Name: Distribuição da água de xylem em plantas lenhosas visualizadas com um microscópio de elétron da Cryo-exploração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a visualizar a distribuição da água no xilema de plantas lenhosas usando microscopia eletrônica criogênica. Este método elimina artefatos de preparação e revela dinâmicas hídricas celulares com alta resolução.

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Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI (no. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Nota: um gráfico esquemático deste protocolo é mostrado na Figura 1.
1. amostragem: abrandamento da tensão dentro da coluna da água de conduits de xylem
Nota: o tratamento de relaxamento de tensão a seguir é recomendado antes da aplicação LN2 para evitar os artefatos de congelamento e tensão induzida na distribuição de água do xilema.
<ol><li>Coloque uma ramificação e folhas para amostragem com um saco plástico preto para equilibrar o potencial de água entre xilema e deixa mais de duas horas antes da amostragem.</li>
	<li>Determine o potencial da água de pelo menos duas folhas da amostra usando uma câmara de pressão ou um Psychrometer. Quando o potencial da água é mais elevado do que ca. − 0,5 MPa (isto é, nenhuma ou muito-baixa tensão existe), uma amostra pode ser colhida após o congelamento (refira a seção 2: fixação do gelo). Quando o potencial da água é mais baixo do que − 0,5 MPa, um tratamento para o abrandamento é necessário como descrito abaixo.</li>
	<li>Fixar uma gola estanque ao redor da haste, a fim de ser preenchido com água. Um copo de plástico sem fundo pode servir como um colarinho estanque. Deve-se tomar cuidado para selar firmemente os espaços entre a haste e o colar usando uma fita adesiva para impedir o escapamento dos meios líquidos que são usados subseqüentemente. Para a colheita de hastes flexíveis, tais como galhos finos ou galhos, afundar uma porção de corte em um balde cheio de água, dobrando o tronco. Corte a superfície da água usando tesouras de poda ou uma serra. Transfira a amostra para outro recipiente de água o mais rápido possível para minimizar a exposição da extremidade do corte ao ar.</li>
	<li>Mantenha a extremidade cortada da amostra debaixo de água. Para as espécies Latifoliada, assegure-se de que o comprimento do ponto onde uma Cryo-amostra para o sem seja obtido à borda cortada da haste colhida seja mais longo do que o comprimento máximo da embarcação das amostras a fim impedir artefatos tensão-induzidos dentro da amostra do Cryo.</li>
	<li>Cubra a amostra contendo folhas com um saco plástico preto para reduzir a transpiração. Mantenha a extremidade do corte da amostra na água e mantenha esta circunstância por aproximadamente 30 minutos a fim relaxar a tensão do xylem. Evite um tempo de relaxamento mais longo (> 1 h) devido ao possível reabastecimento artificial de condutas CAVITADAS12.</li>
	<li>Meça o potencial da água outra vez para confirmar o abrandamento da tensão do xilema (quase 0 MPa). Nota: antes da amostragem, o comprimento máximo do vaso das espécies-alvo deve ser pesquisado ou determinado com amostras semelhantes por método de injeção de ar. Ao amostrarem uma grande árvore, ou uma grande ramificação, é difícil realizar os procedimentos de relaxamento de tensão descritos acima. Conseqüentemente, as amostras das árvores grandes devem ser coletadas durante o período do madrugada quando o potencial da água do Xylem é mais elevado.</li>
</ol>2. fixação de congelamento com LN2
<ol><li>Corte e abra um lado de um colar estanque com tesouras ou uma faca de serviço público. Fixe firmemente o colar em torno da haste com uma fita adesiva ao prender a abertura horizontalmente.</li>
	<li>Use luvas isolantes/Mitten, mas certifique-se de segurar a garrafa de LN2 com segurança, e executar ln2 no colarinho para preenchê-lo com ln2. Mantenha-o enchido firmemente adicionando o LN2 para congelar completamente a água no xilema. O tempo necessário para o congelamento depende do tamanho da amostra; 1 min após a ebulição do LN2 derramado parou é suficiente para um pequeno galho ou uma muda, enquanto mais de 20 min é necessário para uma haste de uma árvore maior20. Adicione LN2 continuamente durante o congelamento à medida que evadora rapidamente devido a grandes diferenças de temperatura entre as temperaturas ln2 e ambiente.</li>
