Name: Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a medir respiração mitocondrial e função glicolítica em Candida albicans usando analisador de fluxo extracelular. Este método simplifica a análise bioenergética de patógenos fúngicos sem purificação.

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Pesquisa no laboratório de NC é suportada por uma concessão do National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 e uma bolsa da Fundação de saúde de Nova Jersey (NJHF), #PC40-18.

Nota: O protocolo detalhado passo a passo do ensaio é descrito abaixo, e o protocolo esquemático é mostrado na Figura 1.
1. cepas de c. albicans e condições de crescimento
<ol><li>Crescem as cepas de c. albicans em meio de levedura extrato-peptona-Dextrose (YPD) líquido a 30 °C em um shaker incubadora durante a noite. Nota: Manter cepas de Candida como estoques congelados e crescem em ágar YPD (extrato de levedura 1%, 2% de peptona, glicose 2% e 2% de ágar).</li>
</ol>2. preparação dos reagentes
<ol><li>Prepare o doseamento da seguinte forma:<ol>
<li>Para o ensaio da função mitocondrial, dissolver o pó de 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g e 2G glicose (2%) em 90 mL de água estéril e morna a mídia a 37 ° C. Ajustar o pH para 7,4 usando 5 M de NaOH e perfazer o volume a 100 mL com água estéril.</li>
		<li>Para o ensaio do stress glicolítico, dissolver 1,04 g RPMI 1640 pó sozinho em 90 mL de água estéril, aquecer a mídia a 37 ° C e ajustar o pH para 7,4. Perfazer o volume a 100 mL com água estéril. RPMI 1640 pó tem sem bicarbonato de sódio, que é fundamental para acompanhar a mudança de pH como uma medida da glicólise durante o ensaio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Compostos de injeção.<ol>
<li>Preparar o estoque de glicose 1m em água estéril e loja a-20 ° C.</li>
		<li>Preparar 100 mM oligomicina estoque em dimetilsulfóxido (DMSO), alíquota em pequenos volumes e armazenar a-20 ° C.</li>
		<li>Preparar 100 mM antimycin A stock em DMSO, alíquota em pequenos volumes e armazenar a-20 ° C.</li>
		<li>Prepare 100 mM estoque SHAM (ácido salicylhydroxamic) em etanol no dia do ensaio.</li>
		<li>Prepare 1 M KCN em água estéril no dia do ensaio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. revestimento da placa de ensaio com poli-lisina-D (PDL)
Nota: Executar todas as etapas em uma capa laminar abaixo.
<ol><li>D poli lisina em água de grau de cultura de tecido para fazer a concentração final de 50 µ g/mL, dissolva. Misturar bem e a alíquota para um tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e armazenar a-20 ° C para o longo prazo. Nota: 50 µ l por alvéolo é necessária, e para 24 poços, 1,2 mL é necessária. Portanto, alíquota pelo menos 1,3 mL por tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l por bem e incubar a temperatura ambiente, com a tampa coberta por 1-2 h.</li>
	<li>Aspirar a solução e lave uma vez com 500 µ l cultura de tecido estéril grau de água.</li>
	<li>Abra a tampa e permitir que os poços ao ar seco. Use a placa no mesmo dia ou loja a 4 ° C por um período máximo de 2-3 dias.</li>
</ol>4. hidratação do cartucho de sensor
Nota: Execute esta etapa um dia antes do experimento.
<ol><li>Abra o fluxo extra Kit de ensaio e remover o conteúdo. Coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de utilitário (Figura 2).</li>
	<li>Encha cada um bem da placa utilitário com 1 mL de calibrant e coloque o cartucho de sensor de volta. Assegure-se de que os sensores que contêm fluorophores (para medir o oxigênio e pH) estão submersos no calibrant.</li>
	<li>Incubar o cartucho do sensor durante a noite em uma incubadora não-CO2 a 37 ° C.</li>
</ol>5. crescimento e propagação de células nas placas de PDL-revestido
<ol><li>Inocular a c. albicans no caldo YPD e crescer durante a noite a 30 ° C, em uma coqueteleira a 200 rpm. Nota: Com base no design do ensaio e o interesse, c. albicans também pode ser cultivada em YPG ou meio mínimo.</li>
	<li>No dia do ensaio, dilua um número adequado de células no meio de ensaio para produzir uma concentração final de 100.000 células por 100 µ l.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de células diluídas em cada poço da placa de ensaio, exceto poços A1, B4, C3 e D6, na qual adicionar apenas 100 µ l do meio de ensaio para correcção de fundo (Figura 3).</li>
