Name: Uma abordagem imparcial de amostragem TEM seções em neurociência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprenda uma abordagem imparcial de amostragem TEM para análise de tecido cerebral em neurociência. Este método automatizado minimiza a intervenção do usuário e melhora a quantificação de sinapses em microscopia eletrônica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiado pelo número de projeto de fundo de ciência austríaco, FWF, P 29370 B27

<ol><li>Howard, V., Reed, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+V+%22Unbiased+Stereology%3A+Three-Dimensional+Measurement+in+Microscopy%22">Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy</a>. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).</li>
<li>Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-changes+of+brain+synapses+and+synaptic+plasticity+in+response+to+an+enriched+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment.</a> Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).</li>
<li>Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+in+adult+barrel+cortex+following+naturalistic+environmental+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment.</a> Neuroscience. 199, 143-152 (2011).</li>
<li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+unbiased+counting+method+for+the+quantification+of+synapses+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).</li>
<li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+induces+behavioural+disturbances+in+neuropeptide+Y+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice.</a> Scientific Report. 6, 28182(2016).</li>
<li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Tissue+Samples+from+the+Placenta%3A+An+Illustration+of+Principles+and+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies.</a> Placenta. 29, 1-14 (2008).</li>
<li>Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Golgi+structure+using+EM%3A+combing+volume-SEM+and+stereology+for+higher+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput.</a> Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).</li>
<li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+stereological+tools%3A+disector%2C+fractionator%2C+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Elsevier/Academic Press. (2008).</li>
<li>Lewis, P. R., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLewis%2C+PR+%22Staining+Methods+for+Sectioned+Material%22">Staining Methods for Sectioned Material</a>. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).</li>
<li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li>
<li>Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+induces+synaptic+structural+modification+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).</li>
<li>Lonetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+environmental+enrichment+moderates+the+behavioral+and+synaptic+phenotype+of+MeCP2+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice.</a> Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O fluxo de trabalho apresentado aqui permite que o pesquisador obter dados sobre as características ultra-estruturais de forma imparcial. Isto é muito menos demorado do que as investigações de volume de seções seriais. Vários aplicativos diferentes são usados para atingir esse objetivo. Em primeiro lugar, nosso software feito sob medido do RPS (para detalhes sobre a disponibilidade, favor contatar o autor correspondente) é usado para introduzir um estágio aleatório-shift para selecionar as coordenadas da área de amostragem. Isto permite uma amostragem sistemática uniforme do ROI. Em seguida, para a contagem de estruturas específicas, adaptamos o método disector, onde 2 seções consecutivas com distância conhecida são comparadas, em uma forma nova, em comparação com anteriores estudos13,14,15 como usamos nossos feito por software RPS para amostragem aleatória uniforme sistemático. Isso economiza tempo em comparação com 3D-reconstruindo toda volumes das seções de seriais. O software feito sob medido do RPS é desenvolvido especificamente para um tipo de microscópio, que é um fator limitante para a reprodução de fluxo de trabalho. Uma alternativa deste software específico seria um aplicativo que permite a execução de scripts e é compatível com outros modelos de microscópio.
Com sucesso, usamos esta abordagem para nossos estudos comparativos4,5. Em seções ultra-finas de tecido neuronal, a área de interesse foi delineada e imagens foram tomadas por amostragem sistemática uniforme dentro desta área. Deve notar-se que a área de interesse, a camada de polimorfo de giro do pectínea, é uma área bastante pequena para investigar o que pode ser benéfico para a nossa abordagem. Dentro de um disector colocado aleatoriamente, foram avaliados o número de DCV e várias características ultra-estruturais de sinapses no DGpl de ratos adultos alojados em SE e EE, bem como adulto WT ratos contra ratos adultos de nocaute NPY. Usando nossa abordagem, os dados coletados mostraram alterações em alguns dos parâmetros investigados. Estes resultados confirmaram os de outros estudos semelhantes em animais juvenil2.
Uma desvantagem do uso experimental de fluxo de trabalho pode ser que esta abordagem multi-aplicação não é ideal em termos de facilidade de utilização, como os usuários precisam para se sentir confortável com interfaces de usuário diferentes (no nosso caso, a interface do usuário, TEM seção Serial o RPS software e software de SerialEM). Aprendendo a lidar com todos os aplicativos de maneira eficiente é demorado e deve ser levado em conta. No entanto, investir o tempo para aprender a usar este fluxo de trabalho ainda é claramente favorável ao longo do tempo que é necessário para analisar toda volumes com serial seção TEM. O método de usar uma disector colocado por amostragem sistemática uniforme na área de interesse é suficiente para apresentar dados fiáveis1 sem a necessidade de investigar uma quantidade elevada de seções/volume.
Para maximizar o resultado em nossos estudos, foi vital para cuidar durante a preparação da amostra, bem como a preservação do tecido e as estruturas não é apenas crucial para a avaliação das características estruturais, mas também para identificar a área de interesse sem ambiguidade. Um fator crucial e talvez outra desvantagem desse método, é que uma alta qualidade dos pares de seções ultra-finas é necessária: não deve haver furos ou rugas que cobrem a área sob investigação em qualquer das seções, e a espessura de corte deve ser mantida homogênea. O pesquisador tem que ser bem treinados em Ultramicrotomia. Também tem que ser tomado quando da imagem latente as seções na temperatura, como as seções são sensíveis aos danos do feixe de elétron e podem facilmente se rasgar. Além disso, é importante escolher o número de áreas de amostragem no ROI. Dependendo do objetivo experimental, a ampliação das micrografias da elétron deve ser definido cuidadosamente. Para nossas experiências especificamente, contando as sinapses no sistema nervoso central, 20 regiões de interesse em uma seção com a área de 30.25 µm2 são ótimos. É aconselhável treinar o pessoal bem em reconhecer as características em questão (no nosso caso as sinapses, características sinápticas e DCV) para obter resultados fiáveis. A fim de identificar as sinapses, as vesículas sinápticas devem ser identificáveis e isso requer uma resolução de pelo menos 10 nm. Por isso, uma ampliação de 5000 X foi ideal, mas deve notar-se que a ampliação depende de parâmetros de hardware, tais como o tipo e a posição das câmeras e precisaria ser adaptado para outros tipos de microscópio e/ou câmera. Também tem de se notar que o protocolo usa aplicativos específicos para um TEM e que os usuários com outros modelos tem que considerar as diferenças na configuração.
Acreditamos que nosso fluxo de trabalho pode ser adaptado para muitas outras aplicações, não só em neurociência, mas em um amplo campo de ciências biológicas e também a ciência de materiais (quando a alta resolução de um TEM é necessário) sempre que a questão de pesquisa exige um sistemático uniforme amostragem aleatória e a quantidade de amostras a analisar pede uma maneira eficiente de tempo de análise. Por exemplo, estamos atualmente interessados em Localizar lojas de ferro no cérebro humano. Por isso, recentemente nós adaptamos nosso fluxo de trabalho, para permitir a análise elementar de seções ultra-finas em áreas escolhidas aleatoriamente. A fim de minimizar o número de aplicativos que são necessários para o fluxo de trabalho, tivemos como objetivo aplicar usando o software de SerialEM só, porque pode ser programado para mover a fase pré-definir pontos que podem ser selecionados de forma aleatória. Nós criamos scripts personalizados para controlar a temperatura, com o objectivo de automatizando o fluxo de trabalho totalmente. Isto provou ser viável exceto a focagem automática no modo de imagem filtrado, que não deu resultado satisfatório. Assim, usamos software de DM para focar e para a obtenção de imagens energia filtrada.
Em resumo, apresentamos soluções de software que ajudam na obtenção de micrografias de elétron de uma forma imparcial.