	<li>Retire a gola da parte congelada da haste da amostra para remover o LN2 após o tempo de congelamento suficiente. Certifique-se de usar luvas isolantes para evitar o contato com o potencial LN2 derramamentos causados pela desanexação do colarinho.</li>
	<li>Colher a amostra com uma multa serrote imediatamente.</li>
	<li>Cubra a amostra congelada com um pedaço de folha de alumínio ou colocá-lo em um tubo de amostra, em que os números de identificação de amostra são escritos. Coloc ràpida a amostra colhida em um recipiente enchido com o LN2 ou o bloco em uma caixa isolada enchida com o gelo seco.</li>
	<li>Armazene as amostras em um freezer profundo até a observação. A temperatura de armazenamento preferida é − 80 ° c a fim impedir o sublimation do gelo e seu recristalização durante o armazenamento.</li>
</ol>3. preparação do espécime
Nota: para a observação, uma amostra deve ser cortada e sua superfície para a observação deve ser aplainada na temperatura de subzero a fim manter a distribuição de água em seu xylem in situ. Um micrótomo biológico com um sistema do criostato (criostato) é ideal para aparar e expor a superfície de um espécime neste tipo de observação por Cryo-sem.
<ol><li>Ajuste a temperatura da câmara do espécime do criostato ao ° c − 30, que é geralmente frio bastante manter a seiva do xylem da maioria de plantas em um estado congelado.</li>
	<li>Aparar uma amostra em uma pequena peça (< ca. 2 cm de altura e < ca. 1 cm de largura ou diâmetro) que podem ser ajustadas para o suporte de amostra de um Cryo-SEM. Use uma faca afiada ou uma serra de dentes finos para aparar, a fim de evitar a quebra do gelo na amostra. No caso de uma amostra maior que não pode ser cortada com uma faca, pre-cut rapidamente com uma serra arrefecida em uma caixa do congelador.</li>
	<li>Prenda a peça aparada a um mandril, um suporte para um criostat montando em um meio de incorporação de congelamento de tecido (por exemplo, composto de OCT) para o corte de crio. Em seguida, prenda o mandril a um suporte de amostra de um micrótomo do criostat.</li>
	<li>Aparar a superfície, raspando repetidamente com secções de 5 – 7 μm de espessura. Aparar cortando mais de 1.000 a 2.000 μm, na profundidade total da superfície inicial na coleção da amostra, é útil para eliminar a parcela danificada da amostra causada pelo Pre-corte com uma faca ou uma serra como descrito na etapa 3,2.</li>
	<li>Depois de aparar aproximadamente uma superfície da amostra, ajuste uma porção não utilizada da lâmina do micrótomo acima da superfície do espécime. Não permita que a lâmina toque na amostra que excederá a configuração de espessura.</li>
	<li>Antes do primeiro corte pela porção da lâmina não utilizada, amplie ligeiramente a distância entre a superfície da amostra e a lâmina.</li>
	<li>Corte a superfície da amostra apenas uma ou duas vezes. Além disso, deslize a lâmina novamente ajustando uma porção de lâmina não utilizada na superfície da amostra.</li>
	<li>Repita as etapas 3,6 e 3,7 três ou quatro vezes. Isso é importante para se obter uma superfície clara sem "marcas de faca" (Figura 4).</li>
	<li>Após o corte final, ajuste a posição da lâmina longe da amostra para impedir que a poeira fure na amostra.</li>
	<li>Retire o mandril do suporte do espécime e retire a amostra do mandril removendo o meio de incorporação congelado com uma faca afiada. Assegure-se de que a amostra seja colocada na câmara do criostat para evitar que a sua superfície aplainada seja de pó de geada.</li>
	<li>Prenda o espécime a um suporte do espécime de Cryo-sem com um meio de incorporação de congelação do tecido na câmara do criostato.</li>
</ol>4. transferência para a câmara de amostra Cryo-SEM
Nota: a amostra preparada para a superfície deve ser protegida de um aumento da temperatura ou acumulação de geada durante a transferência da câmara de criostat para a fase de observação na câmara de amostra de Cryo-SEM.
