Name: Sideróforo elevado-throughput Screening de amostras ambientais: tecidos, Bulk solos e solos de rizosfera de plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Aprenda a triagem de alta vazão de sideróforos em amostras ambientais de solos e tecidos vegetais. Este método permite avaliar a atividade microbiana e a disponibilidade de ferro para plantas em comunidades intactas.

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Os autores desejam agradecer a Kalyani Muhunthan para assistência em procedimentos laboratoriais, Lee Opdahl para a colheita do trigo genótipo, Conselho de pesquisa de Washington estado Uva Concord e centro de Universidade do estado de Washington para sustentar a agricultura e Recursos naturais para um BIOAg conceder para apoiar este trabalho. Adicionais de financiamento foi fornecido pelo USDA/NIFA através de projeto da Hatch 1014527.

Nota: Localização do campo local: Universidade do estado de Washington, a fazenda de patologia de plantas (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). As sementes foram semeadas usando um plantador de mecânico em 19 de outubro de 2017. Cada genótipo de trigo foi plantado em headrows, aproximadamente 1 medidor distante para evitar a sobreposição do sistema radicular. Amostras de solo e planta foram coletadas em 9 de agosto de 2018, quando as plantas estavam prontas para a colheita. Amostras foram coletadas de três repetições de quatro genótipos de trigo: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. preparação do meio modificado de M9
<ol><li>Uso at2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) e NH4Cl (1G/20ml) reagentes para preparar a solução de sal de M9.</li>
	<li>Use 18 g de MgSO4∙7H2O em 100 mL de água desionizada dupla (ddH2O) para preparar 0,75 M MgSO4∙7H2O.</li>
	<li>Fazer 1 M de CaCl2∙2H2O adicionando 14,7 g de CaCl2∙2H2O com 100 mL de DDQ2O.</li>
	<li>Prepare a solução-tampão, dissolvendo 6,048 g de tubulações em 156 mL de DDQ2O agitando. Ajuste o pH para 6,8 com 5 M de NaOH.</li>
	<li>Prepare-se 20% de glicose (dextrose monohidrato) dissolvendo-se 20g de glicose em 100 mL de DDQ2O.</li>
	<li>Prepare soluções e individualmente autoclave todos mas a glicose. Filtro de esterilizar a solução de glicose para adição à mídia M9 após autoclavagem (0,22 µm).</li>
	<li>Preparar o meio modificado de M9 misturando 156 mL de solução-tampão de tubulações, 40 mL de solução de sais M9, 20 μL de solução de2O CaCl2·2H e 266 μL de MgSO4·7H2O 4 mL de soluções de glicose 20% juntos na biossegurança armário, usando uma técnica estéril.</li>
	<li>Para preservação do M9 modificada, sele o recipiente, cobrir com papel alumínio para proteger de UV e colocar a 4 ° C.</li>
</ol>2. preparação de CAS-Fe-ágar-ágar
<ol><li>Ácido lavar todos os copos em 100mm HCl/100 mM HNO3 por um período mínimo de 2 h antes da utilização no ensaio CAS.</li>
	<li>Prepare uma assadeira de alumínio preenchida com areia de grau de laboratório e cubra com papel alumínio. Autoclave a 121 ° C por 30 min e reserve.</li>
	<li>Prepare HDTMA (brometo de hexadeciltrimetilamónio), acrescentando 0,0365 g de 20ml ddH2O e colocar a solução a 37 ° C, para promover a solubilização.</li>
	<li>Preparar 10 mM HCl e gerar 1 mM FeCl3·6H2O uso do HCl de 10 milímetros como solvente. Adicione 0,0302 g de CAS para 25 mL de DDQ2O agitando suavemente com uma barra de agitação magnética estéril. Em seguida, adicione 5 mL de 1 mM FeCl3·6H2O (em HCl de 10 milímetros) para os 25 mL de solução de CAS, continuando a agitar suavemente (a solução transforma cor preto avermelhado escuro).</li>
	<li>Adicione lentamente a 20 mL de solução HDTMA, agitando suavemente, para a solução de Fe-CAS (isso resulta em uma solução azul escura).</li>