Em microscopia eletrônica, muitas vezes é desafiador, para amostra representativas regiões em seções. Nós, como um observador, são muitas vezes tendenciosa para olhar para regiões específicas, atraídas a nossa atenção à conspícuas características da amostra, impedindo uma amostragem bem distribuída, imparcial. Viés de amostragem só pode ser evitado se cada parte da região de interesse Obtém a mesma chance de acabar em uma micrografia eletrônica1. É possível evitar o viés de amostragem sem uma solução de software, por exemplo, empurrando o trackball do microscópio manualmente sem olhar para a imagem, a fim de selecionar regiões de amostragem onde para o palco. Mas, estritamente falando, isto não é um procedimento aleatório, porque, consciente ou inconscientemente, o usuário pode ter uma influência sobre o movimento do palco, e, além disso, isto não é uma forma sofisticada de selecionar regiões de amostragem. Amostragem aleatória torna-se especialmente importante se pares de seções são usadas para avaliar o número de estruturas em um determinado volume, por exemplo, para stereology1, que exige que pares de seções, uma distância conhecida separada. Também seria possível olhar apenas para uma única seção e estimar o número de estruturas específicas2, mas com essa abordagem os investigadores tendem a superestimar a densidade numérica de estruturas maiores, a menos que as estruturas são muito pequenas em comparação com a espessura de corte. Abordagens alternativas são para reconstruir volumes de tecido do seriais seções e, assim, obter os dados desejados3. Mas isto é muito demorado e não uma abordagem viável para estudos comparativos (maiores).
Para superar esses problemas, nós desenvolvemos um fluxo de trabalho que permite que o pesquisador selecione automaticamente amostras para obtenção de micrografias de elétron no espaçamento regular dentro de seções ultra-finas. A posição de micrografias da elétron é aleatória, permitindo que a amostragem imparcial. A abordagem é adequada tanto para determinar a densidade numérica de estruturas (por exemplo, sinapses dentro de um determinado neurópilo volume4,5) e as dimensões das características estruturais (por exemplo, a largura da fenda sináptica, ou o diâmetro do densidade pós-sináptica4,,5).
O fluxo de trabalho usa um ponto aleatório feito por amostragem (RPS) software (escrito em Java script usando software de criação de scripts fornecido com nosso microscópio) que calcula automaticamente as posições de grade dentro de uma região predefinida de interesse em uma seção ultra fina. O software RPS move o palco o microscópio de elétron para estes pontos predefinidos, para que uma micrografia eletrônica pode ser feita em cada ponto. Primeiro, o usuário define uma região de interesse dentro da seção fina. Em seguida, o software RPS calcula as posições de grade dentro desta região. A x / y coordenadas da posição do primeira são criadas aleatoriamente, e as posições restantes são colocadas em intervalos de grade regular em relação à primeira posição. Porque cada parte da região de interesse tem a mesma chance de ser examinado, isto permite a coleta de dados mínima. Esta abordagem de amostragem também é chamada de amostragem aleatória uniforme sistemática (ver referências6,7 para mais detalhes).
Para a determinação da densidade numérica de estruturas, trabalhamos com pares de seções que estão separados a uma distância conhecida. Depois de obter uma micrografia eletrônica da primeira seção em uma das posições predeterminadas, software TEM seção Serial (parte do pacote de software fornecido com nosso microscópio de elétron) move-se para o ponto correspondente na segunda seção, a fim de obter uma micrografia eletrônica da localização correspondente. Isto é repetido para cada localização na grade pré-determinada. Em nossa abordagem, um disector é usado para contar o número de partículas em cada par de elétron-micrografias8,9. Um disector consiste em um par de quadros contando, uma para cada seção8,9. A densidade numérica de objetos é determinada por apenas contando objetos visíveis na primeira seção (ou seção de referência), mas não na segunda seção (ou seção de pesquisa). Isto permite estimar a densidade numérica de objetos em uma maneira rápida e eficiente de8,9. Além em seções única, bidimensionais características estruturais podem ser medidas.
