Name: Ao vivo celular análise de tensão de cisalhamento na Pseudomonas aeruginosa , usando um sistema automatizado de Microfluidic superior-taxa de transferência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a analisar tensão de cisalhamento em biofilmes de Pseudomonas aeruginosa usando um sistema microfluídico automatizado de alta vazão. Este método permite estudar cobertura, taxa de crescimento e propriedades morfológicas em tempo real.

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Este trabalho foi viabilizado por subsídios do Instituto Nacional para geral médica ciência (NIGMS) (5P20GM103427), um componente do National Institutes of Health (NIH)

Os autores não têm nada para divulgar.

O procedimento de análise de sistema e imagem microfluidic discutido aqui centra-se sobre a execução de experimentos de biofilme microfluidic para determinar Propriedades morfológicas que não requerem a informação tridimensional completa encontrada tipicamente de confocal estudos de microscópio. Estes incluíram microcolônias cobertura do substrato (cobertura por cento), medida pelo coeficiente de rugosidade e textural entropia aspereza de superfície. Um método para estimar o acúmulo de biofilme relativo total celular também é apresentado de que taxas de crescimento no log de fase pode ser calculada.
Existem várias etapas de pequenas, mas significativas que devem ser destacadas neste método. Limpando a interface com o álcool ajuda a evitar a contaminação de outras bactérias em indo de experimento para experimento, mas também de bem de bem em um experimento. Escorva e semeadura também são muito importantes porque escorva permite ao usuário determinar quais canais estão permitindo que a mídia a fluir através dos canais sem qualquer perturbação ou entupimento. Canais também não devem ser perturbado (ou seja , eles devem ser constantemente cheios de mídia) depois de escorva para aumentar as chances de uma experiência bem sucedida com nenhuma bolha de ar ou entupimentos. A etapa de propagação pode ser variada de acordo com o tipo de bactéria e assim deve ser otimizada para o acessório de celular. Por exemplo, se as células parecem não anexar, modificações de superfície podem ter que ocorrem na placa microfluidic antes da semeadura ou tempos mais longos de incubations podem ser necessários. Também é fundamental para certificar-se que o microscópio está configurado corretamente para obter uma imagem em foco e deve ser monitorizado periodicamente durante todo o experimento para assegurar que são obtidas imagens de qualidade. Se o foco estiver desligado, o microscópio pode e deve ser ajustado como o experimento continua. Durante o tempo de aquisição de imagem, o último comprimento de onda deve ser definido como Todo fechado para evitar a exposição dos filtros e iluminação para somente um canal durante o tempo de espera que ocorre entre as aquisições de imagem. Além disso, a análise de imagem que determina a % de cobertura de superfície foi projetada em casa porque o manual do software de montagem não explicitamente descrever o procedimento. Além disso, a fim de expandir-se na análise da imagem e determinar outras características tais como a rugosidade da superfície, etc., aberto fonte código baseado em Python45 foi desenvolvida em casa e compartilhado no repositório gitHub. Também existem limitações na quantidade de dados pode ser armazenado e gerenciado no disco rígido local, assim que um disco rígido externo ou compartilhamento de dados on-line é necessário como CyVerse46.
Biorreatores convencionais, tais como o reator do CDC e o gotejamento fluxo reator34, exigem muita mídia, fornecem tamanhos de amostra menos e exigem uma quantidade elevada de esterilização dos equipamentos. Em contraste, as vantagens desta plataforma de produtividade mais elevados incluem a capacidade de controle da tesoura, taxas de fluxo, e a suposição que a vitro em experiências de perto se assemelham na vivo condições. Desvantagens do sistema incluem os vários acessórios e software que requerem um meticuloso de instalação que deve ser executada na ordem correta dos eventos. Além disso, o manual que é fornecido para o equipamento não explica totalmente cada etapa de experimentos e os comandos do software, e consequentemente, muitos erros ocorrem durante os experimentos, incluindo o entupimento dos canais, falta de crescimento ou acessório, imagens de microscopia de alta qualidade de falta ou do cinema. O próprio instrumento e consumíveis, tais como as placas microfluídicos, também são relativamente caros, com um preço de mais de US $200 por placa e não são reutilizáveis. Assim, enquanto a técnica empresta resultados poderosos, os conhecimentos técnicos necessários para a sua utilização é relativamente elevado e requer treinamento repetido por peritos no campo. Este relatório procura resolver esse problema, fornecendo um guia para novos usuários destes biorreatores para estudar características de biofilmes.
