Name: Microfocus X-Ray CT (microCT) imagem latente de Actinia equina da (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), e Xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a realizar microCT de invertebrados marinhos como Actinia equina, Harmothoe sp. e Xenoturbella japonica. Este protocolo acessível utiliza materiais comuns para preparação, coloração e montagem de amostras.

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Gostaríamos de agradecer a Toshihiko Shiroishi por sua assistência e por fornecer o ambiente de pesquisa durante este estudo. Estamos gratos a Kensuke Yanagi e Takato Izumi por conselhos sobre a . equina da, e Masaatsu Tanaka para aconselhamento sobre o espécime Harmothoe SP. Gostaríamos de agradecer aos funcionários do Shimoda Marine Research Center, da Universidade de Tsukuba, e Misaki Marine Biological Station, a Universidade de Tóquio para a sua ajuda em coleções de amostras. Gostaríamos de agradecer a Editage (www.editage.jp) para edição de idioma inglês. Este trabalho foi apoiado pelo JSPS Grant-in-Aid para jovens cientistas (A) (JP26711022) para HN, e JAMBIO, Associação Japonesa de biologia marinha.

1. fixação
<ol><li>Para Actinia equina da, relaxe os animais em 10% MgCl2 água do mar por cerca de 15 min à temperatura ambiente. Transfira para 70% etanol e armazene à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para Harmothoe SP., anestesiar os animais, colocando-os em água do mar gelada por cerca de 15 min. transferência para 10% (v/v) solução de formalina com água do mar e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para Xenoturbella japonica, relaxe o animal usando 7% MgCl2 em água doce. Correção em 4% paraformaldeído (PFA) em água do mar filtrada durante a noite. Coloque em 70% de etanol e armazene a 4 ° c. PRECAUÇÃO: o PFA é perigoso e deve ser manuseado com cuidado.</li>
</ol>2. coloração
<ol><li>Transfira as amostras para 50% de etanol e armazene à temperatura ambiente por 15 h. Substitua o etanol de 50% com etanol a 25% e armazene à temperatura ambiente por 2 h. Nota: isto não é necessário para a amostra de Harmothoe SP. em solução de formalina a 10% (v/v) com água do mar.</li>
	<li>Substitua a solução por água destilada (DW) e guarde as amostras em DW à temperatura ambiente durante 2 h. Repita este passo três vezes.</li>
	<li>Prepare 25% de solução de Lugol diluindo a solução de ações (abaixo) para 25% com DW. Solução de estoque (100% solução Lugol) contém 10 g de KI e 5 g de I2, ajustado para 100 ml com DW. Nota: a solução Lugol é sensível à luz, para armazenar e manusear a solução protegida da luz. Siga os regulamentos de cada país e instituição para manuseio de iodo e descarte de resíduos.</li>
	<li>Decantar o DW das amostras e despeje a solução de Lugol de 25%. Mancha para 24 h em temperatura ambiente.</li>
</ol>3. montagem do estágio
<ol><li>Prepare 0,5% de agarose dissolvendo 500 mg de agarose em 100 mL de DW em um balão cônico de 250 mL em um microondas (800 W, cerca de 1-3 min). Esfrie a aproximadamente 30-40 ° c mantendo na temperatura ambiente. Cuidado: não sobreaqueça ou sele completamente o balão quando aquecer para impedir que o agarose ferve sobre.</li>
	<li>Monte grandes amostras como a. equina da usando um tubo de 50 ml. Nota: Utilize tubos de 50 mL para montar amostras grandes que não se encaixem numa ponteira de 1.000 μL de micropipeta "azul".<ol>
<li>Coloque a amostra manchada em um prato de 60 mm com DW para lavar a solução de coloração excessiva da superfície.</li>