	<li>Prepare a solução-tampão, dissolvendo 15,12 g de tubulações em 375 mL de DDQ2O, com agitação suave. Ajuste o pH para 6,8 com 5 M de NaOH. Adicione água para o volume para 450 mL. Adicione 5 g de agarose para a solução. Autoclave os tubos buffer de solução e a solução CAS-Fe a 121 ° C por 30 min.</li>
	<li>Cuidadosamente, adicione a totalidade da solução CAS-Fe para a totalidade da reserva no armário a biossegurança tubos após cada um deles é esterilizado.</li>
	<li>Coloque a solução mista em um banho de água a 50 ° C. Nota: Recentemente prepara todos os reagentes no meio de ágar-CAS-Fe antes de cada ensaio, como o armazenamento a longo prazo em 50 ° C resulta na precipitação dos resultados complexos e resfriamento CAS-Fe em meio solidificado.</li>
	<li>Coloque um barco de reagente estéril na areia estéril no armário a biossegurança e calor de 50 ° C. Transferi o CAS-Fe-Agar para o barco e, em seguida, rapidamente alíquota 100 µ l de cada poço em uma microplaca de 96 poços claro, fundo plano, estéril.</li>
</ol>3. preparação-padrão Pyoverdine/EDTA
<ol><li>Preparação do Pyoverdine<ol>
<li>Preparar 800 μM pyoverdine padrão (mistura de ácido succínico, 2-hidroxi-glutaramide e succinaminde formas de pyoverdine – consulte Tabela de materiais), em meio de M9 modificado previamente preparado.</li>
		<li>Dilua esta solução para 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 soluções μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação padrão de EDTA<ol>
<li>Adicionar 0,594 g de ácido etilenodiaminotetracético de dissódico (EDTA: C10H14N2Na2O8.2h2O), a 500 mL de meio de M9 modificado previamente preparado para preparar 3200 μM EDTA padrão.</li>
		<li>Diluir esta solução para 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 soluções μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geração da curva padrão<ol>
<li>Adicione 100 μL de cada concentração de pyoverdine e EDTA para separar poços de uma microplaca de 96 poços contendo 100 μL de CAS-Fe do ágar. Fazer duplicadas replicações técnicas de cada concentração. Também, adicionar poços em branco com apenas M9 (sem EDTA ou pyoverdine).</li>
		<li>Usando um leitor de microplacas, medir a absorvância (a 420 nm e 665 nm) após incubação de 1, 6 e 24 h a 22 ° C e medidas de absorvância uso para gerar curvas padrão. Nota: Para medições de 420 nm, subtrai a absorvância de espaços em branco da absorvância do pyoverdine ou poços contendo EDTA. Para 665 nm, subtrair a absorvância do pyoverdine ou EDTA contendo poços de absorvância de espaços em branco. Em seguida, log10(pyoverdine µM ou EDTA) é regredido contra as medidas de absorvância. Para facilitar a interpretação dos resultados de exemplo, use a absorvância como o eixo x e log10(pyoverdine µM ou EDTA) como o eixo y.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. coleta de amostras ambientais: tecidos de solo e planta
<ol><li>Lavar o equipamento de amostragem (pás e tesouras) com 0,22 µm filtrada ddH2O seguido por 70% de etanol e limpe com papel toalha antes da amostragem e entre as amostras para manter uma técnica estéril e reduzir a contaminação.</li>
	<li>Impostos especiais de consumo os tecidos vegetais (grãos e brotos) de plantas no campo e colocá-los em um saco de armazenamento de plástico etiquetados, deixando bastante restolho de atirar para a facilidade no desenraizamento das amostras de solo e raiz desejadas.</li>
	<li>Escavar uma raiz pequena bola aproximadamente 15 cm de profundidade e 23 cm de largura e coloque-o em um saco de plástico separado, etiquetado para preparação da amostra no ambiente de laboratório. Este passo é semelhante aos métodos de McPherson et al27.</li>
	<li>Coloque todas as amostras (grãos, brotos, em massa de solo e bolas de raiz em sacos separados) diretamente no gelo e manter a 4 ° C até que as amostras são processadas para o ensaio de produção Sideróforo.</li>