<ol><li>Mantenha a temperatura do estágio frio na câmara do espécime de Cryo-SEM em inferior a-120 ° c com LN2 de acordo com o manual do usuário do equipamento.</li>
	<li>Coloque o suporte da amostra com a amostra preparada em um recipiente isolante preenchido com LN2 na câmara de criostat.</li>
	<li>Segure o suporte da amostra com uma haste de troca de amostra abaixo do LN2. Evite expor o suporte do espécime ao ar sempre que possível.</li>
	<li>Ajuste rapidamente o suporte da amostra para a câmara de pré-evacuação da câmara de amostra Cryo-SEM assim que iniciar a evacuação da câmara de pré-evacuação. Em seguida, coloque o suporte do espécime no estágio frio após o ar ser totalmente evacuado. Embora um pouco de acúmulo de geada seja inevitável, o procedimento de "congelamento" (etapa 6) pode removê-lo.</li>
</ol>5. configuração em SEM
Nota: a configuração típica para a observação é descrita abaixo. Algumas modificações são exigidas dependendo da condição do vácuo ou do feixe de elétron.
<ol><li>Defina os parâmetros de SEM para observação da seguinte maneira: Tensão de aceleração: 3 – 5 kV Temperatura do estágio da amostra: < − 120 ° c Detector: emissão secundária</li>
</ol>6. congelamento-gravura
Nota: congelar-gravura é o procedimento para acentuar a borda das paredes de pilha da amostra pela sublimação ligeira do cristal de gelo. Congelar-gravura também envolve a remoção de poeiras de geada de superfície.
<ol><li>Gire sobre a tensão da aceleração da pistola elétrica durante congelar-gravura. É melhor conduzir congelar-gravura ao observar o espécime.</li>
	<li>Elevar a temperatura do estágio de amostra para − 100 ° c.</li>
	<li>Aguarde alguns minutos até que a poeira de geada seja removida e o nível de superfície do gelo nas células de xilema tenha diminuído ligeiramente em comparação com as paredes celulares.</li>
	<li>Abaixe a temperatura do estágio do espécime a − 120 ° c. Nota: se não houver nenhum controlador de temperatura instalado para o estágio da amostra, segure a amostra usando a haste de troca e retire-a da fase de amostra por alguns minutos. Observe o espécime várias vezes durante este processo de congelamento-condicionamento para verificar o status de sublimação do espécime.</li>
</ol>7. revestimento do metal (opcional)
Nota: as melhorias recentes ao instrumento de SEM e ao processamento de imagem podem fornecer imagens da alta qualidade de espécimes de isolamento elétricos sem revestimento do metal. No entanto, espécimes não condutores, como materiais biológicos, são, por vezes, sujeitos a cobrança; maior brilho em posições específicas da amostra devido ao acúmulo de elétrons ("carregamento"). Expor a amostra para feixes de elétrons por um longo período de tempo ou para uma alta ampliação, aumenta os efeitos de carregamento. O revestimento da superfície da amostra com materiais metálicos condutores elétricos previne a ocorrência de carga. Use o sistema do revestimento do vácuo que é instalado dentro da unidade de Cryo-SEM a fim impedir que a temperatura da amostra aumente durante o revestimento.
<ol><li>Assegure-se de que o material de revestimento esteja instalado em um cabeçote de evaporador designado do sistema de revestimento.</li>
	<li>Mantenha a temperatura do estágio frio no sistema de revestimento abaixo de − 170 ° c.</li>
	<li>Coloque o suporte da amostra na fase fria do sistema de revestimento após o congelamento-condicionamento suficiente.</li>
	<li>Abra uma divisória entre o estágio frio e a cabeça do evaporador.</li>
	<li>Ajuste o valor atual e o valor da tensão da cabeça do evaporador em CA. 30 miliampères e CA. 5 V, respectivamente.</li>
	<li>Evate o material de revestimento para ca. 30 s para revestir a superfície da amostra.</li>
	<li>Defina ambos os valores de corrente e tensão da cabeça do evaporador em zero e feche a partição.</li>
	<li>Coloque o suporte da amostra na fase fria da câmara de amostra para observação.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos de observação de Cryo-SEM introduzidos neste trabalho são práticos para a visualização clara da distribuição de água em uma escala celular. Através deste método, explorando as mudanças na distribuição de água dentro do xilema pode potencialmente ajudar a esclarecer o mecanismo de tolerância de espécies de árvores ao estresse abiótico (escassez de água ou congelamento) ou estresse biótico (doença da árvore).