O sistema microfluídicos, que é capaz de realizar análise celular, ganhou a atenção considerável para diversas modalidades científicas, tais como em microbiologia, imunologia, Hematologia, Oncologia e investigação em células estaminais. Mais especificamente, a tecnologia resultou em muitas publicações, descrevendo os tópicos que são altamente relevantes para aplicações médicas37,47, incluindo a adesão microbiana de oral48, determinar os efeitos de biossurfactantes em Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus49,50, hospedam interações patógeno em Escherichia coli51, Streptococcus aderência52e tratamento de fibrose cística53. Dado o fato de que este sistema de microfluidic é muito versátil, prevê-se que mais e mais sistemas serão distribuídos em todo o mundo.
Algumas etapas do protocolo específico deverão ser cuidadosamente consideradas. Mídia pode ser diluída a 50% com dH2O para ajudar a evitar bolhas e entupimento, mas neste caso não foi necessária. O valor específico de OD600 usada para a propagação deve ser determinado usando testes experimentais de um experimento de crescimento para ver o que funciona melhor para o conjunto específico de condições usadas. Bolhas em poços antes da selagem podem originar bolhas nos canais microfluídicos e devem ser removidas por estalado ou sugado para fora com uma ponta da pipeta. É importante manter as bactérias fora os pequenos canais serpentinas. Por ter volumes iguais dos meios de comunicação de entrada e de saída durante o processo de preparação, fluxo devido à pressão do líquido volume será controlado por fluxo é apenas devido a força de pressão do sistema. As distâncias de calibração devem ser configuradas durante a instalação do representante da empresa. Essas configurações são específicas para cada câmera.
Existem vários desafios que ocorrem quando encontrar o limiar mais representativo para uma imagem. Definindo valores limite máximo pode ser difícil se a intensidade do pixel média em todas as regiões do plano de fundo não é consistente causados selecionando uma posição que não é no centro do canal ou de detritos na placa. Sob o Padrão MM, clique em processoe selecione Background e correção sombreamento a ferramenta correção para essas inconsistências. No entanto, esta ferramenta geralmente é somente útil se o usuário tiver tomado imagens dos canais antes da semeadura que eles podem usar imagens de referência. Ou, se o plano de fundo/sombreamento referência imagens não estão disponíveis, o usuário precisará usar seu julgamento para definir um valor limite que cobre a célula área mais sem incluir plano de fundo para a imagem inteira. Como alternativa, selecione áreas representativas para medir que excluem as regiões de inconsistência por clique Região retangular, Região de elipseou Região de rastreamento para selecionar uma região e selecione Região ativa ao invés de todo Imagem na janela Visualizar estatísticas de região (em Ferramentas de análise). Se uma região representativa é utilizada para a imagem de campo brilhante de limiarização, mesma região deve ser usada para medição da imagem correspondente FITC. É útil gravar as espaciais estatísticas específicas (esquerda, topo, largura, altura, área, perímetro) associadas com essa região representativa assim será encontrada na mesma região e medido na imagem correspondente FITC.
Para evitar um acúmulo de dados no disco rígido que fará com que o computador abrandar, um disco rígido externo pode ser comprado para o armazenamento de dados. Uma outra opção para armazenamento de dados e facilitar o compartilhamento de dados é a plataforma de bioinformática do CyVerse. Crie uma conta no sistema de CyVerse, indo para http://www.cyverse.org/. Uma vez conectado, inicie o ambiente de descoberta, em seguida, selecione "Log em CyVerse". Selecione "dados" e navegue até és a pasta. Se a pilha de imagem está no computador local, em seguida, selecione "fazer Upload", em seguida, "Upload simples de Desktop". Localize o arquivo de pilha de imagem e selecione para upload. O arquivo ou uma pasta pode ser compartilhada com os colaboradores se tiverem uma conta CyVerse e recebem permissão. Compartilhamento da pasta de dados para o público em geral exige que os metadados adicionados para cada arquivo usando CyVerse aprovado Standard. Este procedimento não será discutido aqui porque isso não está dentro do escopo deste trabalho.

Aqui, vamos demonstrar um método para medir o efeito da tensão de cisalhamento sobre a formação de fluorescente biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa) PA01 usando um sistema automatizado microfluidic de maior rendimento.
