Name: Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de barreira hematoencefálica humana usando células endoteliais e neurônios para estudar o transporte de patógenos e biomoléculas. Este método permite avaliar efeitos fisiológicos em células cerebrais.

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Este estudo foi suportado por concessões internas do Institut Pasteur incluindo uma subvenção Incitative (PTR 435) e por uma concessão "Contrat de Soutien à la Recherche" fornecido pela Sanofi Pasteur ao Institut Pasteur. A. da Costa foi apoiado pela concessão de Sanofi-Pasteur e Florian Bakoa é beneficiário de uma bolsa de doutoramento fornecida pelo ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Estamos em dívida para Pr Pierre-Olivier Couraud e Dr Florença Miller para debates úteis.

A propriedade intelectual do sistema foi as patentes referenciados em 32, 35 e 38.

Neste artigo demonstramos como construir um cellulo em interface de sangue/cérebro, o BBB-Minibrain, combinando-se um modelo BBB e uma cultura de misturado cérebro células cerebrais (Minibrain) em um único kit. Este sistema é fácil de configurar e manipular para experimentadores bem treinados em cultura de células, biologicamente relevantes.
Quanto a qualquer outro modelo in vitro de BBB, seria obtidos resultados fiáveis se drástico controle da tensão da barreira é aplicado. Inserções devem se...

O cérebro é separado da circulação sistêmica por uma estrutura não-permeável que restringe as trocas entre o parênquima cerebral e o sangue, chamado a barreira hemato - encefálica (BBB). Na sua maioria composta de células endoteliais cerebrais, o BBB dinamicamente interage com astrócitos, micróglia perivascular e neurônios do parênquima cerebral vizinhas. As três principais funções do BBB são a criação e a manutenção da homeostase iónica para funções neuronais, fornecimento do cérebro com nutrientes e proteção contra lesões tóxicas ou entrada de patógenos1,2, que contribuem para a manutenção da homeostase do cérebro e suas funções3. Esta barreira é tão eficiente que apenas alguns medicamentos podem atravessar o BBB4,5. Actualmente, os métodos disponíveis para prever se uma molécula irá passar o BBB e se espalham o cérebro consistem em ex vivo estudos sobre rastreamento de imagem material, autópsia do cérebro de voluntários humanos por ressonância magnética (ressonância magnética) ou PET (posição de emissão tomografia computadorizada) ou farmacodinâmica e farmacocinéticos estudos pré-clínicos em animais6,7,8. Estas técnicas e modelos têm algumas limitações, como a resolução limitada do animal de estimação e a baixa sensibilidade de MRI6,8, a dificuldade de quantificar as moléculas (ou seja, moléculas de anticorpo com base, por exemplo) que mal penetrar o cérebro7e para o pré-clínicos estudos seu alto custo e estância de testes em animais.
O último ponto é importante porque, de acordo com a 3R regras, (substituição, redução e refinamento de experimentação animal) as administrações reguladoras pediram que os pesquisadores desenvolvem urgentemente alternativa cientificamente precisa ao animal experimentação9,10,11,12,13,14,15.
Nas últimas décadas, têm sido propostos vários modelos in vitro de BBB16,17,18 cultivando em filtro de membrana insere células endoteliais de diferentes espécies como o rato, rato, bovinos e suínos. Quanto a espécie humana é, a disponibilidade escassa e difícil de células primárias levou os pesquisadores a desenvolver modelos humanos baseados em células endoteliais do cérebro imortalizado ou células-tronco derivadas humanos19,20, 21. Estas barreiras são substitutos in-vitro adequados do BBB desde que eles expressam marcadores de célula endotelial, marcadores de junção apertada, transportadores de efluxo, portadores de soluto, receptores e responder a estímulos endotelial 20. Alguns modelos BBB usando inserções de filtro membrana revestidas com células endoteliais e outros tipos de células (ou seja, astrócitos, neurônios ou pericitos22,23,24) foram analisados. O objetivo dessas culturas co era aumentar as características físicas do BBB, aproveitando a secreção de fatores solúveis por astrócitos/neurônios ou pericitos.
No entanto, nenhum destes modelos inclui o parênquima cerebral para estudar e prever o destino de um candidato de drogas, uma vez que passou a barreira. Portanto, nosso objetivo era construir um cellulo em interface de sangue/cérebro, o BBB-Minibrain, combinando-se um modelo BBB e uma cultura de células cerebrais mistas em um único kit. O BBB-Minibrain usa um sistema de cultura que consiste em um filtro poroso, inserido em um poço de uma placa de cultura de células do multiwell. O filtro é revestido com células hCMEC/D3, uma linhagem de células endoteliais de cérebro humano que tem sido provada altamente confiável para droga BBB teste25,26,27, para formar o BBB. O Minibrain, que é uma cultura co diferenciada dos neurônios humanos e astrócitos derivados de28,o NTera/Cl2.D1 célula linha29 misturado junto com a linha de celular humana microglial CHME/Cl530 em proporção correspondente a microglia vs rácios de neurônio-astrócitos do cérebro31, é cultivada na parte inferior da placa bem.
Além de estudar a passagem de drogas através do BBB e o destino no parênquima, a interface de sangue-cérebro em cellulo modelo poderia ser uma ferramenta poderosa para lidar com a entrada de agentes patogénicos para o cérebro (neuroinvasiveness), a dispersão para o cérebro (neurotropismo) e a toxicidade (neurovirulence) podem exercer em células do parênquima cerebral. Estudos de Neurovirulence e neuroinvasiveness iria beneficiar o desenvolvimento de um eficiente no modelo cellulo e ser vantajoso para substituir os modelos animais. Usando o kit de BBB-Minibrain32, demonstrámos que o fenótipo neuroinvasive de raros mutantes virais que acumulados na francês neurotrópica estirpe do vírus do vírus da febre amarela (ou seja, FNV-YFV33,34) usada para preparar um descontinuados vacina viva YFV e a passagem de uma biomolécula neuroregenerative e neuroprotetor chamada Neurovita (conhecido como NV doravante no manuscrito)35. Porque NV nem naturalmente atravessa a membrana celular nem o BBB, NV foi fundida com a parte variável (VHH) de um anticorpo de cadeia única de lhama que atravessa as membranas biológicas incluindo o BBB e funciona como uma célula penetrante molécula (CPM)36. A propriedade CPM de VHH parece depender o ponto isoelétrico e o comprimento da VHH37.
Isto em cellulo teste deve tornar possível classificar as moléculas que potencialmente poderiam cruzar o BBB antes da realização de farmacocinética e análise farmacodinâmica em animais e, idealmente, ao mesmo tempo ser capaz de prever seu comportamento no sistema nervoso parênquima. Este sistema é fácil de configurar e manipular por profissionais bem treinados em cultura celular26,29,30,de38e biologicamente relevantes. O interesse de tais testes cellulo seria dupla: reduzindo os custos dos testes pré-clínicos de um lado e reduzir a utilização de testes em animais por outro lado.