	<li>Transferir a placa para uma incubadora não-CO2 a 37 ° C e incubar por 60 min, que vai deixar as células aderem à superfície da placa.</li>
</ol>6. protocolo do ensaio
Nota: O protocolo descrito aqui é para o formato de 24-poço do instrumento. Volumes precisará ser ajustada se outro formato for usado.
<ol><li>Ensaio de função mitocondrial<ol>
<li>Preparação de compostos<ol>
<li>Preparar compostos na concentração de x 10 para o ensaio da função mitocondrial: preparar 20 mM SHAM, 100 µM oligomicina, KCN, de 100 mM e 20 µM Antimycin no meio de ensaio correspondente.</li>
			<li>Adicionar 50 µ l de Souza para o porto A, 55 µ l oligomicina na porta B, 62 µ l KCN a porta C e 68 µ l Antimycin A porta D (Figura 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensaio de stress glicolítico<ol>
<li>Preparação de compostos<ol>
<li>Prepare compostos na concentração de x 10 para o ensaio do stress glicolítico. Preparar 100 mM de glicose, 100 µM oligomicina, 500 mM 2-Deoxy glicose (DG-2) e 20 µM Antimycin no meio de ensaio correspondente.</li>
			<li>Adicionar 50 glicose µ l para o porto A, 55 µ l oligomicina na porta B, 62 µ l 2-DG a porta C e 68 µ l Antimycin A porta D.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Emprega o analisador de fluxo extra, que mede a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação do extracelular (ECAR) de células vivas em um formato de placa 24. Configure o protocolo de ensaio com antecedência.</li>
	<li>Abra o analisador de fluxo extra e configure o modelo de ensaio usando a guia Assistente de ensaio e siga as instruções passo a passo para preencher todas as informações que aparece durante a instalação. Gere o layout de grupo como semelhante ao mostrado na Figura 5. Configurar o protocolo, como mostrado na tabela 1. Definir esses layouts bem à frente antes do ensaio e salvar no computador. Na época do ensaio, restaure o protocolo salvo, abrindo o arquivo correspondente na opção Abrir arquivo na guia Assistente de ensaio (Figura 5).</li>
	<li>Carregar os compostos de 10x nos respectivos portos do cartucho sensor hidratado contendo o calibrant e carregar na bandeja do analisador fluxo extra do portador. Inicie a calibração pressionando o botão Start na tela.</li>
	<li>Adicione lentamente a 350 µ l do meio de ensaio para a placa de células ao longo do lado dos poços para minimizar a perturbação da célula para o volume final para 450 µ l.</li>
	<li>Substitua a placa de utilitário que contém o calibrant com a placa de ensaio e continuar.</li>
	<li>Remova o cartucho do sensor e a placa quando o ensaio for concluído. Salve o arquivo na pasta de destino apropriado.</li>
</ol>7. análise de dados
<ol><li>Use a área sob a curva - análise de variância (ANOVA-AUC) análise guia no software para calcular a diferença significativa entre os grupos, selecionando os respectivos parâmetros (OCR ou ECAR) conforme mostrado na Figura 6.</li>
	<li>Selecione os grupos que precisam ser comparados.</li>
	<li>Adicionar para os grupos de análise para ANOVA e clique Okey. Nota: Esta análise de AUC ANOVA irá adicionar uma nova folha para o arquivo no qual o AUC é calculado para cada grupo e comparado entre eles por ANOVA. Isto dará uma tabela dos valores de p para mostrar o significado.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals%3A+analysis+of+24%2C179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
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<li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li>
<li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+SRR1%2C+a+putative+two-component+response+regulator+gene%2C+is+required+for+stress+adaptation%2C+morphogenesis%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li>
<li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li>
<li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans%3A+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness%2C+cell+wall+integrity%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li>
<li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandt%2C+ME+%22Candida+and+Candidiasis%22">Candida and Candidiasis</a>. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).</li>
<li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li>
<li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

