com a prática, os experimentadores podem alcançar uma expressão altamente confiável em torno da ponta das fibras implantadas. Dois possíveis problemas com janelas cranianas revestidas são expressão insuficiente, e filmes de seda que não se dissolvem, e obscurecem o campo de visão.

Para aumentar a expressão, uma durectomia pode ser realizada antes de implantar a janela, e/ou aumentar a quantidade de vírus no filme. A melhor expressão foi alcançada utilizando uma mistura de seda e aav de titulação, respectivamente. A quantidade de seda em janelas revestidas é 10 a 100 vezes mais do que em implantes de fibras, e o filme é menos embutido no tecido, e, portanto, pode não ser exposto aos mesmos níveis de atividade proteolítica que podem dissolver filmes de seda.

No entanto, a presença de alguma seda é essencial para alcançar sua expressão sob janelas, provavelmente porque um filme feito de vírus sozinho é lavado pelo fluido intersticial durante a cirurgia. Ao tentar este procedimento, é importante preparar e armazenar implantes revestidos de seda da maneira que descrevemos. O armazenamento inadequado pode alterar as propriedades dos filmes de seda ou diminuir a eficácia dos vetores de expressão viral.

Essa técnica pode ser de grande utilidade para pesquisadores do campo da neurociência de sistemas explorarem como a atividade neural impulsiona o processamento sensorial e cognitivo nos cérebros de mamíferos como camundongos, ratos ou mesmo primatas não humanos. Não se esqueça que trabalhar com vetores de expressão viral pode ser perigoso e equipamentos de proteção individual, como luvas, óculos e jalecos, devem ser sempre usados enquanto trabalham com vírus associados ao Adeno.