<table><tbody><tr><td>Placas de 12 poços</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>5-fluoro-2' deoxiuridina</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>85mm Placa de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>83-3902-500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nf200</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>N4142</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercapto-etanol</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>CHME/Cl5</td><td>Unidade&eacute; de Neuroimmunologie Virale</td><td>A pedido do Dr. Lafon</td><td></td></tr><tr><td>CMC</td><td>Calbiochem</td><td>217274</td><td></td></tr><tr><td>Citosina &beta;-D-arabinofuranosídeo</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Placas escuras de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Endogro IV</td><td>Millipore</td><td>SCME004</td><td>meio de célula endotelial</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carlo Erba</td><td>529121</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30015-04</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>GIEMSA</td><td>RAL Diagnóstico</td><td>320310</td><td></td></tr><tr><td>Cabra-Anti Rato</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-545-003</td><td></td></tr><tr><td>Cabra-Anti Coelho</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS com Ca2+-Mg2+</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14025-100</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3</td><td>Cedarlane</td><td>CLU512</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15630-070</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>33263</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>L6274</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lúcifer Amarelo</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>MEM 10X</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21430</td><td></td></tr><tr><td>MEM 1X</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>42360</td><td></td></tr><tr><td>Ntera/Cl2D.1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1973</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>PBS sem Ca2+-Mg2+</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>PBS-Ca2+-Mg2+</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Caneta/Strep</td><td>Eurobio</td><td>CXXPES00-07</td><td></td></tr><tr><td>Poly-d-Lysine</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>QIAGEN</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de Rato I</td><td>Cultrex</td><td>3443-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Retinóico All-Trans</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação de RNA</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio 5,6%</td> <td>Eurobio</td><td>CXXBIC00-07</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>T75 Cell+ Frasco</td><td>Sarstedt</td><td>83-1813-302</td><td>Frasco de poliestireno para cultura de tecidos com tratamento de superfície específico (Cell+) para células aderentes sensíveis</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3460</td><td>inserções de cultura de membrana porosa de poliéster</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Água Ultra Pura</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Merck-Sigma Aldrich</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15040-033</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>YFV-FNV</td><td>IP Frasco</td> de <td>Vacina</td><td></td> Dakar</tr></tbody></table>