Nós aplicamos este fluxo de trabalho com sucesso para avaliar as diferenças em números de sinapse no hipocampo de ratos expostos ao ambiente enriquecido (EE) em relação ao ambiente padrão (SE) habitação condições4,5, de condições de alojamento e também para avaliar as diferenças ultraestrutural entre ratos de tipo selvagem (WT) e o neuropeptídeo Y (NPY) KO ratos mantidos sob SE e EE5. Nosso objetivo foi olhar especificamente para as características estruturais dos neurônios, tais como a densidade sináptica numérica, os comprimentos da zona activa em cortes transversais e da densidade pós-sináptica, a largura da fenda sináptica e o número de vesículas sinápticas, a fim de avaliar as mudanças na conectividade neuronal e ativação entre as diferentes condições experimentais. Além disso, estávamos interessados na densidade numérica das vesículas densas-núcleo (DCV) em neurônios para determinar a quantidade de neuropeptídeos armazenados em uma determinada área do cérebro.
Baseado no sucesso da nossa abordagem para os estudos descritos acima, no nosso próximo passo, adaptámos o nosso fluxo de trabalho para selecionar áreas para análise elementar imparcial dentro de amostras de cérebro humano. Isto foi feito de ferro, imagem, que é armazenado em moléculas de ferritina em neurônios e células gliais. Por isso, compilamos um script que nos permitiu automatizar a maioria das operações para um processo de seleção aleatória de seções do cérebro em uma área definida.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Glutardialdeído</td><td>Science Services</td><td>E 16210</td><td>25%; 100ml; </td></tr><tr><td>Tampão de cacodilato</td> de grau EM <td>Merck</td><td>C4945</td><td>250g; Ácido dimetilarsínico trihidrato de</td></tr><tr><td>sódio Acetato de tionina/Ceristain</td><td>Merck</td><td>861340</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>Merck</td><td>1000631000</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Merck</td><td>1064951000</td><td>1 kg, pellets</td></tr><tr><td>tetraóxido de ósmio</td><td>Science Services</td><td>E 19110</td><td>10x1g</td></tr><tr><td>TAAB resina de incorporação</td><td>Science Services</td><td>TAT001</td><td>500g</td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Science Services</td><td>TAD024</td><td>100g</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Science Services</td><td>TAD025</td><td>500g</td></tr><tr><td>Acetato de uranila di-hidratado</td><td>Plano GmbH</td><td>19481</td><td>esgotado, 25g</td></tr><tr><td>Ultrastain 2</td><td>Leica</td><td>16707235</td><td>Citrato</td></tr> de <tr><td>chumbo Solução azul de toluidina</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1727</td><td>10g</td></tr><tr><td>Piolofórmio</td><td>Plano GmbH</td><td>R1275</td><td>10g Pó</td></tr><tr><td>Proylenoxide</td><td>SigmaAldrich</td><td>82320-1L</td><td>1L</td></tr><tr><td>DPX Meio de embutir</td><td>Plano GmbH</td><td>R1320</td><td>Meio de embutir para seções semifinas em lâmina de vidro, 50 ml</td></tr><tr><td>Vibratome, Leica VT 1000</td><td>Leica Microsystems, Viena, Áustria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Ultracut UCT, ultramicrotom</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 20</td><td>FEI, Eindhoven, Holanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera grande angular Megaview</td><td>Olympus Soft Imaging Solution, M&uuml; nster, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.U. 1000 câmera digital</td><td>Gatan, Pleasanton, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Imaging Analysis Software</td><td>FEI, Eindhoven, Holanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEI Serial Section Software</td><td>FEI, Eindhoven, Holanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji, ImageJ 1.52e</td><td>Instituto Nacional de Saúde, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 20.0</td><td>SPSS Inc., Chicago, IL, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>Regentes da Universidade do Colorado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPS (amostragem de ponto aleatório) software 0.9a</td><td>feito</td><td></td><td></td>sob medida</tr><tr><td>Disector v1.0.2 (macro ImageJ)</td><td>feito sob medida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EFTEMSerialEM (script SerialEM)</td><td>feito sob medida</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uma abordagem imparcial de amostragem tem seções em neurociência