	<li>Separar amostras de solo de raiz associado em granel, solo frouxamente ligados rizosfera e solo rizosfera firmemente ligados.<ol>
<li>Tire os sacos, as bolas de raiz. Agite delicadamente fora solo da esfera de raiz. Sacudido solo, juntamente com o solo, esquerda na bolsa compreende o solo "em massa".</li>
		<li>Use um martelo de borracha para remover ainda mais solo da esfera de raiz. Este é o solo da rizosfera frouxamente ligados.</li>
		<li>Gere o solo rizosfera firmemente ligados tomando raízes com a amostra firmemente ligados e colocá-los num tubo de centrífuga. Adicionar 30 mL de DDQ2O e vórtice por 2-3 minutos. Remova as raízes para obter a diluição de chorume de solo rizosfera firmemente ligados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. preparação de culturas de enriquecimento Sideróforo e ensaio de produção Sideróforo CAS-Fe
Nota: Todos os produtos vidreiros devem ser ácido lavado antes de começar os ensaios.
<ol><li>Preparação da amostra de solo (para cada um dos tipos de amostra de solo de três)<ol>
<li>Homogeneizar a cada amostra de solo dentro do saco de amostra, misturando e passando o solo o máximo possível sem abrir o saco. Nota: Isto ajuda a reduzir a variabilidade espacial de solos naturais e alinha-se com os procedimentos de amostragem do solo normal. Outros métodos podem ser utilizados para homogeneizar amostras ambientais, conforme o caso e dependendo do projeto experimental.</li>
		<li>Depois de cada amostra foi completamente misturados, alíquota e suspender a 2,0 g de cada solo em 20 mL de meio de M9 modificado, então dilua 10-3 para um volume total de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com um plug de espuma estéril para permitir a aeração.</li>
		<li>Para amostras de rizosfera firmemente ligados, adicionar 2 mL de chorume de solo da rizosfera a 20 mL de meio de M9 modificado e, em seguida, diluir 10-3 para um volume total de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com um plug de espuma estéril para permitir a aeração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da amostra (raiz, atirar e grãos) de tecido<ol>
<li>Superfície de esterilizar a amostra com etanol a 70%. Macerar a 2,0 g de tecido fresco em 20 mL de meio de M9 modificado usando um liquidificador em alta por 30 segundos. Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 50ml estéril e, em seguida, diluir 10-3 para um volume total de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com um plug de espuma estéril para permitir a aeração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enriquecimento da produção Sideróforo através da limitação de Fe<ol>
<li>Incubar os tubos de centrífuga de 50 mL à temperatura ambiente e agite a 160 rpm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ensaios de ágar CAS-Fe para a deteção de produção Sideróforo em amostras ambientais
<ol><li>Em 24, 48 e 72 h após o início da cultura de enriquecimento, remova subamostras de 1 mL de tubos de enriquecimento usando uma técnica estéril e centrifugação a 10.000 x g por 1 min em tubos de centrífuga de 2 mL para peletizar as células.</li>
	<li>Recolha o sobrenadante separado. Utilizando uma técnica estéril, adicione 100 μL do sobrenadante a solução 100 μL de CAS-Fe-ágar-ágar em duplicado ou triplicado na microplaca. Também Adicione 100 µ l de estéril M9 médio (como espaços em branco). Em seguida, incubar a placa a 28 ° C.</li>
	<li>Suspenda o restante do sobrenadante e sedimento para cada amostra (não adicionado à placa de microtitulação) no tubo de centrífuga própria, estéril de 2 mL. Adicionar 400 μL de glicerol estéril em cada tubo de amostra-sobrenadante e ressuspender o precipitado para criar ações de glicerol. Congele o estoque a-80 ° C para posteriores análises. Nota: Este passo pode ser modificado para gerar ações de glicerol, de acordo com qualquer protocolo preferido em casa.</li>