O passo mais crucial neste método é preservar a distribuição de água caracte...

A disponibilidade de recursos hídricos (i.e., precipitação, teor de água no solo) determina rigorosamente a mortalidade e a distribuição geográfica das espécies vegetais, uma vez que necessitam absorver água do solo e transportá-la para as folhas para produção fotossintética. As plantas devem manter seu sistema de transporte de água flutuação de abastecimento de água. Em particular, as plantas lenhosas geram altas tensões em suas condutas ao longo dos córregos de transpiração, pois, em alguns casos, eles precisam segurar sua coroa mais de ~ 100 m acima do solo. Para manter as colunas de água tal pressão negativa elevada, os condutas do xilem consistem em um continuum de pilhas tubulares com as paredes de pilha rígidas e hydrofóbicas-lignified1. A vulnerabilidade à disfunção de xilema de condutas de xilema em cada espécie é um bom determinante da sobrevivência da espécie flutuação da água2. Além disso, estudar o estado hídrico das condutas de xilema é importante para a avaliação do estado de saúde de árvores individuais submetidas a tensões abióticas ou bióticas. Medir o fluxo de SAP ou o potencial da água pode fornecer estimativas do status de água de uma planta lenhosa devido à função hidráulica integrada de conduits do xylem. Além disso, a visualização da distribuição de água em células de xilema pode esclarecer a condição de componentes individuais do sistema hidráulico xilema.
Existem várias técnicas para visualizar o estado hídrico das condutas de xilema3. Os métodos clássicos e úteis para observar as vias de água no tecido lenhoso envolvem manchar a coluna de água, imersando as extremidades dos ramos cortados em um corante ou injetando um corante em pé árvore hastes4. A fotografia de raio x suave também permite a visualização da distribuição de água de discos de madeira cortados devido à intensidade diferencial de absorção de raios-x da umidade em xilema5,6. Estes métodos, entretanto, fornecem somente trilhas do movimento da água ou demonstram distribuições macroscópicas da água. Recentemente, técnicas de observação não destrutivas, como a tomografia computadorizada de raios X micro Focus (μct)7,8,9,10e a ressonância magnética (RM)11, 12, foram melhorados significativamente para permitir a observação da água em condutas do xylem dentro das mudas intactas. Estes métodos não destrutivos têm grandes vantagens em que podemos observar o estado de água do xilema sem efeitos de corte artificial, e podemos rastrear a dinâmica do fluxo de água por imagem seqüencial ou introduzindo um agente de contraste10. Entretanto, nós precisamos de usar um MRI personalizado para a imagem latente da planta ou uma facilidade especializada para o μCT Synchrotron-baseado a fim obter as imagens que podem identificar o índice de água do nível celular. Além disso, embora o sistema μct baseado em síncrotron possibilite a obtenção de imagens finas com alta resolução espacial, comparável à microscopia de luz7,8,9, as células vivas podem ser feridas pelo radiação de raios-X de alta energia13,14. Empregando um microscópio de elétron da exploração em que as Cryo-unidades são instaladas (Cryo-SEM) é um método muito útil para localizar precisamente a água no xilema a nível celular, embora isto exija destrutivamente colher a amostra para a observação. Para fixar a água em condutas de xilema, uma porção das hastes (ou seja, galhos, galhos ou hastes) é congelada in situ por nitrogênio líquido (LN2). As observações da superfície de espécimes cortados, congelados por Cryo-sem fornecem imagens altamente amplificadas da estrutura do xilema de que nós podemos identificar a água em condutas do xylem como o gelo. Uma limitação significativa deste método é que a observação seqüencial da mobilidade da água dentro da mesma amostra é impossível. Entretanto, a aplicação de μCT ou de MRI para a observação seqüencial das árvores que vivem em um campo é extremamente desafiante porque estes instrumentos não são portáteis. Em contraste, Cryo-SEM tem um potencial para usar esta técnica em grandes árvores em experimentos de campo para visualizar claramente o conteúdo de água em não só o nível celular, mas também em um nível de estrutura mais fina, por exemplo, água em poços intervasculares15, água em espaços intercelulares16, ou bolhas na coluna de água17.