Biofilmes são comunidades de micro-organismos, como bactérias, organizados por uma substância polimérica extracelular que estão ligados a um suporte e são tipicamente encontrados na interface entre um líquido e um sólido de superfície1. Estas comunidades de biofilme podem ser benéficas para o ambiente, tais como a melhoria da qualidade das água em linhas de abastecimento de água e na biorremediação de recalcitrante compostos2,3. No entanto, biofilmes também podem ser altamente prejudiciais à saúde humana, com consequências indesejáveis. Por exemplo, dispositivos médicos, tais como implantes de quadril e joelho, são um tipo de superfície onde o acúmulo de biofilme tem sido um desafio e provoca graves complicações médicas4,5. Biofilmes podem também introduzir sistemas de água naturais, como rios e lagos e se infiltrar em tubulações de abastecimento de água, levando a contaminação de bactérias na água potável, resultando em infecções6,7,8. Biofilmes formados em ambientes marinhos aderirem aos navios e outros substratos artificiais e apresentam um grande problema ambiental e econômico como o aumento do atrito leva para aumentar o consumo de combustível9,10. Revestimentos de antimicrobianos, tais como o tributilestanho, foram desenvolvidos para evitar esses problemas, mas são tóxicos para a vida marinha11.
P. aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa com elevadas capacidades prósperas em uma variedade de condições ambientais e nutrimental12. P. aeruginosa é uma causa comum de infecções e hospital-adquirida na Comunidade e encontrado ser estreitamente associado a lesões, como queimaduras graves e hospedeiros imunocomprometidos, tais como na fibrose cística (CF)5,12, 13, AIDS e câncer pacientes5,13. A formação de biofilmes de p. aeruginosa foi conectada mais seriamente a CF, onde infecções pulmonares crônicas são a principal causa de morte por esta doença5.
Uma tensão de referência de p. aeruginosa, PA01, é usada neste relatório e é geneticamente modificada para expressar uma proteína verde fluorescente melhorada (PA-EGFP). EGFP representa uma forma mutante do GFP com propriedades de fluorescência maiores que permite em situ biofilme análise usando microscopia de fluorescência14,15,16. Este tipo de análise da fluorescência é vantajoso para o estudo de biofilmes porque GFP não interfere significativamente com o crescimento da célula e função17. Por exemplo, células de Escherichia coli que foram marcadas com GFP cresceram bem e continuamente sem ter sofrido qualquer efeitos tóxicos em comparação com o controle de bactérias17. Outros relatórios fundamentaram esta alegação18,19,20. Além disso, o uso de um repórter fluorescente como EGFP é rápida e simples, ainda células vivas somente serão medidas porque células mortas rapidamente deixam de fluorescência21.
Biofilmes podem crescer sob diferentes condições ambientais, incluindo aqueles com taxas de fluxo diferentes. Por exemplo, filmes podem crescer em alta tensão de cisalhamento, como em rios, onde as condições de fluxo de água de alta levam a uma maior diversidade microbiana22. Contrària, água parada em lagoas ou biofilme oral experiência um tanto mais baixo cisalhamento força23. Além de taxa de fluxo, existem outros fatores que influenciam a aderência de biofilme, incluindo a rugosidade da superfície e hidrofobicidade, composição de mídia, e até mesmo o bacteriano célula superfície1,4,7, 24. condições também podem causar a variação na estrutura espacial ou morfologia de um biofilme. Isso inclui as condições ambientais, tais como tensão de cisalhamento exercida por um fluido em movimento ou gradientes na disponibilidade de nutrientes e fatores biológicos, tais como as espécies presentes no sistema, motilidade das células e as proteínas específicas presentes no extracelular substância polimérica25,26,27. Sob algumas condições, o biofilme será gramado-como (liso e plano), enquanto em outras condições o biofilme vai ser áspero, macio, ou mesmo como cogumelo28. Enquanto a diferença qualitativa entre o biofilme gramados e estruturas cogumelos pode ser claramente observada em imagens microscópicas, compreender a relação entre a estrutura do filme e processos biológicos dentro do filme requer sistemática e quantitativa métodos de descrever a morfologia. Propriedades morfológicas sugeridas para estudo por pesquisadores incluem a porosidade, a dimensão fractal, comprimento de difusão microcolônias área no substrato, volume de microcolônias, coeficiente de rugosidade e entropia textural29,30 .