	<li>Medir a absorvância a 6, 24, 48 e 72 h, no comprimento de onda de 420 nm.</li>
	<li>Use curvas padrão geradas a partir de pyoverdine ou EDTA para interpretar medidas de absorvância amostra em termos de pyoverdine equivalentes. Nota: Pyoverdine estava determinado a ser um padrão superior em comparação com EDTA (vide infra), então o EDTA não foi usado para interpretar os resultados no estudo atual.</li>
</ol>

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<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+from+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

O resultado principal deste trabalho é a produção de uma nova metodologia que pode ser usada para enriquecer rapidamente para Sideróforo produzindo micróbios ao medir quantitativamente Sideróforo/actividade de produção da amostra ambiental. A metodologia é rápida, simples e econômica, e os resultados mostram como ele pode ser usado para detectar atividade Sideróforo de tipos de amostras complexas e romance (ex.., solo e planta de tecido). O protocolo também resulta na produção de estoques de glicerol das cultura...

Sideróforos são biomoléculas importantes envolvidos principalmente na quelação de ferro para a biodisponibilidade, mas com uma grande variedade de efeitos adicionais nos ecossistemas terrestres e aquáticos, variando de quórum microbiana sensoriamento, sinalizando a planta microbianas-hosts, promoção de crescimento de planta, cooperação e competição dentro de comunidades microbianas complexas1,2. Sideróforos podem ser classificados de acordo com seus sites ativos e características estruturais, criando quatro tipos básicos: carboxilato, hydroxamate, catecholate e misturado tipos3,4. Muitos microorganismos são capazes de excretar mais de um tipo de Sideróforo5 e nas comunidades do complexas, uma grande maioria dos organismos biossintetize os receptores de membrana para permitir a absorção de uma variedade ainda maior de sideróforos1, 6. Trabalho recente indica que sideróforos são particularmente importantes a nível comunitário e mesmo no Reino inter comunicação e transferências biogeoquímicos7,8,9,10 ,11.
Cromo azurol sulfonato (CAS) tem sido utilizado por mais de 30 anos como um agente quelante para ligar o ferro (Fe) de tal forma que a adição de ligantes (i.e., sideróforos) pode resultar em dissociação do complexo Fe-CAS, criando uma mudança de cor facilmente identificáveis no meio 12. quando o CAS está vinculado com o Fe, o corante aparece como uma cor azul royal, e como o complexo de CAS-Fe dissocia-se, o médio muda de cor de acordo com o tipo de ligante usado para eliminar a Fe13. O inicial, baseada em líquido médio estabelecido por Romualdo Silva e Neilands em 1987, foi modificado de várias maneiras para acomodar a alteração microbiana alvos14, hábitos de crescimento e limitações15, bem como uma variedade de metais além do Fe, incluindo alumínio, manganês, cobalto, níquel cádmio, lítio, zinco16, cobre17e nem arsênico18.
Muitos patógenos humanos, também como planta microorganismos promotores de crescimento (PGPM) foram identificados como organismos produtores de Sideróforo3,19,20e importante rizosfera e endofíticos PGPM frequentemente testar positivo para Sideróforo-produção4. O tradicional método de líquido baseado em Fe foi adaptado para microtitulação testes de isolados no cultivo para produção de Sideróforo21. No entanto, essas técnicas não reconhecem a importância da comunidade microbiana como um todo (o microbiome), em cooperação e Regulamento potencial de produção de Sideróforo no solo e planta sistemas22. Por esse motivo, nós desenvolvemos uma avaliação de nível comunitário alto rendimento de produção Sideróforo de um determinado ambiente, com base no ensaio CAS tradicional, mas com replicação, facilidade de medição, confiabilidade e repetibilidade em uma microplaca do ensaio.
