Name: Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a avaliar parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural após transdução in utero em sistema nervoso de rato em desenvolvimento. Este método combina microscopia eletrônica de transmissão com intervenções precoces para investigar mudanças morfológicas.

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Os autores Agradecemos aos colegas do centro de animais na faculdade de medicina, Universidade de Ruhr Bochum, seus cuidados de suporte e animal.

Todos os procedimentos em assuntos animais foram aprovados pelas comissões institucionais de ética animal dos Estados Federados de Hamburgo e Nordrhein-Westfalen, Alemanha.  Use instrumentos estéreis, luvas e casacos assépticos ao longo de todo o procedimento cirúrgico.
1. no Utero transdução
<ol><li>Prepare o tipo de vírus adeno-associado 1 (AAV1) que codifica para o destino desejado (4 x 1011 viral partículas / µ l de AAV1) em tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4. Adicionar 0,1 mg / µ l Fast Green e manter a mistura de AAV1-Fast-verde a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar uma fina ponta capilar com a forma desejada (8 mm de comprimento, com um diâmetro externo de 80 µm e um interior diâmetro de 50 µm), usando um extrator de micropipeta (configurações: pressão = 500, calor = 700, puxar = 0, velocidade = 80, tempo = 200, consulte a tabela de materiais < / c1 >). Quebre a ponta do capilar para que é de 4-5 mm.</li>
	<li>Montar um tubo aspirador (44 cm x 0,7 cm) com a ponta capilar e Aspire 15 µ l da mistura verde-AAV1-Fast para o capilar.</li>
	<li>Manter os animais sujeitos a uma temperatura de corpo fisiológico constante de 37 ° C ao longo de todo o procedimento.</li>
	<li>Coloque um grávida rato C57Bl/6 (dia embrionário 14,5) na câmara de pré-incubação e anestesiar o mouse com isoflurano gasoso de 4% (com uma taxa de fluxo volumétrico de 0,6-0,8 L/min).</li>
	<li>Injecte por via subcutânea, a buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Coloque o mouse anestesiado na placa cirúrgica escaldada (37 ° C).</li>
	<li>Cubra os olhos com um lubrificante.</li>
	<li>Ajustar o mouse com a máscara de anestesia (gasosos isoflurano 1,5% a uma taxa de fluxo volumétrico de 0,6-0,8 L/min) na placa cirúrgica e barba na região da pele abdominal. Limpe a região depilada com 3 X 75% de etanol e, em seguida, com solução de betadine. Nota: Monitore o comportamento de respiração do rato anestesiado continuamente. Ajuste a concentração do gás de acordo com o padrão de inalação-exalação do mouse isoflurano.</li>
	<li>Para verificar a ausência do reflexo plantar apertando as falanges da pata traseira do mouse.</li>
	<li>Abrir a cavidade abdominal, segurando a pele com pinças curvas íris serrilhada (10 cm) e corte a pele ao longo da mediana de linea com tesoura reta carboneto de tungstênio (10 cm) e em seguida, agarrando-se a parede peritoneal com pinça reta de Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0,12 milímetros) e corte da parede ao longo da linea alba com Vanna reta tesouras (8 cm).</li>
	<li>Um pedaço de filme de parafina fenestrado sobre a abertura abdominal e fixar o filme em ambas as extremidades com pinça hemostática de micro-mosquito (12,5 cm, curvada).</li>
	<li>Expor os cornos uterinos com um colher-como o dispositivo para não danificar os embriões dentro os cornos uterinos. Pingar algumas gotas de PBS (37 ° C) sobre os cornos uterinos e inspecionar os embriões por danos ou malformações dentro do sac uterina.</li>
	<li>Documente a ordem e a posição dos embriões nos cornos uterinos. Transformar os embriões cuidadosamente dentro do sac uterino até atingir a posição desejada para a injeção.</li>
	<li>Injecte 1-2 µ l da mistura verde-AAV1-Fast inspecionando visualmente o local da injeção (por exemplo, ventrículos do cérebro) e a penetração do corante sob um estereomicroscópio.</li>
	<li>Documentar os embriões injetados e colocar os cornos uterinos com os embriões injetados volta na cavidade abdominal.</li>