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigações sobre as características ultra-estruturais de neurônios e suas sinapses só são possíveis com microscopia eletrônica. Especialmente para estudos comparativos das mudanças na densidade e distribuições de tais características, um protocolo de amostragem imparcial é vital para resultados confiáveis. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para a aquisição de imagens de amostras de cérebro. O fluxo de trabalho permite a amostragem aleatória uniforme sistemática dentro de uma região do cérebro definidos, e as imagens podem ser analisadas usando um disector. Esta técnica é muito mais rápida do que o exame aprofundado das seções seriais mas ainda apresenta uma abordagem viável para estimar as densidades e distribuições de características de ultra-estrutura. Antes da incorporação, seções manchadas vibratome foram usadas como referência para identificar a região do cérebro sob investigação, processo que ajudou acelerar a preparação da amostra global. Esta abordagem foi utilizada para estudos comparativos, investigando o efeito de um ambiente enriquecido-habitação em vários parâmetros ultra-estruturais no cérebro do rato. Baseado no uso bem sucedido de fluxo de trabalho, adaptamos para efeitos de análise elementar de amostras de cérebro. Nós aperfeiçoamos o protocolo em termos do tempo de interação com o usuário. Automatizar todas as etapas demoradas através da compilação de um script para o software de código aberto SerialEM ajuda o utilizador a focar o trabalho principal de adquirir os mapas elementares. Como o fluxo de trabalho original, nós pagamos a atenção à abordagem imparcial de amostragem para garantir resultados confiáveis.