Neste estudo, um ensaio CAS-Fe custo-benefício, alta produtividade para a detecção de produção Sideróforo é apresentado para avaliar o enriquecimento da produção Sideróforo de amostras complexas (ou seja, solo e planta homogenates de tecido). Solo da rizosfera granel, frouxamente ligados e firmemente ligados (em termos de como o solo era vinculado à raiz) foram obtidos juntamente com o grão, atirar e tecidos de raiz de quatro genótipos distintos trigo (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, e PI561727. Foi hipotetisado que diferenças fundamentais em genótipos de trigo podem resultar em diferenças no recrutamento e selecção de Sideróforo produzindo comunidades. De particular interesse é a diferença entre as comunidades microbianas associadas com a linha isogénicas de PI561725, que é de alumínio tolerante porque possui ALMT1 (alumínio-ativado 1 transportador malato), comparada com o alumínio sensível PI561727 isogénicas linha, que possui uma forma de alumínio não responsiva do gene, almt123,24,25,26. O principal objetivo do estudo foi desenvolver um método simples, rápido de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em culturas de enriquecimento Sideróforo de tipos de amostras complexas, preservando as culturas para trabalhos futuros.

<table><tbody><tr><td>Assadeira</td><td></td><td></td> de alumínio Agarose Apex LF451320014 <td></td></tr><tr><td>Folha</td><td></td><td></td><td></td>de alumínio</tr><tr><td>Cloreto de amônio, granular</td> Autoclave e esterilizador <td>Fiesher Scientific</td><td>152315A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr> Cloreto <tr><td></td> de cálcio di-hidratado Fiesher Scientific 171428 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAS (Chrome Azurol S)</td> <td>Chem-Impex Int'l Inc)</td> <td>000331-27168</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose monohidratada (glicose), pó cristalino</td><td>Fiesher Scientific</td><td>1521754</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sal dissódico, di-hidratado, cristal</td><td>J.T.Baker</td><td>JI2476</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, padeiro anidro</td><td>analisado</td><td>C22634</td><td></td></tr><tr><td>HDTMA (cetiltrimetilamônio Reagente de brometo</td><td>World</td><td>FZ0941</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato ácido</td><td>ACROS Orgânico</td><td>B0756767</td><td></td></tr><tr><td>Infinito M200 PRO leitor de placas</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (III) hexahidratado, 99%</td> <td>ACROS Organic</td><td>A0342179</td><td></td></tr><tr><td>Laboratório Hotte Hood</td><td>Incubadora de Laboratório Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Fiesher Scientific</td><td>27855</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nírico, (69-70) %</td> <td>J.T.Baker</td><td>72287</td><td></td></tr><tr><td>PIPES tampão, 98,5%</td> <td>ACROS Orgânico</td><td>A0338723</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio, dibaisc, pó</td><td>J.T.Baker</td><td>J48594</td><td></td></tr><tr><td>Pyoverdine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>078M4094V</td><td></td></tr><tr><td>Areia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SI-600R Shaker</td><td>Lab Companion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, granulado</td><td>Fiesher Scientific</td><td>136539</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sódio, pellets</td><td>J.T.Baker</td><td>G48K53</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio, dibásico heptahidratado, 99%</td> <td>ACROS Organic</td><td>A0371705</td><td></td></tr></tbody></table>

sideróforo elevado-throughput screening de amostras ambientais: tecidos, bulk solos e solos de rizosfera de plantas