Biorreatores são usados no estudo de biofilmes de imitar a vida real condições31. Reactores de fluxo de gotejamento (DFR) representam um ambiente de baixo-tesoura onde nutrientes na mídia fluam lentamente entre as células que são atinentes a uma superfície ao longo do tempo para formar um biofilme com uma célula de alta densidade32. Reactores de CDC são biorreatores que criam um ambiente fluido de alta tensão de cisalhamento pelo controle de uma haste de agita que gira continuamente dentro da mídia encheu o tanque33. Estes tipos de biorreatores são simples de configurar, mas eles são limitados no escopo por causa do tamanho de amostra relativamente baixo, o alto consumo de mídia, grandes quantidades de resíduos biológicos perigosos produzidos a partir de fluxos de mídia gotejamento variando de 125 µ l/minuto para reactores de fluxo de gotejamento a mais de 1 mL/min para reatores de CDC e a necessidade de grandes quantidades de autoclave de vidro e resíduos de mídia34. Biofilmes não crescem uniformemente em toda a superfície em um reator de fluxo de gotejamento porque à direita ao longo os maiores conglomerados de p. aeruginosa bactérias, portanto, faz com que o baixo cisalhamento dos meios de comunicação, o crescimento do biofilme não é muito liso e as amostras irregulares não podem ser facilmente analisado com microscopia de fluorescência35,36 .
Algumas limitações de biorreator comuns são superadas por meio de um biorreator microfluidic médio-taxa de transferência, onde apenas mililitros de mídia são necessários, e as placas de reação são pequenos e facilmente descartáveis após autoclavagem37. Além disso, dependendo do número de poços, muitas repetições podem ser executadas em apenas um reator executar, que fornece a quantidade suficiente de dados para realizar análise estatística significativa. Na Figura 1, são mostrados os diferentes componentes do sistema de microscopia microfluidic que permitem condições controladas, incluindo temperatura e fluem taxa38,39,40. O biorreator é acoplado com microscopia de fluorescência para visualizar a fluorescência da marca EGFP no PA01 sob baixa aplicado através de condições de alto cisalhamento que imitarão cenários mais realistas que são encontrados no ambiente ou na área biomédica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Figura 1 : Os componentes individuais do sistema Microfluidic. Os componentes individuais são listados da esquerda para a direita: 1. câmera CCD, 2. alta resolução de microscópio invertido com palco automatizado, módulo de fluorescência automatizada e módulo de focagem automática, 3. placa de palco, 4: Imaging system Interface, 5: Manual do microscópio de fase Controle, 6: Armadilha de Vapor, 7: Imaging system Controller (controlador de temperatura incluindo), 8: 9 controladores de Hardware: controlador de fluorescência, 10: Uninterruptible Power Supply, 11: rígido externo para armazenamento de imagens, 12: PC Workstation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Um trecho da placa microfluídicos é mostrado na Figura 2. As placas mais comumente usadas é composto por 48 poços. Um experimento requer uma entrada e uma saída poços, um total de 2 poços. Isto permite 24 experimentos simultâneos que podem ser executados com diferentes condições experimentais, tais como cepas bacterianas, tratamentos antimicrobianos e mídia variou de canal para canal e controlado o fluxo de cisalhamento para cada coluna de seis canais. A temperatura experimental também é controlada com um ajuste de temperatura em toda a placa. Os canais microfluídicos mostram que cada canal tem uma região serpentina para fornecer suficiente pressão traseira e cisalhamento controlado.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Figura 2: Visualização da janela de visualização e canais microfluídicos. Destacam-se dois poços de entrada e saída, com os canais microfluídicos conectá-los com corantes vermelhos e verdes. O corante torna visível uma região serpentina em cada canal que cria pressão suficiente e cisalhamento controlado durante o fluxo de fluido. Cada canal de visualização (dentro do círculo vermelho) pode ser fotografada com comprimentos de onda desejados. São mostrados campo claro (topo) e fluorescente (inferior) imagens de microscopia de um único canal com um biofilme PA01-EGFP usando um objectivo X 20. Barra de escala = 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Um