		<li>Despeje delicadamente 5 mL de agarose de 0,5% em um tubo de 50 mL e endureça o agarose no gelo. Tenha cuidado para não fazer bolhas no agarose.</li>
		<li>Adicione suavemente 20 mL de agarose de 0,5% ao tubo de 50 mL e coloque no gelo até que o agarose comece a endurecer. Coloc o espécime dentro do agarose de 0,5% usando o fórceps. Tenha cuidado para não fazer bolhas no agarose.</li>
		<li>Ajustar a posição e orientação da amostra com fórceps e endurecer o agarose no gelo.</li>
		<li>Coloque a argila no estágio de montagem do microCT e ajuste o tubo de 50 mL na argila (Figura 2a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte pequenas amostras como Harmothoe SP. e X. japonica usando uma ponta de 1.000 μl de micropipeta ' Blue '. Nota: para amostras menores, 200 μL de micropipeta ' amarela ' pode ser usada. Neste caso, utilize 30 μL de agarose para a ficha e adicione 200 μL de agarose ou água destilada.<ol>
<li>Elaborar 100 μL de agarose de 0,5% numa ponta de 1.000 μL de micropipeta "azul" e endurecer o agarose segurando a ponta sobre o gelo, fazendo uma ficha na ponta (Figura 2B-a).</li>
		<li>Decantar a amostra manchada em um prato de 60 mm sem usar fórceps.</li>
		<li>Transfira delicadamente a amostra usando pinças do anel em um outro prato 60-mm com DW para lavar fora a solução de mancha excessiva da superfície.</li>
		<li>Adicionar 1.000 μL de agarose 0,5% ou DW na ponta plugada (passo 3.3.1) usando uma micropipeta. Nota: o uso de 0,5% de agarose é recomendado, mas use DW para amostras frágeis ou preciosas em que o agarose deve ser evitado.</li>
		<li>Transfira delicadamente a amostra do prato de 60 milímetros no agarose ou no DW na ponta obstruída usando as pinças do anel.</li>
		<li>Ajuste suavemente a posição e a orientação da amostra com uma agulha petiolada ou pinças de precisão. Tenha cuidado para não fazer bolhas no meio de montagem. Certifique-se de que a amostra é estável entre as paredes da ponta quando DW é usado como meio de montagem (Figura 2D-b). Coloc a ponta no gelo para endurecer o agarose se é usado como o meio de montagem.</li>
		<li>Corte a ponta de uma nova ponta de 1.000 μL de micropipeta "azul" (Figura 2b-b, c) e insira a ponta da ponta plugada na nova ponta.</li>
		<li>Coloque a argila no estágio de montagem do microCT e defina as pontas com a amostra dentro da argila (Figura 2C, D). Nota: a solução de coloração vai começar a lavar a amostra uma vez que é colocado em DW, Então prossiga para a próxima etapa de digitalização prontamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. digitalização MicroCT
<ol><li>Ligue o feixe de raios-X a 80 kV, 100 μA.</li>
	<li>Enquanto observa a imagem de transmissão de raios-X no centro da tela (Figura 3a),mova o palco para que toda a amostra possa ser vista clicando nos botões do eixo x e Z (Figura 3a) e manualmente ajustar o manípulo do eixo Y na fase de montagem (Figura 3B). Defina o contraste da imagem para que as estruturas internas possam ser observadas ajustando as condições de contraste (Figura 3a: contraste de imagem).</li>
	<li>Ajuste a orientação da amostra alterando o ângulo do tubo/ponta na argila (Figura 2a). Gire o estágio 90 ° definindo o eixo de rotação (Figura 3a) para90 e clicando no botão de movimento relativo (Figura 3a). Realize a mesma manobra quatro vezes para completar uma rotação completa. Nota: desligue manualmente o feixe de raios-X cada vez que a porta da amostra é aberta, a menos que o sistema desliga-lo automaticamente.</li>