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Sideróforos (metal de peso molecular baixo quelantes compostos) são importantes em vários fenômeno ecológico variando de ferro (Fe) biogeoquímicos Ciclismo nos solos, a concorrência do patógeno, promoção de crescimento de planta e Cruz-Reino de sinalização. Além disso, sideróforos são também de interesse comercial em bioleaching e bioweathering de metais, minerais e minérios. Um meio rápido, custo-eficaz e robusto de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em amostras complexas é a chave para identificar aspectos importantes das ramificações ecológicas de atividade Sideróforo, incluindo, romance Sideróforo produzindo micróbios. O método aqui apresentado foi desenvolvido para avaliar a atividade Sideróforo no tato microbiome comunidades, em amostras ambientais, tais como tecidos de solo ou planta. As amostras foram homogeneizadas e diluídas em meio M9 modificado (sem fé), e culturas de enriquecimento foram incubadas por 3 dias. Produção de Sideróforo foi avaliada em amostras em 24, 48 e 72 horas (h) usando uma romance microplacas de 96 poços CAS (cromo azurol sulfonato)-ensaio de ágar de Fe, uma adaptação do método colorimétrico tradicionalmente tedioso e demorado de avaliação Sideróforo atividade, realizada em individuais isolados microbianos cultivados. Aplicamos o nosso método de 4 diferentes genótipos/linhas de trigo (Triticum aestivum L.), incluindo Lewjain, Madsen e PI561725 e PI561727 comumente cultivada no interior do noroeste do Pacífico. Produção Sideróforo claramente foi impactada pelo genótipo de trigo e em tipos específicos de tecidos vegetais observados. Temos utilizado com sucesso nosso método para a tela rapidamente para a influência do genótipo da planta na produção de Sideróforo, uma função fundamental nos ecossistemas terrestres e aquáticos. Nós produzimos muitas repetições de técnicas, gerando diferenças estatísticas muito confiáveis em solos e em tecidos vegetais. Importante, os resultados mostram que o método proposto pode ser usado para examinar rapidamente a produção Sideróforo em amostras complexas com um alto grau de confiabilidade, de uma forma que permite que as comunidades a ser preservado para posterior trabalho de identificar genes funcionais e táxons.

Um pyoverdine mistura biossintetizados por Pseudomonas fluorescens foi usado como um padrão para interpretar e quantificar a absorvância (a 420 nm) de amostras em termos de equivalentes de pyoverdine em µM. a Figura 1 mostra a relação entre absorbância (420 nm) e começando a concentração do pyoverdine (molaridade do Log10 em µM). EDTA não forneceram um padrão adequado porque amostras expostas as medidas de absorbância maiores do eram ating...

Apresentamos um protocolo para a seleção rápida de amostras ambientais para Sideróforo potencial, contribuindo para a biodisponibilidade de micronutrientes e volume de negócios em sistemas terrestres.

Sideróforo elevado-throughput Screening de amostras ambientais: tecidos, Bulk solos e solos de rizosfera de plantas

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderophores são de baixo peso molecular, biomoléculas metal-quequeantes envolvidas no ciclismo de ferro no ambiente. Este protocolo permite uma rápida avaliação de alta produtividade da atividade siderophore em amostras de solo e plantas. Métodos anteriores para detecção de siderophore eliminaram o ambiente crucial da comunidade microbiana.Nossa técnica permite a detecção dentro da comunidade microbiana relativamente intacta e no habitat em que se envolveu. Como a disponibilidade de ferro é crucial para a produtividade agrícola, esse protocolo poderia ser usado para investigar o papel dos micróbios na modulação da disponibilidade de ferro para as plantas. Além disso, esse método poderia ser utilizado para avaliar o impacto das práticas de manejo agrícola na saúde do solo e nas comunidades produtoras de siderophore, bem como no desenvolvimento dessas comunidades ao longo do tempo.Para começar, lave ácida todos os vidros em 100 mililitros de ácido nítrico 100 mililitros por um mínimo de duas horas antes da utilização no ensaio CAS. Prepare uma assadeira de alumínio cheia de areia de nível de laboratório e cubra-a com papel alumínio. Autoclave a 121 graus Celsius por 30 minutos e reserve.Prepare o HDTMA adicionando 0365 gramas a 20 mililitros de água deionizada dupla, e coloque a solução em um banho de água a 37 graus Celsius para promover a solubilização. Adicione 0302 gramas de CAS a 25 mililitros de água deionizada