	<li>Pinga algumas gotas de PBS (37 ° C) na cavidade abdominal. Feche a cavidade por sutura da parede peritoneal (uso poliamida 6-0 tamanho suturas) e a pele (uso poliamida 3-0 tamanho suturas), usando a pinça hemostática de Halsted mosquito (12,5 cm, curvada). Como alternativa, use um padrão simples interrompido ou sutura/grampos de aço inoxidável para fechar a cavidade abdominal e a pele.</li>
</ol>2. Telemacrophotography de tecidos isolados
<ol><li>
Preparação de buffers
	<ol>
<li>Prepare o tampão do Sörensen (1 L) por dissolução 14,95 g de Na2HPO4 e 2,18 g de KH2PO4 em 1 litro de água destilada sob agitação a 200 rpm. Para perfusão de tarde filhotes de gestação e/ou filhotes no pós-parto a períodos de tempo, use um tamanho adequado de agulhas para injeção abdominal ou intragástrico e certifique-se que a concentração da anestesia terminal de sódio pentobarbital não ultrapasse 180 mg / kg de peso do corpo.</li>
		<li>Preparar a solução de fixação do Mugnaini (5 L) pelo aquecimento de 500 mL de água destilada para 75 ° C e adicionar 50 g de pó de paraformaldeído sob agitação a 200 rpm, adicionando 200 µ l de 5 N NaOH, adicionando 1.500 mL de tampão de Sörensen, 1.750 mL de água destilada e 500 mL de 25% de glutaraldeído. Encha até 5.000 mL com água destilada. Use este buffer final para perfusão. Nota: Preparar a solução de fixação do Mugnaini sob o capô, usar óculos de protecção e evitar emanações. Adicione o azul de metileno (0,05 g/L) para uma melhor visualização da perfusão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento de perfusão e tecido de mouse
	<ol>
<li>Transcardially perfundir os ratos grávidas que carregam os embriões transduzidos (no caso de estudos de embrião) ou os pubs transduzidos nasceu com a idade desejada (por exemplo, pós-Natal dia 24), de acordo com os procedimentos padrão6,7, 11,12,13,14,15,16,17, utilizando pentobarbital de sódio terminal intraperitoneal anestesia (200 mg/kg de peso corporal).</li>
		<li>Injetar o transcardially de ratos com solução de heparina (500 U) usando um 26 G, 1 na agulha e, antes da fixação, infundir os ratos transcardially com 10 mL de PBS para lavar o sangue do corpo e perfundi-los transcardially com 30 mL do 40 ° C pré-aquecido Mugnaini solução de fixação. Nota: Para os ratos adultos, execute uma alternativa perfusão retrógrada através da aorta abdominal,14.</li>
		<li>Isolar o tecido perfundido de interesse (por exemplo, todo o cérebro ou medula espinhal) e sufixo o tecido em pelo menos 10 mL da solução de fixação do Mugnaini para outro 24 h a 4 ° C.</li>
		<li>Lave o tecido em 10 mL de PBS para 3h em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incorporação em agarose, além de documentação e corte
	<ol>
<li>Ajuste o tecido isolado (por exemplo, cérebro) em um quadro especial com um reprodutíveis corte ângulo8,9,10. Como alternativa, use um vibratome com uma espessura de corte ajustável.</li>
		<li>Coloque o tecido nervoso no quadro, ajustar o tecido para telemacrography e documentar as coordenadas.</li>
		<li>Prepare 3% suporte de incorporação de agarose de baixo ponto de fusão: Adicionar 3 g de agarose em 100 mL de tampão de Sörensen e aquecer a mistura em um banho de água a 90 ° C.</li>
		<li>Despeje a agarose a 3% (30 ° C) no quadro que contém o tecido. Cobrir a moldura com um bloco de metal quente e esperar até que seja endurecimento. Durante o endurecimento, use dispositivos de telemacrographic para o tecido incorporado e suas coordenadas dentro do quadro da imagem.</li>
		<li>Transferi o tecido de agarose-incorporado em um quadro com as lacunas de corte correspondente para as coordenadas do primeiro quadro.</li>
		<li>Corte o tecido incorporado em seções de espessura desejada (por exemplo, 1,5 mm) com um dispositivo com uma lâmina fina e vibração (ver Tabela de materiais). Nota: Para melhorar o deslizamento da lâmina da navalha, pinga algumas gotas de glicerina para o tecido incorporado.</li>
		<li>Imagem de cada seção de tecido em PBS e coletar as imagens em uma pasta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação do tecido isolado para microscopia eletrônica de transmissão
Nota: Execute todos os novos passos de incubação em pratos de vidro com tampas firmemente afixadas em uma plataforma de agitação sob o capô.