A bioenergética ensaio de fluxo extra serve como uma excelente ferramenta para ler a função mitocondrial medindo fosforilação oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxigênio dependente em tempo real. Além disso, uma função glicolítico que é medida como uma taxa de acidificação do extracelular (alteração do pH extracelular) também pode ser investigada ao mesmo tempo em análise em tempo real.
Bem sucedido chapeamento de c. albicans em placa de ensaio é um dos passos críticos no ensaio porque a i...

Infecções fúngicas invasivas matam mais 1,5 milhões de pessoas por ano em todo o mundo. Este número está a aumentar devido ao aumento do número de pessoas que vivem com imunidade comprometida, incluindo os idosos, prematuros bebês, transplantados e pacientes de câncer1. C. albicans é um patógeno oportunista de fungo humano que faz parte da microflora humana. Habita também superfícies mucosas e do trato gastrointestinal como um organismo comensal. C. albicans produz doença sistêmica grave em pessoas que têm deficiências imunitárias, que se submeteram à cirurgia, ou que tenham sido tratados com longos cursos de antibióticos. A classificação de espécies de Candida entre as causas de topo três ou quatro das doenças infecciosas nosocomiais (NID) em seres humanos,2,3,4,5,6,7. O número global anual de infecções da corrente sanguínea por Candida é estimado em ~ 400.000 casos, com mortalidade associada de 46-75%1. A mortalidade anual por causa da candidíase é aproximadamente 10.000 nos Estados Unidos sozinho. A extensão do NID causada por fungos também se reflete em gastos astronômicos de paciente5. Nos Estados Unidos, a despesa anual para o tratamento de infecções fúngicas invasivas supera US $ 2 bilhões, adicionando um esforço enorme para o sistema de saúde já sobrecarregado. Atualmente, terapias antifúngicas padrão disponíveis são limitadas por causa da resistência a drogas cada vez mais prevalente, toxicidade e interações medicamentosas. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar novos alvos de drogas antifúngicas que resultarão em melhores opções de tratamento para pacientes de alto risco. No entanto, a descoberta de novas drogas atuando em alvos fúngicos é complicada, porque os fungos são eucariontes. Isto grandemente limita o número de alvos de drogas de fungos específicos.
Estudos recentes têm indicado que as mitocôndrias são um contribuinte crítico para a virulência de fungo e tolerância às drogas antifúngicas, desde que as mitocôndrias são importantes para a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose8 ,9,10,11. Metabolismo glicolítico e não-glicolíticas são essenciais para a sobrevivência de c. albicans no hospedeiro mamífero12,13,14,15,16. Além disso, vários mutantes de c. albicans , falta de proteínas mitocondriais, tais como Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc foram mostrados para ser defeituoso em filamentação, um factor de virulência importante de c. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Além disso, esses mutantes também foram mostrados para ser atenuado para virulência em um modelo do rato disseminada candidíase17,18,19,20,21 ,22. Assim, fungosas mitocôndrias representam um alvo atraente para a descoberta da droga. No entanto, o estudo da função mitocondrial em c. albicans é um desafio porque c. albicans é petite negativo23, que significa que não pode sobreviver sem o genoma mitocondrial.
Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para investigar a função mitocondrial e glicolítico em c. albicans , sem a necessidade de purificar as mitocôndrias. Esse método também pode ser otimizado para investigar o efeito da manipulação genética ou moduladores químicos sobre vias mitocondriais e glicolíticas em c. albicans.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mito kit de estresse</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Calbiochem</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>medidor</td><td>de pH Accumet</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>Fenol vermelho</td><td>Sigma</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Santa cruz</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>SHAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Amresco&nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sódio</td><td>J.T Baker</td><td>3722</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau de cultura de tecidos</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>XF solução calibrante de ensaio</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura Peptona Dextrose</td><td>Fisher científico,</td> <td>BP2469</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura Peptona Dextrose Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura Peptona Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

investigação de bio-energética de candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