	<li>Mova o palco para que a amostra esteja no centro da vista clicando no botão do eixo Z (Figura 3a) e ajustando manualmente o botão do eixo Y na fase de montagem (Figura 3B). Gire o palco por 90 ° e faça o mesmo. Gire o estágio 360 ° e verifique se a amostra está no centro da vista de todas as direções.</li>
	<li>Mova o palco ao longo do eixo x para a fonte de raio X clicando no botão do eixo x (Figura 3a) paraampliar a amostra e ajustar conforme necessário para que ele apenas se encaixe na vista (Figura 3C).</li>
	<li>Gire o estágio 360 ° e ajuste-o como necessário de modo que a amostra caiba dentro da vista de todas as direções.</li>
	<li>Ajuste as condições de digitalização, conforme mostrado na tabela 1.</li>
	<li>Iniciar a digitalização; demora cerca de 10 min.</li>
</ol>5. reconstrução da imagem
<ol><li>Inicie o software acessório do sistema microCT (consulte a tabela de materiais) e abra os dados digitalizados.</li>
	<li>Ajuste as diferenças no eixo de rotação da amostra durante a digitalização clicando no botão de cálculo do valor de deslocamento automático (Figura 4A: caixa verde).</li>
	<li>Ajuste a orientação da imagem girando as setas laranja (Figura 4B). Se a orientação foi alterada, repita a etapa 5,2.</li>
	<li>Clique na guia área (Figura 4c: caixa magenta) e aparar áreas onde as amostras não estão presentes (Figura 4c: caixa amarela).</li>
	<li>Clique na guia de reconfiguração (Figura 4D: caixa magenta) e defina os filtros da seguinte forma para remover o ruído. Artefato de anel reduzir filtro: filtro mediano-3; Filtro de eliminação de ruído: Average Filter-1.</li>
	<li>Execute a reconfiguração clicando no botão de reconfiguração (Figura 4D: caixa verde).</li>
	<li>Ajuste o brilho e o contraste da imagem definindo os valores preto e branco como valor preto 0, valor branco 250 (Figura 4D: caixa azul).</li>
	<li>Salve o conjunto de dados de imagem TIFF reconstruído como um TIFF de 8 bits clicando no botão salvar. Renomeie arquivos TIFF da seguinte forma: Date_sample_resolution (μm) _ Number. TIFF. Nota: os conjuntos de dados originais do microCT deste estudo estão disponíveis no repositório Figshare, doi: 10.6084/M9. figshare. 767083736.</li>
</ol>6. análise de dados
<ol><li>Inicie o software de análise de dados (consulte a tabela de materiais) e ative a importação de arquivos TIFF clicando no ícone do banco de dados (Figura 5a: caixa magenta) e desativando a caixa mostrada na Figura 5B.</li>
	<li>Clique no ícone de importação (Figura 5C: caixa magenta), selecione o conjunto de dados salvo na seção 5 e clique em abrir.</li>
	<li>Clique no botão copiar vínculos (Figura 5D) para importar os dados.</li>
	<li>Exiba a seção transversal 2D clicando no ícone do Visualizador 2D (Figura 5C: Blue Box).</li>
	<li>Calibrar o conjunto de dados clicando na guia visualizador 3D (Figura 5e: caixa magenta) e inserindo o valor de resolução na digitalização (que foi 0, 18 neste estudo [Figura 5F]).</li>
	<li>Clique no ícone de brilho/contraste (Figura 5E caixa verde). Ajuste o brilho e o contraste movendo o cursor para dentro da imagem 2D exibida e alterando o nível da janela e a largura da janela (Figura 5G).</li>
	<li>Verifique outras imagens de seção transversal movendo a barra de rolagem (Figura 5G: caixa).</li>
	<li>Altere a orientação da seção transversal clicando no ícone de orientação (Figura 5e: caixa azul) e verifique as imagens em todas as orientações (Figura 5H).</li>
	<li>Clique na imagem exibida e escolha a guia exportar para armazenar imagens de seção cruzada.</li>
</ol>