<ol><li>Lave as secções de tecido para 2 x 30 min em PBS. Incube as secções em solução a 2% aquosa tetróxido de ósmio (OsO4) por 2 h à temperatura ambiente. Atenção: Tetróxido de ósmio é tóxico e pode ser prejudicial quando ele entra em contato com a pele.</li>
	<li>Lave as seções osmicated para 2 x 30 min em PBS.</li>
	<li>Incubar as secções em 30%, 50% e 70% de etanol à temperatura ambiente por 10-15 min (opcional: incubar em etanol a 70% em 4 ° C durante a noite).</li>
	<li>Imagem do osmicated espécimes em etanol a 70% sob LED RGB luz8,9,10 (2 x 15 W) aplicados à amostra da esquerda e da direita num ângulo de 45 °. Use pratos pretos e um fundo preto fosco para minimizar o espalhamento e a reflexão da luz durante a iluminação. Atenção: Não permita que a seção secar durante a imagem latente.</li>
	<li>Crie um atlas das imagens seção com coordenadas através da recolha de imagens em série em uma pasta.</li>
	<li>Incube as amostras em 100% de etanol (2 x por 30 min) e 100% óxido de propileno (2 x por 30 min) à temperatura ambiente. Atenção: Não permita que as seções para secar enquanto alterar soluções.</li>
	<li>Mix de 260 mL de resina com 240 mL de anidrido dodecenylsuccinic em um recipiente de vidro, agitando-se suavemente com uma barra de vidro. Verifique periodicamente para homogeneidade, bolhas e manchas. Muito suavemente, mexa com a mão pelo menos 45 min.</li>
	<li>Prepare-se óxido de propileno/resina na proporção de 1:2 e 1:1 e adicionar 3% de accelerator (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).</li>
	<li>Incube o tecido no 1:2 incorporação de solução do passo 3.8 para 2 h e depois na solução 1:1 incorporação da etapa 3.8 para 2 h à temperatura ambiente em uma roda giratória.</li>
	<li>Coloque o tecido em polipropileno liso pratos, cubra o tecido com resina fresca contendo 3% de accelerator e curar o tecido incorporado em 65-85 ° C por 12-24 h.</li>
	<li>Arrefecer o tecido incorporado à temperatura e retirar as amostras de resina-incorporado os pratos de polipropileno.</li>
</ol>4. seleção de neuroplasticidade ultraestrutural parâmetros para análise quantitativa
<ol><li>
Mapeamento da área de interesse
	<ol>
<li>Escolha uma área de interesse (por exemplo, hipocampo ou cerebelo) e localizar a área no atlas de seção, escolhendo a imagem do atlas (passo 3.5) que contém esta área.</li>
		<li>Esboçar as fronteiras da área de interesse para a imagem de seção e encontrar/sobrepor estas fronteiras da região para a amostra de resina.</li>
		<li>Zero-marca as fronteiras da área de interesse (por exemplo, hipocampo ou cerebelo) sobre a amostra de resina, usando um medidor de agulha fina (26 G, 1 in).</li>
		<li>Aquece a amostra de resina a 85 ° C em um forno para amolecer a resina para o aparamento ou, alternativamente, usar um dispositivo de corte, uma lâmina fina ou lixa.</li>
		<li>A área de interesse, a amostra de resina com uma lâmina de barbear impostos especiais de consumo (ver Tabela de materiais). Monte o espécime segurando barras de vidro acrílico do calibre necessário por exemplo, com (diâmetro de 8 mm) e um comprimento de 1 cm com cola. Desbaste a amostra montada para semie ultrafinos de seccionamento.</li>
		<li>Preparar semithin (0,75 µm) e ultrafinos (70 nm) seções da área aparada usando um ultramicrotome: defini-la a 1,5 mm/s para 0,75 µm de espessura e a 0,7 mm/s para a espessura de 70 nm.</li>
		<li>Recolher as seções semithin em suportes de vidro e as seções com toluidina 1% de mancha azul em PBS (para 4 min).</li>
		<li>Lave as seções várias vezes em água desionizada. Examinar as seções manchadas ao microscópio de luz usando 4x (nd de 0.1 ∞ /-), 10 x (de 0.22 ∞/0.17), 40 x (de 0.65 ∞/0.17) e 100 x objetivos (de 1.25 ∞/0.17).</li>
		<li>Recolha seções ultra-finas nas grades de níquel. Submeter as grades a temperatura em 180 kV e a 3, 200 x, 6, 000 x, e/ou ampliação de x 8.000.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de temperatura
	<ol>
<li>Escolha os parâmetros ultraestrutural de interesse para a análise quantitativa da temperatura (por exemplo, boutons com vesículas e mitocôndrias ou axônios mielinizados e nonmyelinated) e tomar TEM imagens desses parâmetros abaixo dos 3, 500 x, x 6.000 e/ou ampliação de x 8.000.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex%3A+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).</li>
<li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li>
<li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+Fine+Structure+of+the+Nervous+System%22">The Fine Structure of the Nervous System</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).</li>
<li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li>
<li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li>
