Name: Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a administrar bactérias por via oral em larvas de Galleria mellonella para estudar respostas imunes inatas. Este protocolo acessível substitui roedores em pesquisas imunológicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo DFG (SPP1656), o grupo de formação de pesquisa DFG 1708, o Bundesministerium für Bildung und pesquisa (BMBF) e o centro alemão para pesquisa de infecção (DZIF).

1. mellonella g. criação e preparação das larvas para os experimentos
Nota: O ciclo de ovo a último ínstar larva leva aproximadamente 5-6 semanas.
<ol><li>Transferi os ovos postos pelas traças adultas para caixas de 2 L, contendo substrato traça da cera (grãos de milho 22%, 22% de farelo de trigo, 17,5% cera de abelha, 11% leite em pó desnatado, mel de 11%, 11% de glicerol, 5,5% secada levedura). Execute toda a criação a 30 ° C, no escuro.</li>
	<li>Transferi 25 g de substrato contendo as larvas no substrato fresco após aproximadamente 1-2 semanas quando pequenas e minúsculas larvas eram visíveis. Sincronizar as larvas após 2 semanas de acordo com seu tamanho e manter grupos de larvas de 30-40 em recipientes de 2L em substrato de traça de cera por mais 2 semanas.</li>
	<li>Selecione as larvas para experimentos em peso. Use apenas pálidas e rápidas larvas em movimento com uma massa de 180-200 mg.</li>
</ol>2. cultivo e preparação de Bacteroides vulgatus e Escherichia coli para administração oral
<ol><li>Crescer a bactéria anaeróbica obrigatórios Bacteroides vulgatus mpk a 37 ° C por via anaeróbia usando potes e saquinhos para a criação de um ambiente anaeróbio (ver Tabela de materiais)15,16. B. vulgatus de cultivar por 2 dias e crescer uma subcultura durante a noite no cérebro coração (BHI) de infusão caldo de carne.</li>
	<li>Crescer a bactéria anaeróbicas facultativas mpk de Escherichia coli em condições aeróbias em caldo Luria-Bertani (LB) a 37 ° C. Cultivar a Escherichia coli , pernoite em caldo LB e crescer subcultura durante 2 h a 37 ° C no dia do experimento.</li>
	<li>Colheita das culturas por centrifugação a 1.700 x g durante 5 min. Ressuspender as bactérias aglomerados em DPBS (de Dulbecco Phosphate-Buffered salina). Determinar a densidade óptica (OD) das culturas bacterianas em OD 600 nm e calcular as concentrações bacterianas. As concentrações bacterianas foram ajustadas para 109/mL.</li>
</ol>3. alimentação forçada de g. mellonella larvas com suspensões bacterianas
<ol><li>Força cada larva com 10 µ l da suspensão bacteriana ajustada contendo 107 bactérias por dose. Use uma seringa de insulina com uma agulha sem corte-terminado para aplicação oral da suspensão bacteriana.<ol>
<li>Fixar a seringa sobre uma microsseringa bomba (Figura 1) para garantir a exatidão do volume suspensão aplicada a cada larva (ver Tabela de materiais). Insira a seringa cuidadosamente entre suas mandíbulas. Não force a seringa entre as mandíbulas. Espere que as larvas para abri-lo aparelho bucal e depois inserir a seringa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube as larvas à força no escuro a 37 ° C entre larvas de uso DPBS-administrado 1-24 h. como controles de fundo falso para excluir potenciais respostas de estresse induzidas devido a manipulação das larvas durante a alimentação forçada.</li>
</ol>4. processamento de administração oral de larvas e isolamento de RNA
<ol><li>Trabalhar sob um capuz e óculos de segurança. Limpe o reagente de capuz e spray para impedir a contaminação de RNase.<ol>
<li>Snap-congelar as larvas vivas após incubação em nitrogênio líquido e homogeneizá-los. Use um almofariz e pistilo para homogeneização. Adicione nitrogênio líquido para a argamassa e grade cada indivíduo larval até homogenates em pó são produzidos.</li>