Muitos estudos observando a água de xylem por Cryo-sem foram relatados 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) estabeleceram inicialmente o protocolo de observação do xilema in situ por congelamento-fixação de um tronco vivo através do preenchimento do LN2 em um recipiente fixado na haste21. A temperatura da amostra foi mantida abaixo de-20 ° c durante a coleta da amostra e durante a preparação de Cryo-SEM, a fim de evitar derreter o gelo dentro de condutas de xilema. Este método tem sido usado para observar a água em xilema, a fim de esclarecer a distribuição de água o regime de água em mudança11,12,24,25,26, 27,28, a variação sazonal da distribuição de água21,29,30, o efeito dos ciclos de congelação-descongelamento17,31, 32, a distribuição da água na madeira molhada5, mudanças na distribuição da água durante a transição do alburno ao cerne20, curso de tempo sazonal da atividade cambial e diferenciação dos navios33, e cavitação induzida por determinadas tensões bióticas23,34. A condutividade hidráulica e a vulnerabilidade de condutas à cavitação também foram verificadas usando Cryo-sem35,36. Cryo-SEM equipado com a espectrometria de raio X dispersiva da energia (EDX ou EDS) foi usado para estudar a distribuição do elemento sobre a superfície de um espécime que contem a água37.
Congelar-fixação de um tronco vivo que contenha condutas a tensão hidráulica elevada provoca às vezes cavitações artificiais que são observados pelo Cryo-sem como cristais de gelo fraturados no lúmen das condutas38,39. Em particular, as espécies Latifoliada com condutas mais longos e mais largos são vulneráveis aos artefatos tensão-induzidos, tais como a cavitação causada pelo corte da amostra, mesmo se conduzido a água3,40. Os artefatos de cavitação tornam-se evidentes após a amostragem de uma árvore transpiring (ou seja, amostragem durante o dia) ou condições severas de seca e podem induzir em erro a uma superestimação da ocorrência de cavitação3,38, 39. Portanto, a tensão que trabalha nas condutas tem de ser liberada a fim de evitar a cavitação vesícula3,12,39.
A técnica da congelar-fratura usando uma faca instalada em uma câmara do espécime é empregada frequentemente para expor a superfície do espécime para a observação de Cryo-SEM. Entretanto, os planos liofilizados de tecidos de plantas lenhosas, especialmente seções transversais do xilema secundário, são muito ásperos para observar claramente as características anatômicas e a água no tecido6. A aplicação de um criostat para aparar um espécime permite a preparação rápida e de alta qualidade de superfícies da amostra20,23. O objetivo geral deste método é fornecer a evidência com a definição da microscopia de elétron da distribuição da água em vários tipos de pilhas do xylem in situ sem a ocorrência de Artifacts da amostragem. Nós introduzimos nosso procedimento actualizado, que foi melhorado firmemente desde que nós o adotamos primeiramente, a respeito da amostragem, do aparamento e da limpeza da superfície do espécime para obter micrografias de elétron de alta qualidade de amostras Cryo-fixas do xilema.