<li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li>
<li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferenzph%C3%A4nomene+am+osmierten+Pr%C3%A4parat+f%C3%BCr+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139(1974).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndres%2C+KH+%22Principle+and+Techniques+of+Electron+Microscopy%3A+Biological+Appliccations%22">Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations</a>. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndres%2C+KH+%22Techniques+in+Neuroanatomical+Research%22">Techniques in Neuroanatomical Research</a>. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).</li>
<li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li>
<li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li>
<li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S%C3%A4ugern%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern.</a> Mikroskopie. 21, 169(1967).</li>
<li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+%C3%A9lectronique.+Essai.+De+g%C3%A9n%C3%A9ralisation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Microscopie%22%5BJournal%5D)">Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li>
<li>Descarries, L., Schröder, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+%C3%A0+grand+debit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Microscopie%22%5BJournal%5D)">Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li>
<li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Records%22%5BJournal%5D)">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84(2014).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48(2017).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).</li>
<li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960(2012).</li>
<li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li>
<li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um passo crucial de transdução no útero é o procedimento de injeção. A injeção precisa em ventrículos cerebrais ou em outra área de interesse requer experiência e habilidade de hands-on. A mais fina a ponta de conta, o menor dano tecidual pode ocorrer; no entanto, isto é à custa do aumento da pressão de injeção. Em contraste com eletroporação no útero19,20,21,22, a taxa de sobrevivência dos emb...

O fóton não pode penetrar uma amostra de tecido ultrafinos no grau de profundidade de um elétron. Isto atribui vantagens inestimáveis para TEM na captura de imagens de resolução nanômetros de belas estruturas quando comparado às técnicas de microscopia de luz. Por exemplo, TEM permite a visualização de organelas intracelulares, tais como mitocôndrias, melanossomas e vários tipos de grânulos secretórios, microtúbulos, microfilamentos, cílios, microvilli e junções intercelulares (superfície de célula especializações), em particular as sinapses no sistema nervoso1,2,3,4. O objetivo geral do presente estudo metodológico é o reconhecimento ultra-estrutural do mudanças na plasticidade neural durante o desenvolvimento, após interferência de pré-natal, combinando as técnicas do estado-da-arte de transdução no útero e TEM. Viralmente codificadas proteínas de interesse tem sido transfectadas no útero para o sistema nervoso central5,6,7, incluindo a medula espinhal6. Por exemplo, no útero transdução em combinação com a temperatura tem sido usada por estudando o efeito da molécula de adesão celular L1 na aprendizagem plasticidade em camundongos deficientes em L1, em particular no que se refere a interação entre L1 e proteínas do receptor nuclear de motor em neurônios Cerebelares7.
A análise dos parâmetros de neuroplasticidade requer informações precisas sobre a localização das áreas menores dentro do sistema nervoso. Portanto, é adequada descrever detalhes ultraestrutural e sua orientação topográfica exata em relação a outras estruturas. No presente estudo, é apresentado um método específico preparatório visando a investigação detalhada de áreas morfológicas distintas com base em luz e microscopia eletrônica. Esta abordagem combina várias técnicas de manipulação do tecido, começando no útero transdução da medula espinhal e cérebro de rato e seguido por fixação de perfusão, molde-incorporação e processamento de tecido para dez. Um passo essencial incluído entre a incorporação e a transformação do tecido para TEM é a documentação do tecido, usando a técnica de reflexão da luz de interferência que permite a documentação precisa de microphotographic e baixo-ampliação de espécimes do tecido8,9,10. Incorporada a presente abordagem, esta técnica permite que pesquisadores examinar detalhes topográficos e estruturais das superfícies de tecido nervoso e de perfis de fatia de amostra antes da sua preparação para a temperatura.