dupla enquanto mexe suavemente com uma barra de agitação magnética estéril. Em seguida, adicione cinco mililitros de um hexahidrato de cloreto de ferro molar aos 25 mililitros da solução CAS enquanto continua a mexer suavemente.Agora, adicione lentamente os 20 mililitros da solução HDTMA na solução complexa CAS de ferro enquanto mexe suavemente. Prepare a solução tampão dissolvendo 15,12 gramas de PIPES em 375 mililitros de água deionizada dupla com agitação suave. Ajuste o pH para 6,8 com cinco hidróxido de sódio molar.Em seguida, adicione água para levar o volume a 450 mililitros. Agora adicione cinco gramas de agarose à solução. Autoclave a solução tampão PIPES e a solução complexa CAS de ferro a 121 graus Celsius por 30 minutos.Adicione cuidadosamente a totalidade da solução complexa CAS de ferro à totalidade do buffer PIPES no armário de biossegurança depois que cada um deles foi autoclavado. Coloque a solução mista em um banho de água a 50 graus Celsius. Agora coloque um barco reagente estéril na areia estéril dentro do armário de biossegurança e aqueça a 50 graus Celsius.Transfira o ágar complexo CAS de ferro para o barco, depois alíquota rapidamente de 100 microliters para cada poço de uma microplata estéril de fundo plano claro de 96 poços. Prepare o padrão de 800 pioverdina micromolar em m9 médio modificado previamente preparado. Diluir a solução em 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 soluções de micromolar.Adicione EDTA a 500 mililitros de meio M9 modificado previamente preparado para preparar o padrão EDTA 3,2 milimiliar. Diluir essa solução em soluções 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 micromolares. Para gerar uma curva padrão, adicione 100 microliters de cada concentração de pyoverdine e EDTA para separar poços de uma microplacão de 96 poços contendo 100 microliters de ferro cas complexo ágar médio.Faça duplicações técnicas duplicadas de cada concentração. Adicione também poços em branco com apenas M9. Usando um leitor de microplacão, meça a absorvância após uma, seis e 24 horas de incubação a 22 graus Celsius, e use medidas de absorvência para gerar curvas padrão. Lave o equipamento de amostragem com 22 mícrons filtro de água dupla deionizada seguido de 70% de etanol e limpe com toalhas de papel.Realize a lavagem antes da amostragem e entre as amostras para manter a técnica estéril e reduzir a contaminação cruzada. Depois de extirpar tecidos vegetais e escavar uma pequena bola raiz das plantas no campo, coloque a bola raiz em um saco plástico rotulado separado para separação de amostras no ambiente de laboratório. Coloque todas as amostras diretamente no gelo e mantenha-se a quatro graus Celsius até que as amostras sejam processadas para o ensaio de produção siderophore.Separar amostras de solo associadas à raiz em massa, solo de rizosfera livremente ligado e solo de rizosfera firmemente ligado. Para isso, tire as bolas de raiz dos sacos e retire suavemente o solo da bola raiz. O solo abalado, juntamente com o solo deixado no saco, compõem o solo a granel.Este é o solo da rizofera frouxamente ligado. Gere um solo de rizopshere bem amarrado, tomando raízes com a amostra bem ligada e colocando-as em um tubo de centrífuga. Adicione 30 mililitros de água deionizada dupla e vórtice por dois a três minutos.Remova as raízes para obter a diluição do solo da rizofera firmemente ligada. Homogeneize cada amostra de solo dentro do saco de amostras misturando e girando o solo o máximo possível sem abrir o saco. Após cada amostra ter sido completamente misturada, aliquot e suspender dois gramas de cada amostra de solo em 20 mililitros de meio M9 modificado dentro de um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis.Diluir a amostra e, em seguida, selar o tubo com um plugue de espuma estéril para permitir a aeração. Para amostras de rizosfera bem ligadas, adicione dois mililitros do chorume do solo da rizosfera a 20 mililitros de meio M9 modificado dentro de um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis. Diluir a amostra e, em seguida, selar o tubo com um plugue de espuma estéril para permitir a aeração.Para preparar a amostra de tecido, a superfície esteriliza a raiz, o tiro e o grão com 70% de etanol. Macerar dois gramas de tecido fresco em 20 mililitros de m9 médio modificado usando um liquidificador no alto por 30 segundos. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis, diluir e selar o tubo com um plugue de espuma estéril.Para enriquecer a produção de siderophore através da limitação do ferro, incubar os tubos de centrífugas de 50 mililitros à temperatura ambiente e agitar a 160 RPM. Aos 24, 48 e 72 horas após iniciar a cultura do enriquecimento, remova uma subsame de mililitro dos tubos de enriquecimento usando técnica estéril. Centrifugar as subsamtras a 10.000 vezes G por um minuto em dois tubos de centrífuga mililitro para pelotizar as células.Utilizando técnica estéril, adicione 100 microlitadores do supernatante a uma solução de 100 microlitres de ágar complexo CAS de ferro em duplicado ou triplicado dentro da microplape. Adicione também 100 microliters de meio M9 estéril como espaços em branco. Em seguida, incubar a placa a 28 graus Celsius.Cada placa deve ser selada e coberta com papel alumínio antes da colocação na incubadora. Suspenda o restante do supernatante e pelota para cada amostra em seu próprio tubo de centrífuga de dois mililitros estéreis. Adicione 400 microliters de glicerol estéril em cada tubo supernacante amostrado e suspenda a pelota para criar estoques de glicerol.Congele o estoque a menos 80 graus Celsius para análise posterior. Meça a absorvância em seis, 24, 48 e 72 horas em um comprimento de onda de 420 nanômetros. Uma mistura de pyoverdine biossintistritada por Pseudomonas fluorescens foi usada como padrão para interpretar e quantificar a absorção de amostras em amostras de equivalência de pyoverdine em micromolar.A relação entre a absorvância em 420 nanômetros e a concentração inicial de pyoverdine é mostrada aqui. A atividade siderophore do enriquecimento de 72 horas foi avaliada em incubação de 48 horas para determinar a influência do genótipo e do tipo amostral no isolamento siderophore. A atividade siderophore em amostras de solo a granel foi relativamente baixa e não apresentou diferenças entre o genótipo do trigo do qual o solo a granel foi amostrado.No entanto, enriquecimentos de solo livremente amarrado isolado do genótipo 725 apresentaram maior produção lateral em comparação com o solo livremente ligado de Madsen e 727, mas não de Lewjain. Por outro lado, a produção de siderophore em enriquecimentos de solo bem amarrado não foi fortemente influenciada pelo genótipo. Culturas de enriquecimento de tecido de grãos produziram produção relativamente baixa de siderophore, independentemente do genótipo.Os enriquecimentos do tecido de tiro lewjain tiveram uma produção lateral significativamente menor do que os outros genótipos, e 725 culturas de tecido de tiro resultaram em uma produção mais variável siderophore. A maior diferença na atividade siderophore foi observada nas culturas de enriquecimento de tecidos radiculares, onde 725 tinham mais de 200% mais atividade siderophore do que todos os outros genótipos. Um dos aspectos mais tributantes da execução do protocolo é manter as condições assépticas, enquanto completa as muitas etapas para gerar a microplacão cas de ferro ágar e testar amostras para atividade siderophore.Uma ampla gama de técnicas baseadas em cultura cromatográfica ou baseadas em DNA podem ser aplicadas tanto ao poço real do microtúrtero quanto à cultura preservada do glicerol para novos testes bioquímicos ou caracterização genética e modelagem metabólica. Usando este protocolo, a atividade siderophore pode mais tarde ser ligada a organismos específicos responsáveis por essa atividade ou, posteriormente, visados como um mecanismo para impactos ecológicos maiores. Este protocolo poderia ser facilmente modificado para avaliar a produção de siderophore em culturas de enriquecimento geradas a partir de amostras coletadas de outros compartimentos ambientais, incluindo ar, água e sedimentos.

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Environment

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