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho para selecionar as áreas de temperatura de forma automática e imparcial. O usuário seleciona a área de interesse dentro de uma seção ultra fina sob a temperatura e usa várias soluções de software para o fluxo de trabalho, incluindo o nosso software RPS que automaticamente calcula as coordenadas de 20 áreas de amostragem dentro da área de interesse. Em seguida, o palco TEM é movido para cada área de amostragem para a fotografia. Isso é possível tanto para a análise de seções única e para a análise de pares de seções, uma distância conhecida, que permite a seleção de áreas para geração de imagens sem o viés do investigador.
Este fluxo de trabalho provou ser valioso quando documentar características ultra-estruturais em54,seções do cérebro do rato. Nesses estudos, a camada de células polimorfo de giro do pectínea (DGpl) analisou-se como uma área de interesse. Nosso método revelou adequado para examinar o DG, porque uma secção coronal da DG dorsal (Bregma −1.3) se encaixa em uma seção ultra fina e seus contornos são facilmente reconhecidos em baixa ampliação. Se outras regiões do cérebro eram para ser examinado, seria importante verificar seu tamanho e características distintivas antes de planejar os experimentos.
Aplicar o fluxo de trabalho descrito aqui mostrou que a habitação EE aumenta a largura da fenda sináptica significativamente na DGpl4, em respeito às condições de habitação padrão. Além disso, o número de vesículas de núcleo denso foi diminuiu significativamente no animais alojados em EE4, indicando as alterações do agregado familiar de neuropeptídeos. Quando ratos do KO WT e NPY eram mantidos sob condições EE, o número de neurônios/µm³ no DGpl aumentou, enquanto a densidade de DCV diminuiu em relação à habitação-SE5. Em contraste, nocaute NPY resultou em um aumento significativo das vesículas sinápticas na piscina Reserva (vesículas sinápticas desencaixadas) independente da habitação condições5. O efeito de EE na largura da fenda sináptica inverteu-se no grupo NPY KO, resultando em uma diferença significativa entre alojados em EE WT e NPY KO ratos5. Tomados em conjunto com estudos comportamentais de WT e NPY animais nocaute realizada sob ambos os tipos de condições de habitação, isso indica um papel crucial de NPY os efeitos neurobiológicos da EE5.
Para poder visualizar o ferro armazenado no cérebro humano, um script foi compilado por SerialEM software para escolher aleatoriamente os pontos de aquisição de dentro de uma seção inteira ultrafino, com o objectivo de obter uma energia filtrada micrografia eletrônica em cada um destes pontos . Após carregar a seção para o microscópio de elétron, o script realizada a estabilização da seção (i. e., a rotina de 'espécime cozinha') durante a noite. O script então selecionados aleatoriamente um número de pontos predefinidos pelo usuário daqueles marcados com uma grelha na Figura 3. Por produzir uma micrografia de teste e verificar seus níveis de cinza, o script verificado se os pontos escolhidos foram localizados em uma parte visível da seção, rejeitando os pontos que desembarcaram nas barras da grade. Maior parte do fluxo de trabalho foi tratada pelo script com interação mínima do usuário. No entanto, não foi possível gravar automaticamente micrografias de energia filtrada (com esta configuração), como não havia muito pouca luz para a rotina de focagem automática de SerialEM. Portanto, nós mudamos a DM software assim que o script do palco para cada ponto, ajustado o foco manualmente e fez uma imagem EFTEM de ferro. Um exemplo de uma imagem de ferro EFTEM do cérebro humano post mortem é mostrado na Figura 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> Figura 1. Ilustração de fluxo de trabalho. (A) as principais etapas da preparação da amostra são mostradas (no sentido da seta): seções de vibratome (i), embedding(ii), cortar seções semi finas e ultrafinas (iii) e pegando pares de seções ultra-finas em grelhas de cobre (iv). (B) uso de tanto do fornecedor microscópio software e software de RPS feitos sob medida para criar coordenadas de área de amostragem que determinam os locais de gravação. Os pontos de canto das seções são armazenados no software microscopia e o ROI é descrito (identificado com a ajuda das seções semi finas) (i); uma grade de áreas de amostragem é gerada sobre o ROI, uma mudança aleatória (seta vermelha) é introduzida em x e y. O turno é menor que a distância entre as áreas de amostragem, (setas pretas), para que em vez dos quadrados pretos, que não têm nenhuma mudança, os quadrados azuis, que são deslocados aleatoriamente, são usados para determinar os locais de gravação (ii); áreas de amostragem apenas dentro das fronteiras do ROI (desenhado como quadrados pretos e azuis) são utilizadas para gravação. Micrografias são feitas na seção de referência (quadrados pretos) e em locais correspondentes na seção de pesquisa (quadrados azuis) (iii). (C) uma micrografia é feita em cada área de amostragem em uma ampliação suficiente; uma montagem que consiste de várias imagens mescladas é feita se necessário (no caso, 2 x 2 imagens foram fundidas juntos) (i); um quadro de contagem é gerado e mostrado como uma sobreposição na imagem, estruturas dentro do quadro e nas 'linhas de aceitação' (quadro tracejado linhas) serão contadas, mas não aqueles nas 'linhas proibidas' (linhas de frame contínuo) (ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> Figura 2 . Medir parâmetros ultra-estruturais em um par de seções ultra-finas com um quadro de contagem imparcial. (A) visão geral do windows ImageJ usado para contagem e análise de estruturas celulares. Lado esquerdo mostra a micrografia eletrônica com o quadro de contagem como uma sobreposição. Do lado direito: interface de usuário do ImageJ (retângulo azul) com o menu drop-down (topo) e a barra de ferramentas (abaixo); o editor de objeto de ObjectJ (retângulo verde); a janela de Ferramentas de ObjectJ (retângulo laranja) onde as ferramentas de medição podem ser selecionadas e a janela de resultados ObjectJ (retângulo preto) onde todas as medições são documentadas. (B) detalhe de um mostrando as sinapses marcadas sobre a micrografia eletrônica (sinapses em ambas as seções - setas; sinapse apenas sobre as seção de pesquisa-pontas de seta). Aqueles são marcados usando a ferramenta multiponto (círculo vermelho) da barra de ferramentas no ImageJ. (C) os nomes e parâmetros de medição das características sinápticas são definidos usando as Ferramentas de ObjectJ. A Ferramenta de marcador e a característica de interesse são selecionados e o contorno desenhado na imagem pela esquerda-rato-cliques ao longo da estrutura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> Figura 3. Seleção de áreas para mapeamento elementar dentro um ROI para microscopia eletrônica de transmissão energia filtrada de amostragem. SerialEM é usado para selecionar uma região de interesse e sugerir um elevado número de áreas de amostragem em um espaçamento regular (rosa cruzes nas imagens A e B). Em seguida, um script seleciona aleatoriamente áreas de amostragem (a partir destas coordenadas predefinidas) para aquisição. Áreas de amostragem com iluminação pobre são rejeitadas para evitar barras de grelha e as paradas do roteiro, assim como 20 áreas de amostragem bem iluminados foram selecionadas dentro do ROI. (A) visão geral de toda a área de interesse, delineado por um polígono, com um elevado número de áreas de amostragem possível marcados com x. (B) detalhe de A, mostrando as áreas de amostragem antes de seleção aleatória. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> Figura 4. Exemplo de aquisição de mapa elemental (EFTEM). (A) Micrografia TEM campo claro da área em torno do ponto de aquisição. Uma área selecionada aleatoriamente foi usada para obter um mapa elementar e é marcada por um retângulo preto. (B) EFTEM pre-borda da imagem de janela na área selecionada aleatoriamente. (C) EFTEM pós-borda da imagem de janela na mesma área. (D) mapa elementar de ferro da mesma área (M-edge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Nós introduzimos um romance de fluxo de trabalho para investigações de microscopia eletrônica do tecido cerebral. O método permite ao usuário examinar características neuronais de forma imparcial. Para a análise elementar, apresentamos também um script que automatiza a maior parte do fluxo de trabalho por amostragem aleatória.