guia passo a passo é fornecido para permitir que usuários de biorreactores microfluidic acoplados com microscopia de fluorescência para realizar experimentos de biofilme romance usando tesoura diferentes ambientes. Este método permitirá a expansão de experiências envolvendo outros microorganismos além de bactérias, tais como fungos e algas, que têm aplicações médicas e ambientais41,42,43. A abordagem detalhada descreve como cultura PA01-EGFP, inocular uma placa de 48 e configurar o dispositivo microfluidic e software, configurar o microscópio fluorescente e demonstrar a análise do software para obter a cobertura do biofilme, taxa de crescimento, e Propriedades morfológicas tais como rugosidade da superfície.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de amónio, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9208-500G</td><td>Parte da composição mínima do meio</td></tr><tr><td>BioFlux 1000 48 Poços Placa de baixo cisalhamento</td><td>Biosciences</td><td>910-0047</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux 1000Z Sistema de imagem microfluídica</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>BF 1000Z</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio Di-hidreto, Grau ACD</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>Parte da composição mínima do meio</td></tr><tr><td>Dextrose, Anidra, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9230-500G</td><td>Parte da composição mínima do meio</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio Grau ACS</td><td>VWR</td><td>EM-MX0070-1</td><td>Parte da composição mínima do meio</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico, Grau ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td>Parte da composição mínima do meio</td></tr><tr><td>Pseudomonas Aeurginosa GFP</td><td>ATCC</td><td>15692GFP</td><td>Pseudomonas aeurinosa cepa bacteriana PA01 com modificação GFP usada para este estudo.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td>Parte da composição mínima do meio</td></tr><tr><td>fosfato de sódio, monobásico, anidro, grau reagente</td><td>VWR</td><td>97061-942</td><td>Parte da composição mínima do meio</td></tr></tbody></table>

ao vivo celular análise de tensão de cisalhamento na pseudomonas aeruginosa , usando um sistema automatizado de microfluidic superior-taxa de transferência

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Um maior rendimento microfluidic em vitro biorreator juntamente com microscopia de fluorescência tem sido usado para estudar o crescimento do biofilme bacteriano e morfologia, incluindo Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa). Aqui, iremos descrever como o sistema pode ser usado para estudar a cinética de crescimento e as propriedades morfológicas tais como a rugosidade da superfície e textura entropia da estirpe de p. aeruginosa que expressa uma proteína verde fluorescente melhorada (PA01-EGFP PA01 ). Um protocolo detalhado irá descrever como crescer e propagar as culturas PA01-EGFP, como definir-se o microscópio e o autorun e realizar a análise de imagem para determinar a taxa de crescimento e propriedades morfológicas, usando uma variedade de forças de cisalhamento que são controlados pela dispositivo microfluidic. Este artigo irá fornecer uma descrição detalhada de uma técnica para melhorar o estudo de biofilmes PA01-EGFP, que eventualmente podem ser aplicadas para outras cepas de bactérias, fungos ou algas biofilmes usando a plataforma microfluidic.

Figura 4 um demonstra a área de thresholded por cento ao longo do tempo de um 24 h executar em fluxos de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2. O biofilme cobertura ou por cento limiar área de superfície (C [%]) foi diferente para todas as configurações de cisalhamento três. A cobertura de biofilme foi mais rápida no cisalhamento de 1,0 Dina/cm2 , onde a área de limite aumentou de 2-5% a 100% depois de 200 min de crescimento e atingiu uma fase estacionária depois de 400 min. Em 0,5 Dina/cm2, a cobertura de biofilme atrasou-se e começou a aumentar em 400 min atingir cobertura de 100% após 800 min. O mais baixo cisalhamento em 0,2 Dina/cm2 claramente demonstraram o aumento mais lento na cobertura de biofilme, onde por cento cobertura começou a aumentar em 500 min mas nunca alcançado além da área de limite de 65%. Estes resultados indicaram cisalhamento teve uma influência directa na cobertura de superfície do biofilme. O cisalhamento maior pareciam ser uma condição mais ideal para o crescimento do biofilme, possivelmente devido ao fato de que a mídia fornecida as bactérias com mais nutrientes para que o biofilme pode proliferar mais rapidamente.