Identificação de Mouse e repertórios de anticorpo humano por sequenciamento de próxima geração
15 de março de 2019
Aqui, descrevemos os protocolos para a análise e visualização da estrutura e constituição de repertórios de anticorpo toda. Isso envolve a aquisição da vastas sequências de RNA de anticorpo usando sequenciamento de próxima geração.
Neste vídeo, descrevemos um método simples e eficiente para visualizar e analisar um repertório de anticorpos em nível global. É possível descrever repertórios inteiros de células B em indivíduos e suas mudanças dinâmicas em resposta à estimulação imunológica. Este método pode ser aplicado para analisar amostras patológicas de pacientes de infecções virais emergentes e para obter os dados com uma visão sem precedentes sobre a patogênese da infecção.
Uma das áreas mais emocionantes para a aplicação é o controle de vacinas. A eficácia da vacina pode ser avaliada analisando a dinâmica do repertório global de anticorpos em indivíduos administrados por vacinas. O indivíduo é novo neste método pode precisar otimizar as condições de PCR porque a eficiência da amplificação genética de anticorpos depende dos tipos de materiais iniciais.
Fla-cher para identificação de amplicons de imunoglobulina. É importante demonstrar essas ações visualmente. Demonstrando o procedimento estarão a Srta. Sayuri Yamaguchi e o Sr. Hanbing Xue, um técnico e estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para iniciar este procedimento, disseque o tecido de um rato preto C57 de oito semanas de idade e passe-o através de uma malha de aço inoxidável com dois mililitros de PBS para obter células dispersas. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e centrífuga a 600 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione 800 microliters de tampão de lise ACK à pelota.
Incubar no gelo por dois minutos para lise os glóbulos vermelhos no tecido. Em seguida, lave as células teciduais três vezes usando três mililitros de PBS para cada lavagem. Centrifugar novamente a 600 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.
Descarte o supernascer e adicione 800 microlitadores de reagente de isothiocyanato fenol/guanidina à pelota e vórtice completamente. Incubar a 25 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de clorofórmio e agite manualmente por 15 segundos.
Incubar a 25 graus Celsius por dois minutos. Centrifugar a 12.000 vezes g e a 25 graus Celsius para separar as fases. Transfira a fase superior aquosa para um tubo fresco.
Adicione um volume de 70% de etanol. Vórtice brevemente e aplique esta mistura na coluna de giro de sílica. Elute o RNA com 30 a 100 microliters de água.
Depois disso, use um fluorômetro para quantificar a concentração inicial de RNA. Armazene o RNA purificado a menos 80 graus Celsius. Primeiro, sintetize o cDNA de primeira linha de dois a 10 microgramas do modelo total de RNA usando o primer 5'RACE CDS e o oligonucleotídeo SMART-PCR de acordo com as instruções do fabricante.
Para a imunoglobulina do camundongo, o PCR amplifica o DNA com polimerase de DNA de alta fidelidade, usando o primer dianteiro universal e primers reversos específicos da classe imunoglobulina, conforme descrito no protocolo de texto. Para a imunoglobulina humana, execute o primeiro PCR usando o primer dianteiro universal e primers reversos específicos da classe imunoglobulina com sequências de tag. Inclua as sequências de índice para cada amostra por segundo PCR usando primers de sequência de índice.
Em seguida, eletroforese qualquer um dos produtos PCR em um gel de 2%agarose. Visualize as bandas de DNA em um transilluminador UV e extirve a fatia de gel contendo a banda larga entre 600 e 800 pares de base. Adicione 10 microliters de solução de ligação de membrana por 10 miligramas de fatia de gel.
Misture e incubar a 50 a 65 graus Celsius até que as fatias de gel se dissolvam completamente. Em seguida, transfira a solução de gel para a coluna de rotação da membrana de sílica. Lave a coluna uma vez com tampão de lavagem e elute o DNA com 50 microliters de água sem nuclease.
Usando um fluorômetro, quantifique os amplicons purificados e acumule os amplicons de cada classe de imunoglobulina em quantidades iguais para sequenciamento de NGS. Depois disso, use uma eletroforese à base de microcapilary com chip de dimensionamento de DNA para determinar o tamanho e concentração das bibliotecas. Armazene as bibliotecas a menos 20 graus Celsius.