Uma abordagem imparcial de amostragem TEM seções em neurociência

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Um protocolo de amostragem imparcial é vital para microscopia eletrônica. Se você quiser quantificá-lo em densidade numérica de sinapses ou outras estruturas em uma determinada área cerebral, a principal vantagem de nossa técnica é que ela é imparcial, e permite produzir automaticamente micrografos eletrônicos com mínima intervenção do usuário. Essa técnica também é valiosa em outras áreas de pesquisa, como a neurociência, onde pode ser usada na avaliação da força de uma rede neural.Para aplicar nosso protocolo, é necessário ter experiência em técnicas microscópicas eletrônicas, como preparação de amostras e operação de um microscópio eletrônico de transição. Demonstrando nosso procedimento será o Dr. Stefan Wernitznig, um pós-doutor do meu laboratório. Este protocolo consiste em preparar amostras cerebrais para microscopia eletrônica, cortando pares de seções finas.Em seguida, ele descreverá como produzir automaticamente um número definido de micrografos eletrônicos em uma área de interesse. Em seguida, usará um quadro de contagem para avaliar a densidade numérica das características estruturais. Para começar, dissecar, corrigir, corrigir e incorporar amostras de interesse para incorporar resina, seguindo junto com o protocolo de texto que acompanha.Em seguida, coloque a amostra em um ultramicroome e produza seções de série ultra finas de 55 nanômetros. Coloque as seções em uma grade de ranhura com as dimensões de um milímetro por dois milímetros, revestidas com forma de piola. Em seguida, contra-retiver as seções ultra finas nas grades de ranhura usando acetato de 2%deuranyl por 30 minutos, seguido por citrato de chumbo por 30 segundos em temperatura ambiente.Coloque a grade no TEM e examine as seções na grade com o TEM usando uma baixa ampliação para orientar e avaliar a qualidade das seções. Em seguida, inicie o software tem serial section, selecione Seção e escolha Inserir para adicionar os pontos de canto para a seção de referência e pesquisa. Siga as instruções da janela pop-up.Comece com a seção de referência e continue com a seção de procuração. Certifique-se de que as bordas da seção são paralelas à próxima seção, pois os pontos um e dois são inseridos. Em seguida, visualize a seção de referência sob baixa ampliação para identificar a região de interesse.Mova o estágio do microscópio usando a análise de imagem TEM na seção de referência para vários pontos de canto do ROI para criar um contorno do ROI. Registo as coordenadas do polígono resultante usando o software Random Point Sampling. Para isso, pressione Adicionar coordenadas na caixa de diálogo do software random point sampling em cada ponto do polígono necessário para delinear o ROI na seção.Em seguida, defina e insira um tamanho adequado para as áreas de amostragem e distâncias entre as áreas no software random point sampling. Em seguida, pressione Calcular Raster para gerar coordenadas de forma sistemática, uniforme e aleatória para as posições do micrografo dentro do polígono. Armazene os pontos de amostragem nas seções de referência e pesquisa, usando o software Random Point Sampling e o software TEM Serial Section.Estas são as coordenadas das montagens que são gravadas depois. No software Random Point Sampling, pressione ir para a próxima posição para mover o estágio do microscópio para as coordenadas x e y de cada área de amostragem na seção de referência. Em seguida, selecione Localização e escolha Inserir para importar essas coordenadas no software seção serial TEM na seção de referência.Repita isso para todas as coordenadas. Para espelhar as coordenadas da seção de referência na seção de pesquisa, selecione Seção e escolha Ir para Seção. Digite o número da seção de procuração na janela de diálogo.Para a gravação das montagens, altere entre a seção de referência e procuração, conforme descrito anteriormente, e altere a posição na seção de referência com localização e vá para o número. Escolha a próxima coordenada na janela de diálogo. Para as montagens serialem, em cada coordenada de amostragem, vá para Arquivo e escolha Nova Montagem no menu suspenso.Selecione o número certo de telhas e a porcentagem de sobreposição na janela de diálogo. Para o presente estudo, basta reconhecer as características sinápticas do estudo. Mas o campo de visão limitado da câmera CCD exigia fazer montagens de duas por duas imagens.As montagens são feitas para SerialEM. Antes de gravar cada montagem, reajuste o foco ou ative a opção de foco automático no software de gravação. Escolha a pasta para salvar o arquivo de montagem e inicie a gravação da montagem pressionando Iniciar no subempresa de montagem, à esquerda no SerialEM.Inicie o microdissetor e defina o tamanho do quadro de contagem e o número de segmentos conforme necessário. Conte a densidade