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Figura 4: área de limite percentual, acúmulo de biofilme total, coeficiente de rugosidade e textural entropia... ) uma porcentagem limite área (C [%]) ao longo do tempo usando 0,2 0,5 e 1,0 Dina/cm2 sobre a 24h, período de tempo. Obteve-se dados de um canal para cada condição de cisalhamento. b) total acúmulo de biofilme (medida relativa) em função do tempo usando 0,2 0,5 e 1,0 Dina/cm2 sobre a 24h, período de tempo. As linhas pretas são mínimos quadrados se ajusta a um modelo exponencial. Obteve-se dados de um canal para cada condição de cisalhamento. c) coeficiente de rugosidade de PA01-EGFP usando valores de tensão de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2 monitorado mais 24 h. dados obteve-se de um canal para cada condição de cisalhamento. d) textural entropia de PA01-EGFP usando valores de tensão de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2. Obteve-se dados de um canal para cada condição de cisalhamento (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura 4 b é consistente com os resultados mostrados na Figura 4um. O acúmulo de biofilme (N[rel]) foi medido com base no pressuposto de que o sinal GFP em um ponto em uma imagem é proporcional à densidade de célula viva naquela posição. Ele demonstra que o acúmulo de biofilme de medição relativa total aumentou em função do tempo usando 0,2 0,5 e 1,0 Dina/cm2 sobre a 24h, período de tempo, e recusou-se a taxa de crescimento de mais alta tensão de cisalhamento a mais baixa tensão de cisalhamento. Há um período de tempo claro, dando o crescimento exponencial do qual pode ser calculada a uma taxa de crescimento quantitativo.
Figura 4 c demonstra o coeficiente de rugosidade (Rum) em fluxos de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2. Rugosidade da superfície, quantificada pelo coeficiente de rugosidade, mede a variação no perfil de espessura do filme. A definição formal é
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
onde T, é a eu-th medição de espessura, Tum é a espessura média, e N é o número de medição de espessura30. O procedimento descrito no presente inquérito mede a espessura associada com células vivas. Um simples arranjo de células renderá um coeficiente de rugosidade de zero enquanto significativas variações de espessura da média renderá um coeficiente de rugosidade maior do que um. Similar à influência de cisalhamento sobre a taxa de crescimento e a cobertura de limiar por cento do filme, os biofilmes exibiram topografias diferentes ao longo do tempo. Em geral, Rum diminuiu ao longo do tempo para todas as condições de cisalhamento indicando que todas as superfícies tornou-se mais suaves. No entanto, em comparação com o mais baixo cisalhamento de 0,2 Dina/cm, as configurações mais altas de cisalhamento de 0,5 e 1,0 Dina/cm2 resultaram em uma superfície mais Lisa ao longo do tempo, indicando que um fluxo mais rápido de cisalhamento contribuiu para a superfície mais suave e mais uniforme e o mais alto cisalhamento do 1,0 Dina/cm2 atingindo abaixo 0.2 Rum.
A suavidade, regularidade ou grosseria de uma superfície também pode ser expressa em entropia textural (TE). TE é uma propriedade usada na análise de imagem para medir o grau de aleatoriedade em uma imagem bidimensional. Seu cálculo baseia-se na matriz de co-ocorrência nível cinza, definido por Haralick et al., que analisa se os valores de pixel em um local estão correlacionados com valores de pixel em um outro local44. Um alto grau de correlação levará para baixa entropia. Figura 4 d retrata o TE em fluxos de cisalhamento de 0,2 e 0,5 1,0 Dina/cm2. SMT aumentou ao longo do tempo para todas as condições de cisalhamento, mas a mais alta tensão de cisalhamento em 1,0 Dina/cm, alcançada o máximo TE mais cedo do que as tensões de cisalhamento inferiores a 900 min (1.0). O mais baixo cisalhamento de 0,2 Dina/cm2 tinham o menor TE (0,8) atingindo seu máximo depois de 1.000 min. No entanto, a tensão de cisalhamento intermediário de 0,5 Dina/cm2 alcançou seu máximo TE (1.2) muito mais tarde do que as condições de alta ou baixa tensão de cisalhamento.
