Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

Este método facilita a dissecção reprodutível e o corte de troncos cerebrais de roedores para a análise capturada da Rede Respiratória Medullary Mirian. Esta técnica oferece grande flexibilidade experimental, possibilitando a preparação de um desbloqueio in vitro ou uma preparação de fatia para gravação. Este método pode ser usado para experimentos de eletrofisiologia para explorar o circuito de controle neural que gera ritmos respiratórios e para entender a patologia e a desregulamentação da respiração em roedores geneticamente modificados.

Após a dissecção dos neuraxis, transfira rapidamente o tronco isolado do animal para uma câmara de dissecção aerada sob um microscópio de dissecção e coloque o tecido dorsal-side para cima, com a extremidade rostral voltada para a frente da câmara. Fixar o tecido nos ombros e na extremidade mais caudal da medula espinhal e fazer uma incisão midsagittal através do crânio após a sutura parietal para evitar danificar o córtex e o tronco cerebral subjacente ao crânio. Começando pela sutura sagital e trabalhando lateralmente, corte as suturas occipitais do crânio para criar retalhos de osso que podem ser refletidos e fixados para ancorar e estabilizar a parte rostral do crânio.

Depois de refletir ambos os retalhos do crânio, extirpa o restante do córtex cerebral, deixando a porção caudal do cerebelo relativamente intacta para realizar uma laminectomia dorsal. Use micro tesouras de mola e fórceps para remover a musculatura ao redor do crânio e coluna vertebral. Remova o tecido ao longo do lado dorsal da caixa torácica, deixando as costelas intactas e corte cuidadosamente os processos laterais da lâmina vertebral.

Depois de cortar qualquer tecido sobreostrando os pons e medulla, os vermis, cerebelo, pons e início da medula espinhal, serão claramente visíveis. Para realizar uma laminectomia ventral, coloque o tecido dorsal-side para baixo e fixe na caixa torácica e na extremidade mais caudal da coluna vertebral. Use os retalhos do crânio para fixar o lado rostral do tecido e remover a metade ventral da caixa torácica, incluindo o esterno e todos os órgãos abdominais.

Disseque o tecido mole preso à caixa torácica para expor as costelas e medula espinhal e remover a língua, esôfago, traqueia, laringe e todos os outros tecidos moles e musculatura sobrepor a base do crânio e da coluna vertebral. Para identificar a paleta dura, disseque o tecido sobreposto a esta placa retangular de osso na base do crânio, que inclui um recuo em forma de V. Em seguida, corte ao longo da linha média da paleta, levantando cuidadosamente o tecido para cima e realize um corte transversal para removê-lo.

Para iniciar uma laminectomia ventral, remova a lâmina, expondo a superfície ventral do tronco cerebral e da medula espinhal da primeira vértebra cervical até aproximadamente a vértebra torácica sete e corte de cinco a 10 milímetros ao longo de ambos os lados da coluna vertebral na lamina. Quando a medula espinhal for exposta, corte as raízes aproximadamente 20 a 25 milímetros bilateralmente, ao longo da coluna vertebral para aproximadamente T7 e levante cuidadosamente a borda rostral de C1, C2 e C3 com fórceps fisgados ou dobrados para permitir cortar sob o osso para remoção das três vértebras. Quando o comprimento desejado da medula espinhal tiver sido isolado da coluna vertebral, faça um corte transversal para remover o tecido medular.

Depois de remover a dura, coloque o tronco cerebral no centro da plataforma de parafina no bloco de corte de plástico e use pinos finos de insetos, cortados a não mais de um centímetro de comprimento para fixar a extremidade caudal do tronco cerebral através da medula espinhal distal. Em seguida, alinhe o bloco de corte coberto de parafina com o tronco cerebral preso no suporte do bloco Vibratone, de modo que a lâmina corte perpendicular à face rostral do tronco cerebral. Em seguida, faça uma fatia inicial para remover de 200 a 300 micrômetros de tecido íntegro irregular na extremidade rostral-mais do tecido, fazendo pequenos ajustes conforme necessário para garantir a linearidade PARP e pequenos cortes para remover qualquer tecido irregular.

As raízes glossofaríngeas se tornarão visíveis na borda lateral do tronco cerebral, cortarão uma fatia de 300 a 500 micrômetros de tronco cerebral desses marcadores neuroanatomômicos rostrais para capturar o complexo pré-Botzinger e os circuitos de transmissão associados. Todas as etapas do procedimento de corte são fundamentais para a criação de uma fatia reprodutível e viável, com todos os circuitos neuronais necessários na orientação correta para produzir ritmo robusto. Todos os elementos minimamente necessários do circuito neural para gerar e transmitir ritmo inspirador podem ser capturados em uma fatia fina usando este método.

Incluindo o complexo pré-Botzinger, neurônios pré-motores projetando para os neurônios motores hipoglossais e as raízes nervosas hipoglossais. O complexo pré-Botzinger, as raízes do nervo hipoglossal ou 12º craniano e as raízes nervosas C4 podem então ser usadas para gravação inspiradora. O aspecto chave deste procedimento é o isolamento cuidadoso das raízes e a confirmação de que o tronco cerebral não está danificado antes de cortar a fatia final.

Após este procedimento, gravações de eletrofisiologia podem ser feitas utilizando métodos de grampo de remendo, gravações celulares extras ou eletrodos de sucção para registrar a atividade elétrica produzida pela rede. Protocolos publicados anteriormente forneceram poucos detalhes passo a passo, dificultando que novos pesquisadores usem esse método sem viajar para outro laboratório e passar tempo com um investigador experiente.