da sinapse usando a macro dissecador. Utilizando a ferramenta de vários pontos localizada na barra de ferramentas, limite as sinapses que se cruzam com as duas linhas proibidas do dissetor, mas contam sinapses nas linhas de aceitação opostas.Marque cada sinapse dentro do quadro de contagem que é visível na seção de referência, mas não visível na seção de procuração, com uma seleção oval. Para medir os parâmetros da sinapse, selecione apenas as sinapses com uma fissura sinapática orientada em seção transversal que está na seção de referência. Isso deve estar dentro dos mesmos quadros de imagem usados para o dissetor.Em seguida, vá para Plugins e, em seguida, para Analisar e iniciar o ObjectJ plugin a partir do menu suspenso. Abra um novo projeto a partir da caixa de diálogo drop-down do ObjectJ que abrirá uma janela que permite ao usuário delinear e marcar estruturas com a ferramenta marcador. Primeiro, use a ferramenta marcadora para medir o comprimento da membrana pré-sináptica e o comprimento da densidade pós-sináptica, desenhando uma linha ao longo da estrutura.Em seguida, obtenha a largura média da fissura sináptica desenhando um polígono, cobrindo tanto a membrana pré quanto pós-sináptica. Para determinar o número de vesículas ancoradas, conte todas as vesículas que têm uma distância máxima da membrana pré-sináptica de um diâmetro vesícula ou menos. Em seguida, determine o número de vesículas desencaixadas contando as vesículas com uma distância máxima de um diâmetro vesícula acoplado ou outras vesículas desencaixadas na mesma sinapse.Uma versão adaptada do protocolo permite análises elementares em locais obtidos imparcialmente dentro da seção ultra fina. Para isso, no modo de imagem TEM, inicie o SerialEM e abra um novo projeto. Em seguida, abra o Navegador e verifique as configurações da câmera nos controles de câmera e script para ver e gravar e iniciar a visualização.Para fazer um mapa de canto da seção ultra fina, escolha Adicionar pontos na janela Navegador. Em seguida, coloque os pontos de canto nas bordas de uma seção ultra fina. Mova o palco para um ponto de canto segurando a chave do mouse direito.Quando um canto da seção for atingido, adicione um ponto de canto com um clique do mouse esquerdo. Repita o procedimento para adicionar mais três pontos de canto. Certifique-se de que na janela Navegador, a caixa C para pontos de canto esteja marcada para os pontos armazenados.Para iniciar a montagem do canto, vá até o Navigator na barra de menu SerialEM e escolha Montaging Grids e Setup Corner Montage no menu suspenso. Escolha Adicionar Polígono na janela Navegador e delineie a região de interesse com vários cliques do mouse direito. Em seguida, escolha Adicionar grade de pontos no menu suspenso do Navegador e defina uma distância entre os pontos.Inicie o script EFTEMSerialEM, siga os comandos de script, digite o número de pontos de grade como mostrado no Navegador e digite o número de pontos de aquisição. Em seguida, defina o limiar de iluminação para que o script possa evitar barras de grade. Siga os comandos de script e mova o palco manualmente para cobrir o campo de visão por um quarto da barra de grade.De acordo com o valor exibido, digite um valor de iluminação limiar superior ao valor exibido. Aguarde até que os pontos para aquisição sejam selecionados e a rotina de cozimento esteja concluída. Isso leva muito tempo e pode ser feito da noite para o dia.Após a configuração para análise elementar TEM filtrada por energia, adquira um mapa elementar com configurações específicas de elementos. A abordagem amostral imparcial é útil para contar e analisar características sinápticas em regiões cerebrais específicas. Além disso, o script EFTEMSerialEM para o software SerialEM permite escolher aleatoriamente os pontos de aquisição de dentro de uma seção ultra fina, com o objetivo de obter um micrografo eletrônico filtrado por energia em cada um desses pontos.O script selecionou aleatoriamente uma série de pontos, pré-definidos pelo usuário daqueles marcados com uma classificação. Ao produzir um micrografo de teste e verificar seus níveis de nota, o script verificou se os pontos escolhidos estavam localizados em uma parte visível da seção, rejeitando os pontos que pousaram nas barras de grade. A maior parte do fluxo de trabalho foi manuseada pelo script, com pouca interação do usuário.No entanto, com a amostra mostrada aqui, havia pouca luz para a rotina de foco automático do SerialEM. Portanto, assim que o roteiro mudou o palco para cada ponto, o foco foi ajustado e um mapa elementar foi feito de ferro. É importante selecionar cuidadosamente a região de interesse e garantir que o mesmo número de pontos amostrais caia em cada área de interesse.Não se esqueça que muitos dos produtos químicos usados para a preparação dos espécimes são tóxicos. Então use um jaleco e luvas de proteção e trabalhe sob uma capa de fumaça.