O coeficiente de rugosidade e TE medem características diferentes. Enquanto uma película plana teria um coeficiente de rugosidade baixa e baixa entropia, um filme com uma variação significativa na espessura teria um coeficiente de rugosidade alta, mas pode ainda ser baixa entropia se a variação for sinusoidal, ao invés de aleatórios. Neste caso, Rum diminuiu com o aumento de tensão de cisalhamento e tempo enquanto as tendências de TE não podem ser diretamente relacionadas com shear stress aplicado a formação de biofilme ao longo do tempo.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Figura S1 : Captura das janelas de software de controle de imagem. Janela de software com menu Multi Dimensional aquisição aberto (em cima). Módulo de controle definido para um AutoRun (parte inferior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> Figura S2 Captura do software para analisar dados de imagem. Janela do aplicativo depois de selecionar o conjunto de dados de interesse usando a ferramenta de Análise Multi Dimensional dados no menu de Ferramentas de análise . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos a utilização de um biorreator de maior rendimento microfluidic juntamente com um microscópio fluorescente para a análise dos efeitos da tensão de cisalhamento em biofilmes de Pseudomonas aeruginosa expressando proteínas fluorescentes verdes, incluindo o instrumento configurar, a determinação de propriedades morfológicas, taxa de crescimento e cobertura do biofilme.

Ao vivo celular análise de tensão de cisalhamento na Pseudomonas aeruginosa , usando um sistema automatizado de Microfluidic superior-taxa de transferência

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave, sobre o desenvolvimento de biofilmes, como como identificar as principais condições ambientais, que afetam o crescimento de biofilmes e características comportamentais durante o desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que as placas multicanalizadas e micro fluidicas permitem a rápida aquisição de resultados estatisticamente significativos. Embora este método possa fornecer insights sobre a estrutura de biofilme, ele também pode ser aplicado ao estudo de tratamentos antibióticos e bioremediação.Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão, pois é necessária uma atenção cuidadosa aos detalhes do protocolo e às habilidades meticulosas. Para evitar um erro da conexão do instrumento com o software, ligue primeiro a estação de trabalho do PC, seguido do módulo de fluorescência. Certifique-se de que o obturador de fluorescência está ligado e ligue os controladores de hardware.Em seguida, ligue o controlador do sistema de imagem e a câmera CCD. Então ligue a estação de imagens. Quando todo o equipamento estiver pronto, inicie a aplicação do controle e digite o número da placa, localizado na etiqueta na lateral da placa.Para escorraçar, primeiro remova a placa micro fluidíica 48 da embalagem, sem tocar na superfície do vidro na parte inferior da placa, e limpe o deslizamento de vidro na parte inferior da placa, com um tecido de lente. Para preparar os canais micro-fluidos, pipetas 200 microliters de 37 graus celsius meio mínimo para o poço de saída, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, coloque a placa no palco da placa.Limpe a interface com etanol, selando-a no palco da placa assim que o etanol secar. No modo manual no módulo de controle, ajuste o fluido como caldo luria-bertani a 37 graus celsius, e máximo como cinco dym por centímetro quadrado. Clique nos poços de saída para ativar o fluxo da saída para o poço de entrada, para prime os canais.Após cinco minutos, pause o fluxo para se preparar para a semeadura e retire cuidadosamente a placa do palco. Em seguida, aspire qualquer meio residual do poço de saída sem remover qualquer meio do círculo interno que leva aos canais micro-fluidos. Para semear os canais experimentais, adicione 300 microliters de meio mínimo no poço de entrada, seguido pela adição de 300 microliters de cultura bacteriana, no poço de saída.Volte a placa para o estágio de imagem certificando-se de limpar a interface com etanol antes de colocá-la na placa, e use o feed da câmera ao vivo para se concentrar em um único canal. Enquanto monitora visualmente a transmissão ao vivo, retome o fluxo de 1 a 2 centímetros quadrados por aproximadamente 2 a 4 segundos, para permitir que as células entrem no canal experimental, mas não nos canais serpentinos, e deixe a placa no estágio controlado pela temperatura por uma hora, para permitir que as células se conectem. No final do período de fixação, remova cuidadosamente a placa do estágio e aspire bem as bactérias da saída sem perturbar o canal.Em seguida, use uma nova ponta de pipeta para remover o meio dos poços de entrada. No software, abra aquisição multidimensional para controlar a aquisição de imagens do microscópio e selecione o lapso de tempo, posições de estágio múltiplo e múltiplos comprimentos