um modelo de interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

Início da triagem de medicamentos do sistema nervoso em uma pertinente e fiável no modelo BBB cellulo para sua penetração e sua interação com a barreira e o parênquima cerebral é ainda uma necessidade insatisfeita. Para preencher esta lacuna, nós projetamos um 2D no modelo cellulo, o BBB-Minibrain, combinando um poliéster membrana porosa cultura inserir BBB modelo humano com um Minibrain formado por uma tri-cultura de células do cérebro humano (neurônios, astrócitos e células microglial). O BBB-Minibrain nos permitiu testar o transporte de um candidato de medicamento neuroprotetor (por exemplo, Neurovita), através do BBB, para determinar o direcionamento específico desta molécula de neurônios e para mostrar que a propriedade neuroprotetor da droga foi preservada após a droga tinha atravessado o BBB. Também demonstrámos que BBB-Minibrain constitui um modelo interessante para detectar a passagem de partículas de vírus através da barreira de células endoteliais e monitorar a infecção do Minibrain por neuroinvasive partículas de vírus. O BBB-Minibrain é um sistema confiável, fácil de manusear para pesquisador treinado em tecnologia de cultura de células e preditiva de fenótipos de células do cérebro após tratamento ou insulto. O interesse de tais testes cellulo seria dupla: introdução derisking passos no início do desenvolvimento da droga, por um lado e reduzindo o uso da experimentação por outro animal.

O BBB-Minibrain é uma em cellulo experimental modelo de interface de sangue-cérebro.
O BBB-Minibrain está configurado no sistema de inserção de cultura de membrana de poliéster para imitar um compartimento de sangue no piso superior e um compartimento de cérebro no piso inferior da interface do sangue-cérebro (Figura 2AB). Consiste em um compartimento luminal com as...

Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Este modelo de interface sangue-cérebro humano é útil para estudar a transferência de moléculas para o sistema neurológico. Assim como para estudar micróbios, alcance um tumor infectado de dor cerebral. A adição do mini cérebro a esta barreira cerebral sanguínea ou modelo BBB permite o estudo de nossos patógenos e moléculas que fazem com que o BBB se comporte no cérebro.Demostrando o procedimento estará Florian Bakao, o doutorando do meu laboratório. Para configurar um dispositivo de inserção da cultura da membrana de poliéster mini cerebral BBB, diluir as células para cinco vezes 10 para as quatro células por inserção de concentração incompleta células endoteliais e adicionar o volume apropriado de células a cada cultura de membrana de poliéster inserir em uma placa de 12 poços. Em seguida, coloque as pastilhas e a incubadora de cultura celular até que as células atinjam 100% de confluência.Segure uma placa de 12 poços com um mililitro de poli-D-lysine ela bem por quatro horas em temperatura ambiente. Seguido por um mililitro de laminina por poço durante a noite. Substitua a laminina por um mililitro de célula endotelial complementada com soro bovino fetal de 5%, ou FBS.Coloque o lugar em uma incubadora por uma hora. Para preparar o mini grão, trippsinize suavemente os astrócitos dos neurônios humanos em CHME clonam cinco células. Associe as pelotas celulares com o meio celular endotelial completo.Depois de contar em 3,6 vezes 10 para o quinto neurônios e astrócitos a 0,4 vezes 10 para o quinto clone CHME cinco células por poço têm uma placa de 12 poços. E semeou a placa de 12 poços. Para construir o mini cérebro BBB 24 horas após a semeadura substitua o meio usado por um meio de célula endotelial completo fresco e transfira a cultura da membrana de poliéster revestida de células micro vasculares cerebrais sobre as mini células cerebrais.Em seguida, coloque o BBB com muitos dispositivos cerebrais na incubadora. Para validar a permeabilidade endotelial do cérebro BBB adicione 1,5 mililitros de tampão de transporte por poço a uma nova placa de 12 poços. E vire cada filtro de cabeça para baixo para remover cuidadosamente o meio sem afetar a barreira celular endotelial.Coloque cada filtro em um poço da placa cheia de tampão de transporte e adicione 0,5 mililitros de amarelo Lúcifer em cada poço. Em seguida, coloque a placa na incubadora por 10 minutos antes de transferir os filtros para um novo tampão de transporte preenchido com 12 placas de poço. Depois de configurar um BBB muitos dispositivos cerebrais como demonstrado, adicione 3500 unidades de plataforma da cepa de vírus neurotrófico francês do vírus da febre amarela diluída e 50 microliters de 2%FPS células endoteliais média, com muito cuidado, em cima do compartimento luminal.Inocular o controle do mini cérebro BBB com 50 microliters de 2%FBS endotelial médio sem vírus. Em seguida, coloque o vírus expondo BBB muitos dispositivos cerebrais na incubadora por 24 horas. No dia seguinte, remova as pastilhas para determinar a permeabilidade da célula endotelial e um companheiro, assim como demonstrado.Salve um mililitro de amostra de cada poço para determinar o titulador do vírus no compartimento médio. Sob a inserção suavemente para evitar vazamento do compartimento luminal nos compartimentos abluminais. Para estudar o transporte de um neurônio direcionado biomolecular através da barreira cerebral do sangue, adicione a bio molécula de interesse às pastilhas e devolva a placa à incubadora de cultura celular.Após 24 horas, insere remotamente e determina a permeabilidade endotelial. Em seguida, colorique as muitas células cerebrais com o anticorpo apropriado para detectar a presença da bio molécula de interesse dentro do mini cérebro. As micro células endoteliais cerebrais humanas expressam todos os subconjuntos de rececptors, transportadores Efflux ou transportadores que são proteínas relevantes para suas funções biológicas.Alguma cepa de vírus neurotrópico francês do vírus da febre amarela pode atravessar a barreira cerebral do sangue em 24 horas. Os vírus então amplificam pelos próximos dois dias pela multiplicação do vírus dentro das células cerebrais. Além disso, a expressão de biomarcadores virais específicos é estimulada quando essa população viral neurovasiva é serialmente passagemda nas mini células cerebrais e estritamente correlacionada com a carga viral.Depois de ser adicionado ao limite da molécula de penetração celular compartimental Neuro-Tag Neurovita atravessa a barreira cerebral do sangue e é capaz de atingir neurônios humanos. Molécula de penetração celular neuro tag Delta neurovita cruza a barreira celular endotelial, mas tem como alvo menos eficientemente os neurônios humanos. Após ser adicionada ao pequeno compartimento médio, a molécula de penetração celular Neuro-Tag Neurovita atravessa a barreira cerebral do sangue e é capaz de regenerar os axônios dos neurônios humanos, após o ferimento.Em contraste com a molécula de penetração celular Neuro-Tag Neurovita Delta, a forma inativa de Neurovita. Quando aplicado após a molécula de penetração de células de axônio Neuro-Tag Neurovita desencadeia a proteção neurológica dos neurônios feridos e a regeneração x zonal. Estritamente por uma boa questão de práticas.não use demais passagens de células I. Tente manter alguma semelhança de médias e regiões e verificar a ausência de mycoplasma. Interações entre o mini cérebro e as drogas são micróbios de interesse podem ser mais estudados por transcrição que quimicamente esta ou biologia clássica chamada técnicas.

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Neuroscience

Neurociência

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Barreira hematoencefálica ou modelo BBTB: uma adaptação da barreira hematoencefálica ou modelo BBB para avaliar a administração terapêutica ao tumor

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Um modelo in vitro para estudar o cruzamento de patógenos da barreira hematoencefálica e a infecção de células cerebrais

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Analisando a Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica por Travessia Microbiana através de Células Endoteliais Microvasculares

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.

Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

Este relatório fornece protocolos para montagem, cultura de células e ensaios na plataforma μSiM para a construção de modelos de barreira hematoencefálica.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

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Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Este protocolo descreve um modelo in vitro confiável e eficiente da barreira sanguínea cerebral. O método utiliza células endoteliais vasculares cerebrais de camundongos bEnd.3 e mede a resistência elétrica transmembrana.

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

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