<table><tbody><tr><td>material de revestimento</td><td>JOEL Ltd., Japão</td><td>Fio de ouro, 0,50 & vezes; 1000 mm, 99,99%, Peças nº 125000499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>microscópio eletrônico de varredura criogênica</td><td>JOEL Ltd., Japão</td><td>JSM-6510 instalado com criostato MP-Z09085T / MP-51020ALS</td><td></td></tr> Lâmina de micrótomo <tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX70</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo descartáveis Thermo Scientific HP35 ULTRA,</td><td></td><td></td> meio de incorporação de congelamento de tecido 3153735 <td></td></tr><tr><td></td> Resina de incorporação <td>Thermo Scientific</td><td>Shandon Cryomatrix, </td><td></td>6769006</tr></tbody></table>

distribuição da água de xylem em plantas lenhosas visualizadas com um microscópio de elétron da cryo-exploração

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Um microscópio eletrônico de varredura instalado crio-unidade (Cryo-SEM) permite a observação do espécime em temperaturas subzero e tem sido usado para explorar a distribuição de água em tecidos vegetais em combinação com técnicas de fixação de congelamento usando nitrogênio líquido (LN 2). para espécies lenhosas, no entanto, os preparativos para a observação da superfície de corte transversal do xilema envolvem algumas dificuldades devido à orientação das fibras de madeira. Além disso, uma maior tensão na coluna de água em condutas de xilema pode ocasionalmente causar mudanças artifactuais na distribuição de água, especialmente durante a fixação e coleta da amostra. Neste estudo, demonstramos um procedimento eficiente para observar a distribuição de água dentro do xilema de plantas lenhosas in situ por meio de um criostat e Cryo-SEM. No início, durante a coleta da amostra, medir o potencial hídrico do xilema deve determinar se a alta tensão está presente nas condutas de xilema. Quando o potencial de água do xilema é baixo (< ca. − 0,5 MPa), é necessário um procedimento de relaxamento de tensão para facilitar a melhor preservação do estado da água em condutas de xilema durante a fixação do congelamento da amostra. Em seguida, um colarinho estanque é anexado ao redor do tronco de árvore e preenchido com LN2 para fixação de congelamento do estado de água do xilema. Após a colheita, deve-se tomar cuidado para garantir que a amostra seja preservada congelada ao completar os procedimentos de preparo da amostra para observação. Um criostat é empregado para expor claramente a superfície transversal-cortada do xylem. Nas observações de Cryo-SEM, o ajuste de tempo para congelar-gravura é exigido para remover a poeira de geada e para acentuar a borda das paredes de pilha na superfície de visão. Nossos resultados demonstram a aplicabilidade de técnicas de Cryo-SEM para a observação da distribuição de água dentro do xilema em níveis celulares e subcelulares. A combinação de Cryo-SEM com técnicas de observação in situ não destrutivas melhorará profundamente a exploração da dinâmica de fluxo de água da planta lenhosa.

Imagens representativas de superfícies de corte transversal de xilema de árvores coníferas e Latifoliada, observadas por Cryo-sem, são mostradas na Figura 2. Na baixa ampliação, a área preta nas imagens indica as cavidades de que a água desaparece inteiramente ou em parte, e a área cinzenta indica as paredes de pilha do xylem, o citoplasma, e a água (Figura 2a). Na ampliação elevada, é evidente que a água não é p...

Observar a distribuição de água dentro do xilema fornece informações significativas sobre a dinâmica do fluxo de água em plantas lenhosas. Neste estudo, demonstramos a abordagem prática para observar a distribuição de água de xilema in situ usando um criostat e Cryo-SEM, que elimina mudanças artifactuais no estado da água durante a preparação da amostra.