Um frame especial para secionar todo cérebro corresponde a coordenadas estereotáxicos. Este quadro beneficia morfológica reconstrução tridimensional (3D) de áreas no tecido nervoso e pode ser usado para Análise morfométrica. Os macrographs das seções visualizadas são atribuídos coordenadas topográficas e as seções numeradas em série construir mapas em um atlas de tecido.
Após processamento de resina, o tecido incorporado é seccionado em seções ultrathin (< 70 nm) que contém áreas selecionadas, de acordo com os mapas do atlas tecido acima mencionados. As seções ultra-finas estão sujeitos a temperatura para obter imagens de alta resolução dos parâmetros de plasticidade (e.g., seção transversal perfil áreas de boutons sinápticas ou fibras axonal) do seu conteúdo e de contatos para estruturas vizinhas, dentro do complexo neurópilo.
Com o método descrito neste documento, a transição suave de macrostructures visualizado para micro e nanoestruturas permite comparativos estudos aprofundados de plasticidade neuronal morfológica depois no utero transdução do desenvolvimento nervosa sistema.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tris(dimetil-aminometil)fenol</td><td>Serva</td><td>36975</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 1'' agulha</td><td>Henke-Sass, Wolf GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>410 Unidade de Anestesia para bomba de ar</td><td>Instrumentos Biomédicos (Univentor)</td><td>8323102</td><td></td></tr><tr><td>Vírus adeno-associado sorotipo 1 (AAV1)</td><td>UKE (Viral Core Facility)</td><td>-</td><td>Para referências e áreas-alvo de AAV1, consulte: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ e também: Vetores de entrega de genes projetados: engenharia molecular e evolução de vetores virais adeno-associados para transferência aprimorada de genes. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 março; 25(3):489-99. Os vetores virais AAV recombinantes pseudotipados com capsídeos virais dos sorotipos 1, 2 e 5 exibem eficiência diferencial e tropismo celular após a entrega em diferentes regiões do sistema nervoso central. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. Agosto de 2004; 10(2):302-17. Os vetores de vírus adeno-associados recombinantes auto-complementares (scAAV) promovem a transdução eficiente independentemente da síntese de DNA. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. Agosto de 2001; 8(16):1248-54.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>baixa gelificação agarose</td></tr><tr><td>Bomba de ar</td><td>Instrumentos biomédicos (Univentor)</td> <td>Eheim 100</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>CIBA-GEIGY</td><td>23857.9</td><td>resina para incorporação de</td></tr><tr><td>conjuntos de sintonia de aspirador</td> de tecidos <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Máscara de respiração Mouse Instrumentos biomédicos de alumínio anodizado</td><td>(Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td>Temgesic</td><td>ampolas</td><td>analgésicos</td></tr><tr><td>capilares</td><td>Ciência-Produtos</td><td>GB100TF-10</td><td>com filtro</td></tr><tr><td>Anidrido dodecenilsuccínico</td><td>Pinça Fluka</td><td>44160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (#3, 12 cm, reta, 0,2 x 0,12 mm)</td><td>FST</td><td>11203-23</td><td></td></tr><tr><td>barbeador elétrico</td><td>Phillips</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Suturas de Ethicon (Ethilon, 6-0 e 3-0)</td>Lubrificante ocular de <td>poliamida</td> <td>de Ethicon-Fast</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Bepanthene-Fast</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>para visualização de líquidos injetados Interruptor de</td></tr><tr><td>Roteamento de Gás Conectores 4/2</td><td>Instrumentos Biomédicos (Univentor)</td><td>8433020</td><td></td></tr><tr><td>pinça hemostática de Mosquito halsted (12,5 cm, reta)</td><td>FST</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparina-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>25 000 I.E./5 mL</td></tr><tr><td>Caixa de indução para camundongos com tampa que se move horizontalmente. Dimensões internas: CxLxA: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Espessura da parede: 6 mm</td><td>Instrumentos Biomédicos (Univentor)</td><td>-pinça de</td><td></td></tr> <tr><td>íris (10 cm, curva, serrilhada)</td><td>FST</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>tesoura de íris (11 cm, reta, carboneto de tungstênio)</td><td>FST</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran OP Tisch, aquecido eletricamente, sm Dimensões externas: 257 mm x110 mm x 18 mm. Área de aquecimento: 190 mm x 90 mm A remoção do isoflurano escapando a máscara respiratória é feita para baixo em conformidade com os regulamentos