As mitocôndrias são organelas essenciais para o metabolismo celular e a sobrevivência. Uma variedade de eventos chaves ocorrem nas mitocôndrias, tais como a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose. Por conseguinte, disfunção mitocondrial é relatada para desempenhar um papel importante na tolerância de droga antifúngica e virulência de fungos patogênicos. Dados recentes também levaram ao reconhecimento da importância das mitocôndrias como um contribuinte importante para a patogênese fúngica. Apesar da importância das mitocôndrias em biologia de fungosa, métodos padronizados para entender sua função estão pouco desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento para estudar a taxa de consumo de oxigênio basal (OCR), uma medida da respiração mitocondrial e taxas de acidificação do extracelular (ECAR), uma medida da função glicolítico em cepas de c. albicans . O método aqui descrito pode ser aplicado a qualquer Candidaspp. tensões sem a necessidade de purificar a mitocôndria das células fúngicas intactas. Além disso, esse protocolo também pode ser personalizado para triagem de inibidores da função mitocondrial em cepas de c. albicans .

O foco do presente protocolo é para determinar as funções bioenergética de c. albicans avaliados pelo analisador de fluxo extra. Um mutante de c. albicans , falta proteína mitocondrial Mam33 também está incluído, juntamente com a sua estirpe de complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 para estudar os efeitos da exclusão de uma proteína mitocondrial em OCR e ECAR. MAM33 codifica para uma proteína putativa matriz mitocondrial de ácidos e sua função na Candida</em...

Aqui, apresentamos um protocolo gradual para investigar a respiração mitocondrial e função glicolítico em Candida Albicans usando um analisador de fluxo extra.

Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Este protocolo é significativo para determinar a função glicolítico e a respiração mitocondrial em candida albicans. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que a função mitocondrial seja medida sem a necessidade de purificar mitocôndrias de candida albicans. Este método pode ser otimizado para investigar os efeitos da manipulação genética ou moduladores químicos em vias mitocondriais e glicolíticas em abicanos candida ou outros patógenos fúngicos.Esta técnica é relativamente simples. Ou dependendo do organismo, seu uso pode ajudar a otimizar o número celular e a concentração de inibidores mitocondriais em seu ensaio. Em uma capa de fluxo laminar, dissolva a Poly-D-Lysine na água da rede de tecidos para uma concentração final de 50 microgramas por mililitro.Misture bem a solução e aliquot-la em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro, certificando-se de alíquotar de pelo menos 1,3 mililitros por tubo. Adicione 50 microliters desta mistura a cada poço da placa de ensaio, cubra a tampa e incubar à temperatura ambiente por uma a duas horas. Então aspire a solução.Enxágüe os poços da placa de ensaio uma vez com 500 microliters de água de grau de cultura tecidual estéril, abra a tampa e deixe os poços secarem. Se não estiver usando a placa no dia em que estiver preparada, armazene-a a quatro graus Celsius por um máximo de dois a três dias. Um dia antes do experimento, abra o kit de ensaio de fluxo extra e remova o conteúdo.Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade. Encha cada poço da placa de utilidade com um mililitro de calibrante e, em seguida, coloque o cartucho do sensor de volta. Certifique-se de que os sensores que contêm fluoroforos estão submersos no calibrante.Incubar o cartucho do sensor a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono durante a noite. Um dia antes do ensaio, inocular os albicanos C preparados no caldo YPD e crescer durante a noite a 30 graus Celsius em um shaker a 200 rpm. No dia do ensaio, diluir um número adequado de células no meio de ensaio para produzir uma concentração final de 100.000 células por 100 microliters.Adicione 100 microliters das células diluídas em cada poço da placa de ensaio, exceto os poços A1, B4, C3 e D6. A esses poços, adicione apenas 100 microliters de meio de ensaio para correção de fundo. Incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por 60 minutos para deixar as células aderirem à superfície da placa. Prepare os compostos para o ensaio da função mitocondrial na concentração de 10X no meio de ensaio correspondente, conforme descrito no protocolo de texto.Adicione 50 microliters de SHAM na porta A, 50 microliters de Oligomicina na porta B, 62 microliters de cianeto de potássio na porta C, e 68 microliters de Antimicina A na porta D.Next, prepare os compostos para o ensaio de estresse glicolítico na concentração de 10X no meio de ensaio correspondente, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 50 microliters de glicose à porta A, 55 microliters de Oligomicina na porta B, 62 microliters de 2-DG na porta C e 68 microliters de Antimicina A na porta D.Antes do ensaio, abra o analisador de fluxo extra e configure o modelo de ensaio usando o assistente de guia de ensaio. Siga as instruções passo a passo e preencha todas as informações que aparecem durante a configuração.Gere um layout de grupo e configure o protocolo conforme descrito no protocolo de texto. Salve esses layouts antes do ensaio. No momento do ensaio, restaure o protocolo salvo abrindo o arquivo correspondente na opção arquivo aberto na guia assistente de ensaio.Em seguida, carregue os compostos de 10X nas respectivas portas do cartucho hidratado contendo o calibrante. Carregue o cartucho do sensor na bandeja portadora do analisador de fluxo extra. Inicie a calibração clicando no botão iniciar na tela.Em seguida, adicione suavemente 350 microliters do meio de ensaio à placa celular ao longo da lateral das paredes para minimizar a perturbação celular, trazendo o volume final para 450 microliters. Substitua a placa de utilidade contendo o calibrante com a placa de ensaio e continue o ensaio. Uma vez que o ensaio esteja concluído, remova o cartucho do sensor e a placa.Salve o arquivo na pasta de destino apropriada. Neste estudo, as funções bioenérgicas dos albicanos C são avaliadas por analisador de fluxo extra. Um mutante sem a proteína mitocondrial mam33 também está incluído junto com sua cepa complementar para estudar os efeitos da exclusão de uma proteína mitocondrial na taxa de consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular.O tipo selvagem de C albicans mostra uma taxa de consumo de oxigênio de 145 picomoles por minuto que está bem dentro da faixa ideal para qualquer ensaio de fluxo extracelular. A taxa de consumo de oxigênio basal do tipo selvagem, as cepas mam33 mutantes e mam33 complementadas não mostram diferenças. Da mesma forma, não são observadas diferenças significativas nas taxas de acidificação extracelular basal entre as cepas.No entanto, ao inibir o complexo-IV com cianeto de potássio, do tipo selvagem e do mutante mam33, as cepas complementadas mam33 mostram uma mudança significativa em direção à glicólise. A cepa mutante mam33, no entanto, não mostrou uma mudança glicolítico compensatória sugerindo que a via dependente composta-IV está prejudicada nesta cepa. No teste de estresse glicolítico, as células estão famintas de glicose por uma hora e a taxa de consumo de oxigênio basal e a taxa de acidificação extracelular são medidas.Após a fome, a cepa mutante mam33 mostra um consumo significativamente menor de oxigênio e taxas de acidificação extracelular em comparação com as outras cepas. Isso sugere uma utilização prejudicada da glicose para respiração e glicolise quando as células são forçadas à condição de fome. Após a injeção de glicose, todas as cepas mostram estimulação tanto de sua taxa de consumo de oxigênio quanto da taxa de acidificação extracelular.O revestimento da placa de ensaio permite que as células de candida albicans aderam à placa. A adesão inadequada das células de candida albicans afetará o resultado do ensaio. Após o desenvolvimento dessa técnica, ela tem sido empregada em uma ampla gama de tipos e doenças celulares que abordam como as mitocôndrias funcionam durante as condições fisiológicas e patológicas.Por exemplo, empregando células de controle e derivadas do paciente neste ensaio, é possível abordar as questões específicas de como a função mitocondrial é alterada. Deve-se tomar cuidado durante a preparação de inibidores mitocondriais, como cianeto de potássio e antimicina A, porque esses compostos são extremamente venenosos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este protocolo fornece uma abordagem bioquímica para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) de células leucêmicas primárias com ensaio de fluxo extracelular. A avaliação do perfil metabólico dessas células ajuda a caracterizar suas demandas, levando a uma terapia personalizada.