Distribuição da água de xylem em plantas lenhosas visualizadas com um microscópio de elétron da Cryo-exploração

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

O objetivo geral deste protocolo é fornecer-nos a resolução de eletromicroscopia da distribuição de água em vários tipos de células xilema in situ. Este método tem sido utilizado para observar a água em xilema, a fim de esclarecer a distribuição de água e os regimes de água em mudança, a variação sazonal da distribuição de água, o efeito dos ciclos de congelamento/degelo, a distribuição de água em madeira molhada e a cavitação induzida por certos estresses bióticos. A fixação congelante de um tronco vivo sob altas tensões hidráulicas às vezes causa cavitações artificiais, que são observadas por crio-SEM como cristais de gelo rompidos no lúmen do conduíte.Este procedimento atualizado se concentra na obtenção de micrografias de aerotome de alta qualidade de xilema sem o artefato no procedimento amostral. A demonstração viável é crítica porque há uma série de detalhes importantes que não podem ser facilmente explicados. Ao mesmo tempo, obter treinamento não é fácil porque apenas alguns laboratórios ao redor do mundo praticam esse método.Para iniciar este procedimento, inclua um galho e deixe para amostragem com um saco plástico preto para equilibrar o potencial hídrico entre xilema e folhas mais de duas horas antes da amostragem. Usando uma câmara de pressão, determine o potencial de água de pelo menos duas folhas da amostra. Quando o potencial hídrico é maior do que aproximadamente menos 0,5 megapascals, uma amostra pode ser colhida após o congelamento.Quando o potencial hídrico for menor que menos 0,5 megapascals, proceda com o tratamento para relaxamento. Fixar uma coleira impermeável ao redor da haste, que será preenchida com água. Usando tesouras de poda ou uma serra, corte o caule sob a superfície da água e mantenha a extremidade cortada da amostra debaixo d'água.Transfira a amostra para outro recipiente de água o mais rápido possível para minimizar a exposição da extremidade do corte ao ar. Para espécies de larga licença, certifique-se de que o comprimento do local onde a amostra de crio para SEM será obtida na borda cortada do caule colhido é maior do que o comprimento máximo do vaso da amostra, a fim de evitar artefatos induzidos pela tensão dentro do crisoample. Em seguida, cubra a amostra com um saco plástico preto para reduzir a transpiração.Mantenha a extremidade cortada da amostra na água e mantenha essa condição por aproximadamente 30 minutos, a fim de relaxar a tensão xileto. Depois disso, meça novamente o potencial hídrico para confirmar o relaxamento da tensão xilema. Primeiro, use uma tesoura ou uma faca de utilidade para cortar e abrir um lado de uma coleira apertada.Coloque a coleira firmemente ao redor da haste com fita adesiva enquanto segura a abertura horizontalmente. Coloque luvas isolantes, e segure com segurança o vaso de nitrogênio líquido. Execute nitrogênio líquido no colarinho até que esteja cheio e mantenha-o preenchido, adicionando nitrogênio líquido adicional para congelar completamente a água no xilema.Após tempo suficiente de congelamento, retire a coleira da porção congelada da haste da amostra, a fim de remover o nitrogênio líquido. Use imediatamente uma serra de mão fina para colher a amostra. Em seguida, cubra a amostra congelada com um pedaço de papel alumínio ou coloque-a de volta em um tubo de amostra.Coloque rapidamente a amostra colhida em um recipiente cheio de nitrogênio líquido. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para realizar a observação. Para começar, defina a temperatura da câmara de espécimes do criostat para menos 30 graus Celsius, que geralmente é fria o suficiente para manter a seiva de xilema da maioria das plantas em um estado congelado.Use uma faca afiada ou uma serra de dentes finos para aparar a amostra em um pequeno pedaço que pode ser ajustado para o suporte de espécime de um crio-SEM. Monte a peça aparada em um mandril, um suporte para um criostat, com meio de incorporação de congelamento de tecido para crio-seção. Conecte o mandril a um suporte de espécime de um microtome do criostat.Corte a superfície raspando repetidamente seções de cinco a sete micrômetros de espessura. Cortar mais de 1.000 a 2.000 micrômetros em profundidade total à superfície inicial é útil para a mente danificada da amostra causada pelo pré-corte. Depois de aproximadamente aparar uma superfície da amostra, ajuste uma porção não utilizada da lâmina de microtome acima da superfície do espécime.Amplie ligeiramente a distância entre a superfície do espécime e a lâmina. E corte a superfície apenas uma ou duas vezes. Em seguida, deslize a lâmina novamente e posicione uma porção não utilizada da lâmina sobre a superfície do espécime.Repita este processamento de corte três