Biomedical</td><td>Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano (Attane)</td><td>JD medical</td><td></td><td>anestesia inalatória</td></tr><tr><td>LED Luzes RGB</td><td>Cameo</td><td>CLQS15RGBW</td><td>LEDs 2 x 15 W</td></tr><tr><td>Microscópio óptico Basic DM E</td><td>Leica-4x</td><td></td> <td>(N.A. 0,1 &infin;/-), 10x (N.A. 0,22 &infin;/0,17), 40x (N.A. 0,65 &infin;/0,17), 100x (N.A. 1,25 &infin;/0,17) objetivas</td></tr><tr><td>extrator de micropipetas</td><td>Science-Products</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pinça hemostática para mosquitos (12,5 cm, curvo)</td><td>FST</td><td>13010-12</td><td></td></tr><tr><td>Grelhas de níquel, 200 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>1GC200</td><td></td></tr><tr><td>Ósmio (VIII)-óxido</td><td>Degussa</td><td>73219</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>Fluka</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de barbear</td><td>Schick</td><td>87-10489</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital de sódio (Narcoren)</td><td>Merial GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TC01mR 1-Channal controlador de temperatura com feedback</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Technovit 4004 cola de dois componentes</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telemacrodevice</td><td></td> <td>Canon-Canon</td> <td>Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extensão abaixo de 150 mm, Tubo de extensão manual Anel de 7 mm, Anel de 14 mm, Anel de 28 mm, Anel reverso macro (58 mm), Suporte de cópia Canon.</td></tr><tr><td>Termoextrator P-97</td><td>Sutter</td> <td>Instruments-dispositivo</td><td></td></tr> <tr><td>de lâmina de barbear vibratória fina</td><td>Krup-com</td><td></td> <td>lâminas finas Szabo</td></tr><tr><td>azul toluidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão C20</td><td>Phillips-até</td><td></td> <td>200 kV</td></tr><tr><td>Tygon 6/4 Material de tubulação para conexão de todas as peças Diâmetro externo: 6 mm Diâmetro interno: 4 mm Espessura Wa ll: 1 mm</td><td>Instrumentos Biomédicos (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut E</td><td>Reichert-Jung-ultramicrótomo</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Univentor Scavenger</td><td>Instrumentos Biomédicos (Univentor)</td><td>8338001</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Vannas (8 cm, reta)</td><td>FST</td><td>15009-08</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

O presente estudo combina transdução no útero com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) com o objetivo de uma análise morfométrica precisos dos parâmetros ultra-estruturais em inequivocamente identificadas estruturas topográficas, afetados por uma proteína de interesse que é introduzido no organismo através de transferência viral. Esta abordagem combinada permite uma transição suave de macrostructural para identificação ultraestrutural pelos seguintes mapas topográficos de navegação em um atlas de tecido. Microscopia eletrônica de alta resolução do tecido em-utero-transfectadas revela a ultraestrutura bem o neurópilo e seus parâmetros de plasticidade, como áreas seccionadas bouton sinápticos, o número de vesículas sinápticas e mitocôndrias dentro de um Perfil de Bouton, o comprimento de contatos sinápticos, áreas axonal seccionadas, a espessura das bainhas de mielina, o número de lamelas de mielina e seccionadas áreas de perfis de mitocôndrias. A análise destes parâmetros revela essenciais insights sobre alterações de plasticidade ultra-estruturais nas áreas do sistema nervoso que são afetados pela transferência viral da construção de genética. Este método combinado não só pode ser usado para estudar o efeito directo de biomoléculas geneticamente modificadas e/ou drogas na plasticidade neuronal, mas também abre a possibilidade de estudar o resgate no útero de plasticidade neuronal (por exemplo, no contexto da doenças neurodegenerativas).

Para anestesia é confiável e rápida de ratos, inúmeros parâmetros de segurança foram considerados, e uma área de trabalho otimizada da unidade de anestesia provou para ser adequado (Figura 1A). A unidade é projetada para controlar a mistura de isoflurano líquido e ar ambiente com uma precisão exigida para a bem sucedida cirurgia em pequenos animais, como camundongos e ratos. Ar e isoflurano são misturados no vaporizador de acordo com as confi...

A combinação de microscopia eletrônica de transmissão e transdução no útero é uma poderosa abordagem para o estudo de mudanças morfológicas na ultraestrutura fina do sistema nervoso durante o desenvolvimento. Este método combinado permite insights profundos sobre mudanças em detalhes estruturais subjacentes neuroplasticidade no que diz respeito a sua representação topográfica.