an-unbiased-approach-of-sampling-tem-sections-in-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Bancário cérebro e amostragem sistemática de material biológico fornece a base para estereologia imparcial e maximiza o potencial de dados obtidos de cada espécime.

Banking cérebro: Fazer oa maioria de espécimes sua Pesquisa

A organização anatômica do cérebro dos primatas podem fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos. Estereologia imparcial é um método para estimar com precisão e eficiência o número de neurônios total (ou outro tipo de célula) em um espaço de referência...

Sabendo o que conta: Estereologia Imparcial no cérebro de primatas não humanos

O perfilamento da expressão de RNA em regiões discretas do cérebro de camundongos exige uma estratégia precisa e repetível de coleta de tecidos. Aqui é descrito um protocolo que utiliza o seccionamento coronal do cérebro e a microdissecação assistida por perfurador de tecidos. O rendimento e a qualidade do RNA total obtido a partir das amostras resultantes confirmam a utilidade do método descrito.

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

Usamos magneto-e eletroencefalografia (MEG / EEG), combinado com informações anatômicas capturado por ressonância magnética (MRI), para mapear a dinâmica da rede cortical associado à atenção auditiva.

Mapeamento Dynamics cortical MEG simultâneas / EEG e anatomicamente constrangido mínima norma-Estimativas: um exemplo Atenção Auditiva

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.

Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

Aqui, apresentamos um método estereológico, o fraccionador óptico, usado para quantificar a formação de novos neurônios e sua sobrevivência, no hipocampo do rato após a estimulação eletroconvulsiva. Quando implementado corretamente, a sensibilidade e a eficiência dos métodos estereológicos garantem estimativas precisas com uma precisão fixa e predeterminada.

A técnica de fracionador óptico para estimar números de células em um modelo de rato de terapia eletroconvulsiva

Este artigo descreve um método simples para preparar pequenos cérebros de animais para a imagem latente de micro-CT, nas quais as lesões podem ser quantificadas e eletrodos localizados com elevada precisão no contexto do cérebro inteiro.

Um método de Micro-CT-baseado para caracterizar as lesões e localização de eletrodos nos cérebros de animais pequenos

Detalhamos como realizar uma meta-análise de estudos de neuroimagem baseados em voxel usando mapeamento d baseado em sementes com permutação de imagens de indivíduos (SDM-PSI).

Meta-análise de estudos de neuroimagem baseados em Voxel usando mapeamento d baseado em sementes com permutação de imagens de indivíduos (SDM-PSI)

Descrito aqui é um procedimento estereotático que pode atingir regiões cerebrais desafiadoras e de difícil acesso (devido a limitações espaciais) usando uma abordagem coronal angular. Este protocolo é adaptável tanto aos modelos de camundongos quanto a ratos e pode ser aplicado a diversas aplicações neurocientíficas, incluindo implantação de cânulas e microinjeções de construções virais.

Abordagem estereotática angular adaptável para técnicas versáteis de neurociência

Apresentamos um protocolo prático, passo a passo, rápido para remoção do cérebro do rato e dissecção de regiões discretas de tecido cerebral fresco. A obtenção de regiões cerebrais para análise molecular tornou-se rotina em muitos laboratórios de neurociência. Essas regiões cerebrais são imediatamente congeladas para obter dados transcriômicos de alta qualidade para análise de nível de sistema.

Microdisseção do Cérebro de Camundongos em Regiões Funcional e Anatomicamente Diferentes

O protocolo mostra repetidas coletas de líquido cefalorraquidiano e sangue de ratos epilépticos realizadas em paralelo com a monitorização contínua por vídeo-eletroencefalograma (EEG). Estes são instrumentais para explorar possíveis ligações entre alterações em várias moléculas de fluido corporal e atividade convulsiva.

Amostragem de líquido cefalorraquidiano e sangue da veia lateral da cauda em ratos durante registros de EEG

Aprenda uma abordagem imparcial de amostragem TEM para análise de tecido cerebral em neurociência. Este método automatizado minimiza a intervenção do usuário e melhora a quantificação de sinapses em microscopia eletrônica.

Uma abordagem imparcial de amostragem TEM seções em neurociência

Explorar mais vídeos