a quatro vezes para obter uma superfície clara sem marcas de faca. Após o corte final, coloque a posição da lâmina longe da amostra para evitar que a poeira grude na amostra. E desprende o mandril do microtome.Em seguida, conecte o espécime a um suporte de espécime crio-SEM com meio de incorporação de congelamento de tecido na câmara criostat. Primeiro, use nitrogênio líquido para manter uma temperatura abaixo de menos 120 Celsius na câmara de espécimes crio-SEM de acordo com o manual do usuário do equipamento. Em seguida, coloque o porta-espécimes com o espécime preparado em um recipiente isolante cheio de nitrogênio líquido na câmara criostat.Use uma haste de troca de espécimes para segurar o suporte da amostra sob o nitrogênio líquido. Transfira rapidamente o titular do espécime para a câmara de pré-evacuação da câmara de espécimes crio-SEM assim que iniciar a evacuação da câmara de pré-evacuação. Para começar, ligue a tensão de aceleração da arma elétrica.Em seguida, eleve a temperatura do estágio da amostra para menos 100 graus Celsius. Aguarde vários minutos para que a poeira de geada seja removida e para que o nível de superfície do gelo nas células xilema diminua ligeiramente em comparação com as paredes celulares. Em seguida, abaixe a temperatura do estágio de espeliumen para menos 120 graus Celsius.Neste estudo, os métodos de observação crio-SEM são utilizados para visualizar claramente a distribuição de água em escala celular. Em baixa ampliação, a área negra nas imagens indica as cavidades das quais a água desaparece total ou parcialmente, enquanto a área cinza indica paredes celulares xilema, citoplasma e água. Em alta ampliação, torna-se evidente que a água não está totalmente perdida da luminária de três traqueidos, indicando a ocorrência de bolhas macro na seiva de xilema in situ.Com relação às espécies de licenças largas, a ocorrência de cavitação é facilmente detectada dentro dos vasos, enquanto a existência da água é difícil de distinguir dentro das fibras, especialmente na baixa ampliação. As células citoplasma e parenchyma podem ser distinguidas da água dentro de traqueidas ou vasos através de texturas de plano de gelo. A análise do efeito da temperatura no processo de congelamento revela que a poeira geada é gradualmente sublimada, e as membranas endotracides se tornam mais claras através da progressão da sublimação com o aumento da temperatura.As grandes partículas de pó de geada restantes podem ser eliminadas por uma gravação mais congelada. Mas isso pode ser problemático, pois diminui desnecessariamente o nível de superfície do gelo em conduítes xilema. A alta qualidade da observação é em grande parte alcançada através da preparação precisa dos espécimes.A alisamento da superfície com a lâmina afiada do microtoma é especialmente importante. A alisamento insuficiente por uma lâmina usada pode às vezes criar uma superfície áspera que se assemelha a marcas de faca, ou pode criar inúmeras ocorrências de poeira a partir dos cortes. O congelamento da amostra sem o relaxamento da pressão negativa da coluna de água causará indução artefatofato de cavitação em conduítes xilema.Cristais de gelo agrupados são observados em vasos de espécimes onde a amostra não foi relaxada. Contrastantemente, nenhum cristais de gelo agrupados são observados nos espécimes de amostras relaxadas com um potencial hídrico semelhante. A aplicação da fixação de congelamento a plantas vivas que sofrem seca pode induzir artefatos baseados em resultados, como cristais de gelo agrupados.Esses artefatos levam a interpretações erradas do estado da água no conduíte xilema. Por isso, é importante primeiro confirmar o potencial hídrico das amostras antes da fixação do congelamento. Embora este procedimento prevea uma imagem de que status no conduíte xilema, uma árvore viva deve ser destruída para a observação.A combinação de outros métodos de observação não invasivos, como ressonância magnética ou microctura com observação de imagem de nível subsidiário, aprofundará nossa compreensão da natureza entre transporte de água e uso. A observação do estado hídrico introduzido por este artigo também fornecerá um método para o esclarecimento da relação da água que se mistura nas células e outras respostas anatômicas ao estresse abiótico ou biótico. Crio-SEM equipado com espectroscopia de raios-X dispersivos de energia ou top sim têm sido usados para estudar a distribuição de elementos sobre a superfície de um espécime contendo água.A combinação da análise elementar e este procedimento nesse quadro semelhante pode nos dar profundo conhecimento do comportamento da célula xilema relacionada ao estado da água. Ao usar nitrogênio líquido para fixação congelante de amostras em uma sala, não se esqueça de ventilar a sala para evitar a deficiência de oxigênio.

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