Primeiro, gerar uma planilha amostral do sequenciamento executado conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, descongele um cartucho de reagente e as bibliotecas. Faça uma solução normal de hidróxido de sódio 0,2 e dilua as bibliotecas para obter as concentrações molares desejadas.
Em seguida, enxágüe e seque a célula de fluxo e adicione 600 microlitadores da solução de biblioteca diluída e desnaturada no poço do cartucho de reagente, e inicie a execução de sequenciamento. Uma perspectiva de um repertório de anticorpos murinos como um todo pode ser obtida a partir de células ou tecidos como o baço, medula óssea, linfonodo ou sangue. Resultados representativos dos repertórios da cadeia de luz IgM, IgG1, IgG2c e imunoglobulina de um baço de rato ingênuo são mostrados aqui.
No rearranjo V(D)J por gráfico 3D V(D)J, o tamanho de cada bola representa o número relativo de leituras. Em outras palavras, representa o número de anticorpos mRNAs em células B inteiras. A malha 3D consiste em 110 genes de cadeia pesada de imunoglobulina V, 12 genes de cadeia pesada de imunoglobulina D, e quatro genes de cadeia pesada de imunoglobulina J, que estão alinhados para refletir sua ordem no cromossomo.
A trama 2D VJ mostra o perfil do rearranjo de VJ no repertório IGL. O comprimento de cada barra representa o número relativo de leituras. O eixo X representa 101 genes V-kappa da cadeia de luz de imunoglobulina, e três genes V-lambda da cadeia de luz de imunoglobulina, e o eixo Y representa quatro genes J-kappa da cadeia de luz da imunoglobulina, e três genes J-lambda da cadeia de luz de imunoglobulina.
Uma perspectiva de um repertório de anticorpos humanos como um todo pode ser analisada a partir de vários tecidos, incluindo células mononucleares de sangue periféricos ou tecidos patológicos. Os resultados representativos do IgM, IgG total, IgA total, IgD, IgE e IgL de células mononucleares periféricas normais são mostrados aqui. Como o modelo murino, o perfil de repertório do rearranjo V(D)J é mostrado no gráfico 3D V(D)J no qual o tamanho de cada bola representa o número relativo de leituras.
A malha 3D consiste em 56 genes de cadeia pesada de imunoglobulina V, 27 genes de cadeia pesada de imunoglobulina D, e seis genes de cadeia pesada de imunoglobulina J, alinhados na ordem em que aparecem no cromossomo. O perfil do rearranjo de VJ no repertório IgL é retratado no enredo 2D VJ no qual o comprimento de cada barra representa o número relativo de leituras. O eixo X representa 41 genes V-kappa da cadeia de luz de imunoglobulina, e 32 genes V-lambda da cadeia de luz de imunoglobulina, e o eixo Y representa cinco genes J-kappa da cadeia de luz da imunoglobulina, e cinco genes J-lambda da cadeia de luz de imunoglobulina.
No material de estudo deste protocolo, um pequeno número de células classificadas por citometria de fluxo ou mesmo crioseções de amostras patológicas são utilizáveis. No entanto, será necessária uma otimização cuidadosa das condições da PCR. Como as informações de saída deste protocolo são enormes, a alfabetização bioinformática ajudaria a encontrar a estrutura da rede de anticorpos.
Isso levaria sem previsão à profunda compreensão do sistema imunológico.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para a análise e visualização de repertórios de anticorpos utilizando sequenciamento de nova geração. A abordagem permite a análise de repertórios de linfócitos B e suas alterações em resposta à estimulação imunológica, fornecendo insights sobre a eficácia de vacinas e a patogênese de doenças.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Genômica
- Patologia
Antecedentes
- Compreender os repertórios de anticorpos é fundamental para avaliar as respostas imunes.
- O sequenciamento de nova geração permite a análise abrangente dos genes de anticorpos.
- Este método pode ser aplicado a amostras tanto saudáveis quanto patológicas.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar o desenvolvimento de vacinas e estratégias de tratamento de doenças.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para visualizar e analisar repertórios de anticorpos.
