In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

Este protocolo fornece dois métodos para mobilizar C.Elegans para realizar imagens in vivo de cálcio dos músculos da parede corporal. Este método pode ajudar a responder perguntas relacionadas à homeostase de cálcio e manuseio de cálcio, e uma sinapse acessível em organismo geneticamente tratável. Essa técnica pode proporcionar uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a homeostase do cálcio muscular e, portanto, pode ser importante na identificação de condições ou vias moleculares que impactam o acoplamento da excitação através da desregulamentação do ciclismo de cálcio.

Esses métodos podem fornecer insights sobre áreas de pesquisa, incluindo, mas não limitado também, neurobiologia, biologia do desenvolvimento e biologia celular. Essas técnicas poderiam ser adaptadas para estudar uma variedade de tipos de células e C.elegans, outros nematoides relacionados, bem como larvas de filsafat. A demonstração visual deste método é fundamental para que o experimentador possa entender a técnica de dissecção e ser capaz de avaliar com precisão os transitórios de cálcio de animais devidamente imobilizados.

Comece configurando o microscópio para imagens fluorescentes. Use uma câmera CMOS científica capaz de imagens completas em 100 hertz, a fim de rastrear mudanças rápidas nos níveis de cálcio. Controle aquisição de câmera e excitação fluorescente led com um software microgerente em execução no ImageJ.

Use um plug-in eletrônico de plataforma de código aberto que se conecta a uma placa de microcontrolador de fonte aberta externa para gerenciar os pulsos de tempo externos que controlam excitações fluorescentes. Para controlar a lógica de tempo, ative o protocolo de aquisição de microgerente no software de acordo com as instruções dos fabricantes. Use dois LEDs para estimular a rodopsina do canal com luz azul e registrar as alterações de RCaMP.

Ative a rodopsina do canal com LED am com o comprimento de onda de entrada máxima de 470 nanômetros e um filtro de bandpass, e excite o RCaMP com um LED com um comprimento de onda de entrada máxima de 594 nanômetros e um filtro de bandpass. Co-ilumine ambos os LEDs e transmita a luz para o mesmo caminho óptico usando um combinador de feixedicróico. Controle o tempo da iluminação LED com um estado sólido de interruptores controlados por sinais TTL de acordo com as instruções do manuscrito e defina a intensidade do LED com as fontes de alimentação lineares de ruído de carga controladas atuais e programe o protocolo de simulação de luz azul em um simulador.

Neste experimento, ligue a simulação de luz azul após dois segundos de captura apenas da fluorescência RCaMP e use um trem de cinco, dois pulsos de luz azul milissegundos com intervalos de 50 milissegundos para ativar a rhodopsina do canal. Se estiver usando a preparação de dissecção, realize a dissecação de C.elegans com pouca luz. Coloque os animais no prato de dissecção com a base de cobertura revestida de silicone que é preenchida com um milimole de solução extracelular de cálcio preparada de acordo com as instruções do manuscrito.

Cole os animais usando o adesivo de pele tópica líquida com coloração azul ao longo do lado dorsal do verme. E faça uma incisão lateral de cutícula ao longo da cola e interface de verme usando agulhas de vidro. Use uma pipeta bucal para limpar as vísceras internas da cavidade do verme, em seguida, cole a retalho cutícula do animal para expor os músculos da parede do corpo medial ventral para a imagem.

Se usar a preparação de nano-contas, faça uma solução derretida de 5% Agra usando água destilada para um volume final de 100 mililitros. Use uma pipeta Pasteur para colocar uma gota de solução de Agra derretida em um slide de vidro e coloque imediatamente um segundo deslizamento de vidro sobre a parte superior usando suavemente pressão para criar uma almofada de Agra uniforme. Remova o slide superior e em aproximadamente quatro microliters de nano-contas de poliestireno para o meio da almofada.

Em baixa luz adicione quatro a seis C.elegans na solução nano-contas, certificando-se de que os animais não se deitam em cima uns dos outros, e cuidadosamente coloquem um deslizamento em cima. Quando estiver pronto para a imagem, coloque o slide preparado ou a placa de dissecção no microscópio e encontre e concentre-se em um worm usando 10 vezes a ampliação e a iluminação de campo brilhante fraca. Mude para 60 vezes a ampliação na excitação fluorescente RCaMP para identificar um músculo da parede medial do ventrum que é anterior à vulva e no plano vocal correto.

Em seguida, altere o caminho da imagem da ocular para a câmera, puxando o alternador e clicando ao vivo dentro do software de aquisição de dados. Clique no botão ORI no software de aquisição de dados e crie uma caixa em torno do músculo que está sendo focado. No estimulador, ligue a via de estimulação da luz azul previamente programada e clique em Adquirir no software de imagem para capturar a imagem.

Quando os C.elegans são cultivados em retina totalmente trans, incorporando com sucesso a retina e ativando a rodopsina do canal, um transitório de cálcio pode ser evocado. Se os animais não forem expostos à retina totalmente trans, nenhum passageiro de cálcio muscular é acionado. Este protocolo foi usado para investigar a perda de funções de mutantes sca-1, que impactam a bomba de cálcio órticulo sarcoplasmático codificada pelo gene sca-1.

Mas, a preparação da dissecção aumenta nos níveis de linha de base da fluorescência de RCaMP foram observados no mutante em comparação com o controle, sugerindo que a mutação precisa dos níveis elevados de cálcio citoplasmica de repouso. Houve uma diminuição significativa nos níveis de pico de cálcio nos mutantes de esca-1 em comparação com o controle. No entanto, nenhuma mudança foi vista no horário de pico aumentado ou no tempo de decadência da metade.

É importante ressaltar que resultados semelhantes podem ser observados usando a preparação de nano-contas menos tecnicamente desafiadora. A perda de funções de slo-mutantes, que interrompem os grandes canais de potássio ativados de cálcio foram avaliados a fim de investigar mutantes que indiretamente afetam o manuseio de cálcio em C.elegans. Quando os níveis de linha de base de RCaMP foram medidos, os mutantes apresentaram aumento da fluorescência em comparação com os controles.

Ao avaliar a cinética do cálcio não foram observadas alterações nos níveis de pico de cálcio. Os mutantes slo-1(eg142), no entanto, apresentaram um aumento significativo para o horário de pico. O passo mais importante a ser lembrado ao completar o procedimento é preparar animais experimentais em retina totalmente trans.

Sem esta etapa, a rodopsina do canal estará inativa, impedindo que transitórios de cálcio induzidos pela luz sejam acionados. Após este procedimento, a eletrofisiologia e a análise comportamental podem ser feitas para avaliar o impacto funcional de quaisquer alterações observadas na homeostase do cálcio. Utilizando os métodos de imobilização aqui descritos, abre caminho para uma maior exploração da dinâmica do cálcio e demonstra que resultados comparáveis podem ser observados em resposta à estimulação neuronal optogenética e captura de transintes de cálcio muscular usando a técnica de imobilização de contas muito menos desafiadora.