Ensaio de Fluxo Extracelular: Um Método para Medir o Perfil Metabólico das Células

Este vídeo demonstra o método para analisar o metabolismo energético em células NK humanas ativadas usando um analisador de fluxo extracelular. Diferentes inibidores dos complexos da cadeia de transporte de elétrons afetam a síntese de ATP, que é medida por meio da taxa de consumo de oxigênio ou OCR, fornecendo informações sobre o metabolismo celular e a bioenergética.

Monitoramento em tempo real do metabolismo energético em células NK humanas usando um analisador de fluxo extracelular

Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

O ensaio de fluxo metabólico celular em tempo real mede a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular, que corresponde à produção de triptosfato de adenosina mitocondrial e glicolítico, usando sensores de pH e oxigênio. O manuscrito explica um método para compreender o estado energético dos osteoblastos e a caracterização e interpretação do estado bioenergéstico celular.

Usando o analisador de fluxo metabólico de células em tempo real para monitorar bioenergetics osteoblast

Esses protocolos ajudarão os usuários a sondar o metabolismo de energia mitocondrial em esferoides derivados de células cancerígenas 3D usando a análise de fluxo extracelular do Seahorse.

Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular

Descrevemos protocolos stepwise medindo a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos e células HL60 usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

O uso indevido de álcool prejudica a imunidade dos macrófagos alveolares (MA) devido à supressão da respiração mitocondrial e da bioenergética. Recentemente, demonstramos que a exposição ao etanol (EtOH) aumenta a dependência da glutamina para a respiração mitocondrial em AMs. Aqui, são fornecidos métodos para determinar o uso de glutamina para respiração mitocondrial em AMs tratados com EtOH usando um bioanalisador de fluxo extracelular.

Avaliação da glutamina como fonte de combustível para macrófagos alveolares expostos ao etanol crônico usando um bioanalisador de fluxo extracelular

Aqui, descrevemos em detalhes métodos para extrair macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado e, posteriormente, avaliar o fluxo metabólico em células vivas.

Análise do fluxo metabólico ex vivo em macrófagos esplênicos e cardíacos e monócitos da medula óssea

Este protocolo emprega um repórter bioluminescente, permitindo medições da atividade transcricional em Saccharomyces eubayanus para monitorar a transição glicose-maltose, permitindo a análise em tempo real das adaptações metabólicas e apoiando a otimização da cepa para fermentação industrial sob diversas condições.

In vivo Monitoramento da atividade transcricional durante a transição metabólica usando um repórter bioluminescente em levedura

Este protocolo descreve uma forma econômica de realizar um teste de esforço de glicólise para quantificar a reprogramação metabólica em micróglias primárias de camundongo. Após o isolamento e estimulação inflamatória, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é medida usando reagentes recém-preparados e ajustados pelo pH, seguida pela normalização proteica para permitir uma avaliação precisa e reprodutível das mudanças glicolíticas.

Investigando a glicólise na microglia primária usando ensaio de fluxo extracelular

Aprenda a medir respiração mitocondrial e função glicolítica em Candida albicans usando analisador de fluxo extracelular. Este método simplifica a análise bioenergética de patógenos fúngicos sem purificação.

Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise

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