Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

O relatório primário é realmente a importância do estresse de localizar com precisão a região de frequência específica da membrana basilar na maioria dos modelos, onde os números de sinapse alterados e a função podem ser analisados. A localização coclear das regiões de frequência específica é realizada de forma confiável utilizando mapas de frequência em conjunto com dados de cocleograma. O microscópio fornece informações sobre vários estudos de pesquisa.

Apoia a noção de que a neuropatia coclear é os eventos iniciais primários especificamente anteriores à perda auditiva, zumbido e hiperacusia. Depois de confirmar a falta de resposta ao dedo do dedo beliscão em um anesthetizado adulto C57 preto 6J rato masculino. Coloque o mouse em uma almofada de calor de 37 graus celsius em uma sala elétrica e acústica blindada.

Em seguida, coloque um eletrodo de gravação de agulha subdérmica de 20 milímetros de 28 milímetros, com a profundidade de três milímetros sob a pele no vértice do crânio. Um eletrodo de referência na região parotid ipsilateral, abaixo do pina de orelha medida e um eletrodo moído na região parotid contralateral. Coloque um alto-falante de campo fechado equipado com um tubo de plástico de dois centímetros com uma ponta em forma de cone ao lado do mouse e encaixe a ponta no canal auditivo externo.

Para uma resposta auditiva do tronco cerebral, ou gravação de ABR, gerar tubos de tom na diminuição dos níveis de pressão sonora de 90 a 10 decibéis, em cinco a 10 passos de nível de pressão sonora. Durante esta etapa, as respostas são amplificadas, filtradas e mediadas. Em cada frequência, determine o limiar de ABR, que é o nível mínimo de pressão sonora que resulta em uma gravação ABR confiável com uma ou mais ondas distinguíveis que podem ser claramente identificadas pela inspeção visual.

Após a gravação da ABR, exponha a bulla do lado ventral e abra a bulla com uma tesoura afiada para ter acesso à cóclea. Usando fórceps finos, remova os ossos temporais e corte a artéria do estapes. Em seguida, remova as estapes da janela oval e rompa a membrana da janela redonda.

Gire suavemente a ponta de uma agulha de calibre 13 milímetros de 27 para fazer um pequeno orifício no ápice da cóclea, antes de usar uma pipeta fina para lavar suavemente 4% de paraformaldeído através da janela para os espaços perifáticos. Em seguida, enxágue os ossos três vezes por cinco minutos por lavagem com PBS molar fresco frio de 0,1 por lavagem. Seguido pela decalcificação dos ossos com 10% EDTA durante quatro horas em temperatura ambiente e 20 rotações por minuto em um agitador horizontal.

No final da incubação, transfira um osso temporal decalcificado para pbs molar fresco 0,1 sob um microscópio dissecando. Use 3 e 5 fórceps Dumont e uma agulha de calibre 27 para dissecar as regiões de cóclea apical, média e basal, por sua vez. Use uma lâmina de barbear para fazer uma pequena série de cortes ao longo do ligamento espiral e remover a membrana tectorial e a membrana de Reissner.

Dissecar ainda mais o epitélio auditivo restante, incluindo o limbus espiral, em curvas cocleares individuais para preparações de montagem inteiras. Em seguida, use o objetivo do óleo 40X de um microscópio leve para medir o comprimento da membrana basilar com escala de 250 micrômetros colocada na peça ocular. Pode ser ajustado ao longo da estereócilia das células ciliadas internas.

Após a dissecção, coloque cada coclear se transforme em tubos de centrífuga individual de 2,5 mililitros. Bloqueie qualquer ligação inespecífica com soro de cabra de 10% em PBS em 0,1% Triton X-100 por uma hora em temperatura ambiente em um rotador. No final da incubação, use 200 pontas de pipeta de microliter para remover a solução sob um microscópio de dissecção.