de onda. Na guia de salvar, crie um nome base simples, certificando-se de que o nome base de incromentos se o arquivo existir, seja verificado.Inclua quaisquer detalhes essenciais do experimento na descrição. Clique no diretório de seleção, para selecionar a pasta em que todos os arquivos serão salvos Na guia lapso de tempo, ajuste a duração do tempo experimental, para 24 horas e defina o intervalo de tempo para adquirir imagens a cada cinco minutos ao longo do experimento. Use o feed de câmera ao vivo e o objetivo de 10x para definir as posições do palco, com foco no centro do canal, localizado acima ou abaixo dos números do canal gravados na placa.Mude para o objetivo de 20x, e localize a área de visualização ideal e o plano focal dentro do canal. Em seguida, adicione a posição do palco à lista com as novas configurações. Sob o menu de comprimentos de onda, defina o número de comprimentos de onda para 3, e defina o primeiro comprimento de onda para a câmera FITC 100%, com um tempo de exposição de dez milissegundos, o segundo comprimento de onda para brightfield 50% câmera 50% visível, com um tempo mínimo de exposição de 3 milivrégus e o terceiro comprimento de onda para todos fechados, de modo que nenhuma luz permanece no último canal entre os tempos de aquisição.No menu editar AutoRun, abra a guia de configuração do protocolo e defina um novo protocolo com uma duração de 24 horas com o fluxo definido na direção dianteira na taxa de cisalhamento experimental apropriada. Clique em adicionar e salvar para salvar o protocolo e abra a guia de configuração de sequência. Para configurar uma nova sequência, selecione o caldo Luria-Bertani a 37 graus, como o fluido padrão para todos os canais.Sob a iteração passo 1 para os canais 1 a 12, selecione o protocolo com a primeira taxa de tesoura experimental e habilite todos os canais. Para os canais 13 a 24, selecione o protocolo com a segunda taxa de tesoura experimental e habilite todos os canais. Em seguida, selecione Aplicar e Salvar Como, para salvar a sequência e abrir o menu AutoRun para selecionar a sequência salva a ser usada para o AutoRun.Para configurar o experimento de biofilme de crescimento cronometrado, adicione até 1300 microliters de meio mínimo estéril no poço de entrada da placa micro-fluidica, e devolva a placa ao estágio de imagem. Em seguida, limpe a interface com etanol e sele a placa. Confirme se os protocolos e sequências estão configurando corretamente.Selecione iniciar, iniciar o AutoRun e clique imediatamente em adquirir para iniciar a coleção de imagens do microscópio. No final da primeira aquisição de imagem, clique em pausa e selecione o modo de imagem ao vivo no comprimento de onda brightfield. Selecione ir para visualizar cada posição do estágio e selecione definir para corrente, para definir as novas configurações.Em seguida, clique em retomar, antes de iniciar a próxima aquisição programada. Neste experimento representativo de crescimento de biofilmes cronometrado, a cobertura de biofilm, ou área de superfície de limiar percentual, foi diferente para todas as três configurações de tesoura, indicando que a tesoura teve influência direta na cobertura da superfície do biofilme. A medição relativa total do acúmulo de biofilme, aumentou em função do tempo, com a taxa de crescimento caindo do maior estresse de tesoura para o menor estresse de tesoura.Em cada condição, houve também um período claro de crescimento exponencial a partir do qual uma taxa de crescimento quantitativo poderia ser calculada. No geral, o coeficiente de rugosidade diminuiu ao longo do tempo em todas as condições de corte, indicando que todas as superfícies do biofilme ficaram mais suaves. No entanto, em comparação com a cisalhamento mais baixo, as configurações mais altas da cisalhamento resultaram em uma superfície mais lisa ao longo do tempo, indicando que um fluxo de cisalhamento mais rápido contribui para uma superfície mais suave e uniforme.Além disso, a entropia textural, ou a aleatoriedade na morfologia, aumentou ao longo do tempo para todas as condições de tesoura. Ao realizar este procedimento é importante lembrar de seguir a sequência especificada e aproveitar o tempo para realizar cada passo com precisão. As habilidades necessárias podem levar algumas corridas para dominar.Após esse procedimento, outros métodos, como HBLC ou GCMS, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as concentrações de substraís, como a glicose, sendo consumidas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo dos biofilmes explorarem ambientes de fluxo geral em tempo real com condições experimentais controladas e amostragem de hidroterapia. Não se esqueça, que trabalhar com cepas bacterianas BSL2 pode ser extremamente perigoso, e que precauções como usar equipamentos de proteção adequados e usar protocolos de resíduos adequados devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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