- Avaliar a dinâmica das respostas de anticorpos em diversos contextos.
- Fornecer uma estrutura para avaliar a eficácia de vacinas.
Métodos Utilizados
- Dissecção e processamento de tecido de camundongo para obtenção de linfócitos B.
- Extração de RNA e síntese de cDNA para amplificação de genes de anticorpos.
- Sequenciamento de nova geração de genes de anticorpos amplificados.
- Visualização de dados do repertório de anticorpos utilizando gráficos 3D e 2D.
Resultados Principais
- Amplificação e sequenciamento bem-sucedidos de genes de anticorpos a partir de amostras murinas e humanas.
- Visualização dos padrões de rearranjo V(D)J em repertórios de anticorpos.
- Demonstração de mudanças dinâmicas nas respostas de anticorpos após a vacinação.
- Informações sobre a composição dos repertórios de anticorpos na saúde e na doença.
Conclusões
- O método fornece uma estrutura robusta para analisar repertórios de anticorpos.
- Os achados podem aprimorar a compreensão das respostas imunes e orientar estratégias terapêuticas.
- Essa abordagem é aplicável a diversas áreas de pesquisa, incluindo o desenvolvimento de vacinas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A caracterização abrangente dos repertórios de anticorpos de camundongo e humano utilizando sequenciamento de nova geração (NGS) permite uma compreensão sem precedentes da diversidade imunológica e da dinâmica das respostas imunes. Essa capacidade é fundamental para reduzir riscos na fase inicial de descoberta, apoiar a avaliação de vacinas e orientar pesquisas translacionais sobre doenças mediadas pelo sistema imunológico. A análise de alto poder de resolução dos repertórios fortalece a confiança preditiva em pontos críticos de inflexão nos processos biofarmacêuticos orientados pela imunologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação global da diversidade de linfócitos B e dos mecanismos de resposta imunológica.
- Apoia a validação funcional de alvos por meio da análise do uso de genes V(D)J e da expansão clonal.
- Facilita a desmistificação mecanicista em programas de descoberta com foco em imunologia.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece leituras quantitativas e de alto rendimento das frequências de genes de anticorpos para padronização de ensaios.
- Permite o perfilhamento reprodutível de repertórios imunes em diferentes amostras biológicas e condições.
- Permite triagem em larga escala de vacinas ou intervenções terapêuticas mediante o monitoramento de alterações no repertório.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados do repertório imune com biomarcadores relevantes para doenças e estratégias de estratificação de pacientes.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, acompanhando a dinâmica imune em resposta à estimulação ou à patologia.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco no desenvolvimento de imunoterapias e vacinas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de perfilagem do repertório de anticorpos baseado em NGS integra desde a descoberta inicial até a pesquisa translacional, permitindo decisões baseadas em dados em múltiplas etapas do processo.
- Biologia da Descoberta: Fornece mapeamento de alta resolução da diversidade de anticorpos para testes de hipóteses e esclarecimento de vias.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para monitoramento imunológico e prontidão de ensaios.
- Análises: Gera conjuntos de dados de sequências em larga escala e visualizações (V(D)J 3D, gráficos VJ 2D) para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações no repertório com estados de doenças ou respostas a vacinas, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma escalável e adaptável para análise de repertórios imunes em diversos programas de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em programas direcionados ao sistema imunológico.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de caracterização imunológica e apoia a escalabilidade de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/não prosseguir e a alocação de capital ao fornecer dados robustos sobre a resposta imunológica.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de ativos em imunologia e vacinas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em preparação de bibliotecas de NGS, otimização de PCR e análise bioinformática.
- Exige acesso a plataformas de sequenciamento de alto rendimento e infraestrutura computacional.
- Necessita padronização entre equipes no processamento de amostras e na interpretação de dados.
- Adaptável a diversos tipos de amostras, incluindo células classificadas e tecidos patológicos, com otimização do protocolo.
- A literacia em bioinformática é essencial para gerenciar e interpretar conjuntos de dados de repertório em larga escala.