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Nossa abordagem combinada ajuda a responder como os parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural mudam após intervenções de desenvolvimento precoces ao sistema nervoso nascente no útero. A principal vantagem do nosso método é a aquisição de imagens de alta resolução de macro-meso-micro-e nanoestruturas no sistema de coordenadas predefinido dentro de um atlas de tecido. A implicação do nosso método é seu potencial terapêutico translacional para doenças neurodegenerativas congênitas.Por exemplo, tratamento e resgate em estágios embrionários usando isso na técnica de transdução do útero. Nosso método pode ser aplicado a qualquer outro modelo. Por exemplo, as espécies de camundongos podem ser alteradas, bem como a área de interesse.Pesquisadores que tentam nosso método pela primeira vez precisam de treinamento cirúrgico profundo, bem como o conhecimento de como preparar o tecido para imagens microscópicas eletrônicas. Comece carregando uma ponta capilar personalizada contendo quatro vezes 10 às 11 partículas virais do revestimento do vírus associado ao adeno tipo 1 para o alvo desejado, e rotulado com corante Fast Green em um tubo aspirador. Adicione 15 microliters das partículas de vírus adeno rotuladas no capilar.Em seguida, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um camundongo anestinado embrionário 14,5, e desinfete a pele. Use fórceps de íris serrilhadas curvas e tesouras de carboneto de tungstênio reto para fazer uma incisão de pele ao longo da linha mediana. Usando pinças retas de Dumont para segurar a parede peritoneal, continue ao longo da linha alba com uma tesoura vannas reta e coloque um pedaço de filme de parafina fenestrated sobre a abertura abdominal e use um dispositivo semelhante a colher para expor os chifres uterinos sem danificar os embriões dentro dos chifres.Depois de aplicar algumas gotas de PBS de 37 graus Celsius nos chifres uterinos, inspecione os embriões em busca de danos ou malformações dentro do saco uterino. Gire os embriões cuidadosamente dentro de seus sacos até que a posição desejada para cada injeção seja alcançada. Quando os embriões estiverem no lugar, injete um a dois microlitadores da solução de partículas de vírus rotulada pelo Fast Green em cada embrião.Depois de todos os embriões terem sido injetados, coloque os chifres uterinos de volta na cavidade abdominal, e adicione algumas gotas de PBS de 37 graus Celsius no abdômen. Em seguida, use suturas de tamanho poliamida 6-0 para fechar a parede peritoneal e as suturas de tamanho poliamida 3-0 e fórceps hemostáticos mosquito de Halsted para fechar a pele. Para incorporar tecidos isolados de interesse para fotografia tele-macro, coloque a amostra de tecido em um quadro especial com o ângulo de secção reprodutível e documente as coordenadas.Encha o quadro com 30 graus-Celsius 3% agarose até que o tecido esteja coberto, e cubra a estrutura com uma tampa plástica até que a agarose tenha endurecido. Enquanto a agarose está endurecendo, use o dispositivo gráfico tele-macro para imaginar o tecido incorporado e suas coordenadas dentro do quadro. Quando a agarose se solidificar, transfira o tecido incorporado à agarose para o quadro com lacunas de corte correspondentes às coordenadas do primeiro quadro.Use um dispositivo com uma lâmina de barbear fina e vibrante para cortar o tecido incorporado em seções de uma espessura experimental apropriada. Em seguida, exa imagem cada seção de tecido no PBS e coletar as imagens em uma pasta. Para preparar as amostras de tecido para a microscopia eletrônica de transmissão, em um armário de biossegurança, lave as seções teciduais com duas lavagens de 30 minutos em PBS, seguidas de uma incubação de duas horas em solução de tetroxida de 2%aquoso de ósmio à temperatura ambiente.Ao final da incubação, lave as seções osmicadas mais duas vezes em PBS por 30 minutos por lavagem e desidrate as seções em imersões sequenciais de etanol de 10 a 15 minutos, conforme indicado. Após a imersão de 70% de etanol, coloque cada amostra em um prato preto em um fundo preto maçante e imagem as amostras em 70% de etanol sob luz LED RGB aplicada às amostras dos lados esquerdo e direito em ângulos de 45 graus. Crie um atlas das imagens da seção com coordenadas coletando imagens das amostras em série em uma pasta.Trate os espécimes com duas incubações de 30 minutos e 100% de etanol, seguidos por duas incubações de óxido de propileno de 30 minutos, ambas em temperatura ambiente. Enquanto as amostras estão incubando, misture resina recém-preparada com óxido de propileno em proporções de um para um e de um a dois, e adicione 3% de acelerador a ambas