<ol><li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
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<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
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<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomographic+imaging+of+intact+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).</li>
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<li>Merkle, A. P., Gelb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+3D+X-ray+microscopy+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory.</a> Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os fixadores que utilizam formalina, como a solução de formalina a 10% (v/v) em água salgada utilizada neste estudo, são conhecidos por preservar a morfologia de diversos invertebrados marinhos e são freqüentemente utilizados para a microtomografia computadorizada18,24,25 ,26,28,30,33. No e...

Pesquisadores biológicos geralmente tiveram que fazer cortes finos e realizar observações por microscopia de luz ou eletrônica, a fim de investigar as estruturas internas de organismos opacos. No entanto, esses métodos são destrutivos e problemáticos quando aplicados a espécimes raros ou valiosos. Além disso, várias etapas no método, como incorporação e corte, são demoradas e pode demorar vários dias para observar uma amostra, dependendo do protocolo. Além disso, ao manusear inúmeras secções, existe sempre a possibilidade de danificar ou perder algumas secções. As técnicas do tecido-esclarecimento estão disponíveis para alguns espécimes1,2,3,4,5 mas não são ainda aplicáveis para muitas espécies animais.
Para superar esses problemas, alguns biólogos começaram a usar a tomografia computadorizada de raios X microfoco (microct) Imaging6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Na TC de raios-X, o espécime é irradiado com raios-X de vários ângulos que são gerados a partir de uma fonte de raios-X movendo-se em torno da amostra, e os raios-X transmitidos são monitorados por um detector que também se move em torno da amostra. Os dados de transmissão de raios-X obtidos são analisados para reconstruir imagens transversais do espécime. Este método possibilita a observação de estruturas internas sem destruição da amostra. Por causa de sua segurança e facilidade, é comumente usado em aplicações médicas e odontológicas, e os sistemas de TC podem ser encontrados em hospitais e centros odontológicos em todo o mundo. Além disso, o raio X Industrial CT é usado freqüentemente observando amostras não médicas para a inspeção e a metrologia no campo industrial. Em contraste com a TC médica, na qual a fonte de raios X e os detectores são móveis, as duas partes são fixadas em TC Industrial, com a amostra girando durante a digitalização. A TC Industrial geralmente produz imagens de maior resolução do que a TC médica e é referida como microCT (resolução em nível de micrômetro) ou nanoCT (resolução em nível de nanômetro). Recentemente, a pesquisa usando microct aumentou rapidamente em vários campos da biologia14,15,16,17,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34.
Os estudos biológicos que usam o CT inicialmente alvejou estruturas internas que consistem principalmente no tecido duro, tal como o osso. Avanços nas técnicas de coloração utilizando vários agentes químicos permitiram a visualização de tecidos moles em vários organismos6,7,8,9,14,15 , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34. destes reagentes, os agentes de contraste à base de iodo são relativamente seguros, baratos e podem ser utilizados para a visualização de tecidos moles em vários organismos7,14. No que diz respeito aos invertebrados marinhos, a microtomografia tem sido amplamente utilizada em animais como moluscos6,25,32,33, anípidos18,19, 20 anos de , 28, e arthorópodes21,23,29,31. No entanto, houve poucos relatos sobre outros animais phyla, como briozoários6, xenacoelomorphs26e cnidários24,30. Em geral, houve menos estudos usando microCT em invertebrados marinhos do que aqueles em vertebrados. Uma das principais razões para este uso limitado em invertebrados marinhos é a vasta diversidade observada nestes animais. Por causa de seus diversos tamanhos, morfologias e fisiologias, cada espécie reage diferentemente a diferentes procedimentos experimentais. Portanto, é crucial durante a preparação da amostra escolher o reagente de fixação e coloração mais adequado, e definir as condições em cada etapa, ajustadas para cada espécie. Da mesma forma, também é necessário definir as configurações de digitalização, como o método de montagem, tensão, corrente, taxa de ampliação mecânica e o poder de resolução de espaço, apropriadamente para cada amostra. Para superar esse problema, um manual simples e compreensível que abrange todas as etapas necessárias, explica como cada etapa pode ser ajustada dependendo da amostra, e mostra exemplos detalhados de várias amostras é essencial.
No presente estudo, descrevemos o protocolo de imagem microCT passo a passo, desde a fixação da amostra até a análise dos dados, utilizando-se três espécies de invertebrados marinhos. Os espécimes da Anemone de mar Actinia equina da (Anthozoa, Cnidaria) foram recolhidos perto da Estação Biológica Marinha de Misaki, Universidade de Tokyo. Eles tinham um corpo esférico e macio que tinha cerca de 2 cm de diâmetro (Figura 1a-C). As amostras de Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) também foram coletadas perto da Estação Biológica Marinha Misaki. Eram vermes finos que tinham cerca de 1,5 cm de comprimento, com cerdas resistentes presentes ao longo de todo o corpo (Figura 1D). Um espécime Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) foi coletado perto do Shimoda Marine Research Center, da Universidade de Tsukuba, durante a 13ª pesquisa conjunta do organismo costeiro jambio. Era um verme macio-encorpado que tinha cerca de 0,8 cm de comprimento (Figura 1e). Os ajustes feitos para as condições e as configurações de cada amostra são explicados em detalhe. Nosso estudo fornece várias sugestões sobre como executar a imagem microCT em invertebrados marinhos, e esperamos que ele inspire os biólogos a utilizar este protocolo para sua pesquisa.

<table><tbody><tr><td>Frasco Erlenmeyer de 250 ml</td><td>Corning</td><td>CLS430183</td><td></td></tr><tr><td>tubo de amostragem de 5 ml ST-500</td><td>BIO-BIK</td><td>103010</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno de 50 ml</td><td>Greiner Bio One International</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Prato não tratado</td><td>IWAKI</td><td>1010-060</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de grau ecológico (azul) 1000 &micro; l</td><td>BMBio</td><td>BIO1000RF</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>057-00451</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>061-00416</td><td></td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>094-05421</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>OsiriX DICOM Viewer</td><td>Pixmeo SARL</td><td>OsiriX MD v10.0</td><td>https://www.osirix-viewer.com</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de peciolato</td><td>AS ONE</td><td>2-013-01</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Pipetman P200</td><td>GILSON</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Pipetman P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de potássio</td><td>Pinças de precisão Wako Pure Chemical Industries</td><td>166-03971</td><td></td></tr><tr><td>5</td><td>DUMONT</td><td>0302-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>QuickRack MultI fit tip (amarelo) 200 ul</td><td>Sorenson</td><td>10660</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Feather</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de anel</td><td>NAPOX</td><td>A-26</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>aparelho de imagem por microtomografia computadorizada de raios X</td><td>Comscantechno</td><td>ScanXmate-E090S105</td><td></td></tr></tbody></table>