Incubar os espécimes com os anticorpos primários de interesse diluídos em 5% de soro de cabra e PBS em 0,1%Triton X-100 durante a noite a 4 graus Celsius em um rotador. Na manhã seguinte, enxágue as amostras de tecido três vezes por cinco minutos com PBS molar frio de 0,1 por lavagem para remover qualquer anticorpo primário residual. Em seguida, rotule os espécimes com os anticorpos secundários apropriados diluídos em 5% de soro de cabra em PBS em 0,1%Triton X-100 por duas a três horas em temperatura ambiente no rotador, protegido da luz.

Ao final da incubação, lave as amostras três vezes com PBS molar 0,1, como demonstrado e transfira as amostras para placas individuais de 35 milímetros contendo PBS molar de 0,1 molar. Coloque uma gota de meio de montagem complementado da DAPI no slide e transfira as amostras do PBS para o meio de montagem. Coloque uma borda de uma tampa escorregando em cada slide e solte para deixar os deslizamentos da tampa caírem suavemente.

Em seguida, seque os slides em uma caixa de slides a quatro graus Celsius durante a noite. Para imaginar os espécimes, use um microscópio confocal com os lasers apropriados e lente de imersão de óleo de alta resolução 63X para adquirir oito pilhas Z confocal de oito micrômetros de cada curva coclear. Para contagem de puncta sináptica, defina as pilhas Z com o tamanho da etapa de 0,3 micrômetros para cobrir todo o comprimento das células ciliadas internas, garantindo que todas as puncta sinápticas possam ser imagens e mesclar as puncta contendo imagens em uma pilha Z para obter a projeção de acesso Z.

Importe as imagens mescladas em um programa de software de processamento de imagens apropriado. Divida a contagem total sináptica em cada pilha Z em regiões de frequência específicas pelo número de células ciliares internas positivas da DAPI para calcular o número de punctas sinápticas para cada célula. Em cada região de frequência específica, média de todas as punctas sinápticas em três imagens de diferentes campos microscópicos, contendo nove a 11 células ciliares internas.

Para visualizar melhor a arquitetura citoesquelética e a localização sináptica, utilize a ferramenta de pincel para avaliar visualmente a estrutura sináptica e a distribuição das células ciliadas internas individuais. Para inspecionar a justaposição de fitas presinápticas e patches de receptores postinopáticos, use a ferramenta de letreiro retangular extrair o espaço voxel ao redor das fitas e usar o corte de imagem para isolar as fitas individuais. Em seguida, clique no tamanho da imagem e da imagem para adquirir uma matriz miniatura dessas projeções em miniatura que podem ser usadas para identificar sinapses emparelhadas versus fitas órfãs.

Todos os dez camundongos deste experimento representativo apresentaram limiares de ABR em resposta a rajadas de tom que variavam entre 25 e 70 decibéis por nível de pressão sonora, dependendo da frequência do estímulo. O limiar auditivo para este experimento foi menor em 16 kilohertz, correspondendo a aproximadamente 43% da distância do ápice coclear, sugerindo que a sensibilidade acústica é significativamente reduzida em outras regiões cocleares. Montagens inteiras do epitélio auditivo são dissecadas em três pedaços e os comprimentos são medidos e convertidos em sua distância percentual do ápice coclear.

A frequência na membrana basilar de cada curva coclear é calculada usando função logarítmica. Em ouvidos normais de camundongos adultos, a imunosstaining revela pares justtaposed de fitas sinápticas e manchas de receptor de glutamato. Estudando a superfície da membrana basolateral das células ciliares internas, com oito a 20 pares por célula.

Embora a grande maioria das punctas apareçam como pares justapostas em ouvidos normais, fitas órfãs são raramente observadas em altas ampliações. O número de sinapses de fita de células ciliares internas é maior na região de 16 kilohertz e diminui significativamente à medida que a distância deste local aumenta. A coisa mais importante a ser lembrada durante este procedimento é que é preciso garantir a integridade da membrana basal coclear.

Precisamos enfatizar a precisão até que a proficiência técnica seja alcançada. Após este procedimento, a terapia genética pode ser realizada para responder se a neuropatia coclear pode ser reparada por essa medida. Esta medida é uma técnica mais ampla para explorar a neuropatia coclear, que se os eventos iniciais primários associam-se a ter perda auditiva, zumbido e hiperacusia.