as soluções. Após a segunda incubação de óxido de propileno, transfira as amostras para a solução média de incorporação de óxido de propileno de resina de uma a duas por duas horas à temperatura ambiente, seguida de uma incubação de duas horas na solução de incorporação de óxido de propileno de resina de um para um à temperatura ambiente.No final da segunda incubação, transfira os tecidos em pratos de polipropileno plano, e cure os tecidos embutidos com resina fresca contendo acelerador de 3% por 12 a 24 horas a 65 a 85 graus Celsius. Em seguida, esfrie o tecido à temperatura ambiente, e remova as amostras embutidas em resina dos pratos de polipropileno. Para mapear uma área de interesse, selecione uma imagem contendo a área de interesse do atlas de imagem previamente preparado.Esboce as bordas da área de interesse na imagem seccionada, sobrepõe opticamente essas bordas ao espécime incorporado sob o microscópio, e use uma agulha de calibre de 26 polegadas para arranhar essas bordas da região no espécime de resina. Em seguida, aqueça os espécimes a 95 graus Celsius, a fim de suavizar a resina. Em seguida, retire os espécimes de resina quente do forno, e use uma lâmina de barbear para extiridar as áreas de interesse.Cole os espécimes em barras de vidro acrílico do calibre apropriado e corte os espécimes montados para seção semi e ultrafina. Use um ultramicroome para adquirir seções semifinas de 0,7 micrômetros e seções ultrafinas de 70 nanômetros, coletando as seções semifinas em portadores de vidro e as seções ultrafinas em grades de níquel. Manche as seções semifinas com 1%azul toluidina em PBS por quatro minutos, seguidas por várias lavagens em água desionizada, antes de examinar as seções por microscopia leve.As seções ultrafinas podem então ser diretamente avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão a 180 quilovolts sem modificações adicionais. Após a secção, as fatias de tecido são imagens pela fotografia tele-macro como apenas demonstrado. Após a osmicação e a imersão do etanol, as seções são novamente imagens por interferência da tele-macografia leve, revelando um padrão especificamente colorido para cada superfície do tecido.Após desidratação adicional e incorporação de resina, as áreas de interesse são selecionadas e processadas para a microscopia eletrônica de transmissão. No hipocampo e no cerebelo, as sinapses de fibra de musgo são conhecidas por apresentar características ultraestruturais únicas quando comparadas a outras sinapses, incluindo grandes boutons pré-sinápticos. Em seus perfis transversais, os boutons contêm um grande número de vesículas e mitocôndrias, e muitas vezes incluem várias espinhas dendríticas.Na medula espinhal, o funiculus dorsal contém muitas fibras axonais que são mielinadas por oligodendroglia. Nas seções transversais, o funículo dorsal pode ser encontrado entre os chifres posteriores da medula espinhal. Em imagens de microscopia eletrônica de transmissão, axônios mieliados transversais aparecem redondos, e as baias de mielina ao redor dos axônios são organizadas no lamellae.O atlas preparado e as imagens micrográficas de microscopia eletrônica de transmissão dos parâmetros ultraestruturais não são apenas úteis para a comparação da neuroplasticidade morfológica de diferentes seções em várias condições de tratamento, mas também para comparações entre parâmetros dentro da mesma área. Lembre-se de planejar e preparar-se minuciosamente antes de iniciar a transdução no útero, e certifique-se de ter backup de materiais e instrumentos em caso de complicações. Seguindo nosso método, outras técnicas podem ser adicionadas, como rotulagem de imunogold antes da microscopia eletrônica para rastreamento ultraestrutural de uma molécula de interesse definida.Começando com uma visão holística de todo o organismo e ampliando-se em direção à topografia molecular, somos capazes de estudar e manipular a relação entre função tecidual e morfologia. Tetroxida de ósmio é perigoso. Certifique-se de sempre trabalhar sob o capô, e usar óculos de proteção e luvas de mão ao trabalhar com este reagente.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

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Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

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Aprenda a avaliar parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural após transdução in utero em sistema nervoso de rato em desenvolvimento. Este método combina microscopia eletrônica de transmissão com intervenções precoces para investigar mudanças morfológicas.

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

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