microfocus x-ray ct (microct) imagem latente de actinia equina da (cnidaria), harmothoe sp. (annelida), e xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Tradicionalmente, os biólogos tiveram que depender de métodos destrutivos, como o corte, a fim de investigar as estruturas internas de organismos opacos. A imagem latente não-destrutiva do tomography computado do raio X do microfoco (microCT) transformou-se um protocolo poderoso e emergente na biologia, devido aos avanços tecnológicos em métodos e nas inovações de coloração da amostra no hardware de microCT, em computadores de processamento, e em dados software de análise. No entanto, este protocolo não é comumente usado, como é nos campos médico e industrial. Uma das razões para esse uso limitado é a falta de um manual simples e compreensível que cubra todas as etapas necessárias: coleta de amostras, fixação, coloração, montagem, digitalização e análise de dados. Outra razão é a grande diversidade de metazoanos, particularmente invertebrados marinhos. Por causa dos diversos tamanhos, morfologias e fisiologias dos invertebrados marinhos, é crucial ajustar as condições experimentais e as configurações de hardware em cada etapa, dependendo da amostra. Aqui, os métodos da imagem latente de microct são explicados em detalhe usando três invertebrates marinhos filogeneticamente diversos: equina da de actinia (Anthozoa, Cnidaria), SP. de harmothoe (Polychaeta, Annelida), e japonica de Xenoturbella ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Sugestões sobre a realização de imagens microCT em vários animais também são fornecidos.

Nós executamos a imagem latente de microCT em a . equina da (Anthozoa, Cnidaria), SP. de Harmothoe (Polychaeta, Annelida), e X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) após ter manchar as amostras com a solução de Lugol de 25%. A coloração melhorou com sucesso o contraste das estruturas internas em todos os espécimes, possibilitando observações de tecidos moles internos (Figura 6). Juntamente com os relatórios passados6,<sup cl...

Aqui, os protocolos para executar a imagem latente do tomography computado do raio X do microfoco (microct) de três animais marinhos do invertebrados são explicados em detalhe. Este estudo descreve etapas tais como a fixação da amostra, a mancha, a montagem, a exploração, a reconstrução da imagem, e as análises de dados. Sugestões sobre como o protocolo pode ser ajustado para diferentes amostras também são fornecidos.

Microfocus X-Ray CT (microCT) imagem latente de Actinia equina da (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), e Xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...

A Micro TC não tem sido amplamente aplicada aos invertebrados marinhos devido à sua diversidade na morfologia. Nosso método permite a fácil montagem de amostras em qualquer ângulo adequado para sua morfologia. Pode ser realizado com materiais comuns, como água, argila e tubos, e se aplicável, a amostras com uma variedade de formas, de um verme longo a uma bola redonda.Demonstrando o procedimento estará Akiteru Maeno, técnico do Instituto Nacional de Genética do Japão. Para começar, prepare 0,5% de agarose dissolvendo 500 miligramas de agarose em 100 mililitros de água destilada em um frasco cônico de 250 mililitros, e coloque o frasco em um micro-ondas com a potência de 800 watts para aquecer cerca de um a três minutos. Esfrie o frasco à temperatura ambiente.Para montar grandes amostras que não se encaixam em uma ponta azul de micropipette de 1000 microliteres, como A.equina, primeiro coloque a amostra manchada em um prato de 60 milímetros com água destilada para lavar a solução de coloração excessiva da superfície. Em um tubo de 50 mililitros, despeje suavemente cinco mililitros de 0,5% de agarose sem fazer bolhas. Coloque o tubo no gelo para endurecer a agarose.Em seguida, adicione 20 mililitros de 0,5% de agarose ao tubo, coloque no gelo até que a agarose comece a endurecer, e use fórceps para colocar o espécime dentro da ágarose. Ajuste a posição da amostra para que seu eixo corporal seja vertical. Endureça a ágarose no gelo.Coloque argila no estágio de montagem do microCT e coloque o tubo de 50 mililitros na argila. Para montar pequenas amostras que se encaixam em uma ponta azul de micropipette de 1000 microliter, como Harmothoe sp. e X.japonica, decante a amostra manchada em um prato de 60 milímetros sem o uso de fórceps.Com pinças de anel, transfira suavemente as amostras para outro prato de 60 milímetros cheio de água destilada para lavar a solução de coloração excessiva da superfície. Em seguida, elave 100 microliters de 0,5% surgiram em uma ponta azul de micropipette de 1000 microlitares e coloque-a no gelo para endurecer. Ao manusear Harmothoe sp.adicionar 1000 microliters de 0,5% agarose no plugue de agarose na ponta. Use pinças de anel para transferir suavemente Harmothoe sp. do prato de 60 milímetros para a solução agarose na ponta.Com uma agulha petiolato ou pinças de precisão, ajuste a posição e orientação do harmothoe sp. para que o chaetae não seja dobrado de forma não naturalmente. Certifique-se de que não há bolhas presentes e, em seguida, coloque a ponta no gelo para endurecer a agarose.Ao manusear amostras frágeis como X.japonica, use uma micropipette para adicionar 1000 microliters de água destilada na ponta azul com o plugue de agarose endurecido. Posicione o X.Japonica na água destilada para que fique estável entre as paredes da ponta. Para amostras menores, pode-se usar uma ponta amarela de micropipette de 200 microliptos.Neste caso, use 30 microliters de agarose para o plugue, e adicione 200 microliters de agarose ou água destilada. Em seguida, corte a ponta de uma nova ponta azul de micropipette de 1000 microliter, e insira a ponta da ponta plugada na nova ponta. Coloque argila no estágio de montagem do microCT e coloque as pontas com a amostra dentro na argila.Imediatamente após a montagem das amostras, ligue o feixe de raios-X a 80 quilovolts e 100 microamps. Ao observar a imagem de transmissão de raios-X, mova o estágio para que toda a amostra possa ser vista clicando nos botões do eixo x e z, e ajustando manualmente o botão do eixo y no estágio de montagem. Ajuste as condições de contraste da imagem para que as estruturas internas possam ser observadas.Ajuste a orientação da amostra alterando o ângulo do tubo na argila. Gire o estágio 90 graus definindo o eixo de rotação para 90 e clicando no botão Movimento Relativo. Faça a mesma manobra quatro vezes para completar uma rotação completa.Desligue manualmente o feixe de raios-X cada vez que a porta da amostra for aberta, a menos que o sistema o desligue automaticamente. Agora clique no botão do eixo z e ajuste manualmente o botão do eixo y para mover o estágio de montagem para que a amostra esteja no centro da vista. Gire o palco em 90 graus e ajuste a amostra para o centro novamente.Gire o estágio 90 graus mais três vezes, e ajuste conforme necessário para ter certeza de que a amostra está no centro da vista de todas as direções. Em seguida, clique no botão x-axis para mover o palco ao longo do eixo x em direção à fonte do feixe de raios-X para ampliar a amostra e ajustar conforme necessário para que ele apenas se encaixe na vista. Gire o palco e ajuste conforme necessário para ter certeza de que a amostra se encaixa na vista de todas as direções.Ajuste as condições de digitalização e comece a digitalizar. Neste experimento, a imagem microCT foi realizada em Actinia equina, Harmothoe sp. e Xenoturbella japonica após coloração com solução de 25% Lugol.A coloração melhorou com sucesso o contraste das estruturas internas em todos os espécimes, permitindo observações de tecidos moles internos. Este método é aplicável a espécimes frágeis mesmo com danos externos, como pode ser visto a partir da amostra X.japonica com epiderme gravemente danificada. Um único conjunto de dados de alta resolução de um espécime inteiro foi reconstruído para Harmothoe sp.e X.japonica de múltiplos escaneamentos realizados em diferentes partes, mas sobrepostas da amostra. Certifique-se de definir a amostra no tubo ou ponta e montar o tubo ou ponta no microCT para que ele não se mova durante a varredura. Os dados obtidos a partir deste procedimento podem ser utilizados para reconstruções de imagem 3D, permitindo ao pesquisador compreender plenamente a morfologia interna e externa da amostra.Todos os sistemas microCT usam raios-X, mas as especificidades podem ser diferentes de um sistema para outro, por isso, certifique-se de seguir de perto as instruções de cada sistema.

microfocus-x-ray-ct-microct-imaging-actinia-equina-cnidaria-harmothoe

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Microfocus X-Ray CT (microCT) imagem latente de Actinia equina da (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), e Xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

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