		<li>Despeje o homogeneizado para uma descartável pesando barco e esperar que o nitrogênio líquido evapore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misture o líquido livre de nitrogênio congelado homogenates em pó com 1 mL de Trizol em um tubo de 2 mL e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Centrifugue a mistura a 8.000 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um tubo de fresco e descartar a pelota. Misture o sobrenadante com 200 µ l de 1-Bromo-3-cloropropano (BCP). Vórtex e incubar a mistura durante 5 min à temperatura ambiente e por 10 min no gelo.</li>
	<li>Centrifugar as reações BCP-adicionado a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Camada superior transparente de transferência para um novo tubo de 2 mL e descartar o resto. Precipitar o RNA da camada superior transferido com 500 µ l de isopropanol misturando e inversão do tubo por 5 min.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Lave a pelota do RNA precipitada com 500 µ l de etanol a 75%.</li>
	<li>Secar a pelota do RNA durante 5-10 min à RT Tome cuidado para não secá-la pois será difícil de dissolver-se mais tarde.</li>
	<li>Diluir o inibidor do ribonuclease (1: 100) em água livre de nuclease e usar 100 µ l da solução para Ressuspender o RNA secas. Vórtice o tubo cuidadosamente até a pelota é completamente dissolvida.</li>
	<li>Medida do RNA qualitativo e quantitativo. Certifique-se de que a relação de 260/280 é aproximadamente 2.0 e 260/230 relação no intervalo de 2.0-2.2 (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Use 5 µ g de RNA isolado para a digestão de DNase. Mix 5 µ l de 10x buffer, 1 µ l da enzima de inibidor do ribonuclease, 2 µ l da enzima DNase, 5 µ g de RNA e encher-se com nuclease-livre de água até 50 µ l. Incubar durante 30 min à RT<ol>
<li>Adicione 6 µ l de reagente de inactivação e incubar por 2 min em reação de RT e vórtice ocasionalmente. Centrifugue a reação a 10.000 x g por 1 min. transferência sobrenadante no tubo fresco 1,5 mL. Nota: O RNA contém o RNA larval, bem como o RNA bacteriano da respectiva estirpe usada para administração oral.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. quantificação do número de cópias a bacteriano 16S após a alimentação forçada
Nota: O número de cópias do expresso 16S bacteriano foi determinado usando cDNA sintetizado a partir do RNA extraído na seção 4. Quantificação final é calculada com a ajuda de uma curva padrão do plasmídeo em que o fragmento PCR 16S de b. vulgatus ou Escherichia coli foi clonado.
<ol><li>Elaboração de normas de plasmídeo<ol>
<li>Amplifica fragmentos 16S de Escherichia coli mpk ou b. vulgatus mpk genomic DNA por PCR. Mix 10 µ l de 5 x tampão, 1 µ l de solução de 10 mM dNTP, 2,5 µ l de primer para a frente de 10 µM e 2.5 µ l da diluição do reverso da primeira demão de 10 µM, 1 µ l de DMSO, 1 µ l do modelo de DNA genômico, 31,5 µ l de água livre de nuclease e 0,5 µ l da enzima prova de leitura.</li>
		<li>Executar o PCR (desnaturação inicial: 98 ° C por 30 s, desnaturação: 98 ° C por 10 s, recozendo: 60 ° C durante 30 anos, extensão: 72 ° C por 30 s, extensão final: 72 ° C por 5 min, repetir a desnaturação, recozimento e extensão para 30 ciclos).<ol>
<li>Use 16S Escherichia coli Cartilhas (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) ou iniciadores de b. vulgatus 16S (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) para amplificação.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use os fragmentos PCR e. coli e b. vulgatus 16S para sem corte-extremidade clonagem em um vetor de clonagem. Configurar a ligadura e misture 10 µ l de 2 x tampão, 1 µ l de produto PCR não-purificada, 1 µ l de plasmídeo de clonagem sem corte-extremidade, 7 µ l de água livre de nuclease e 1 μL de T4 DNA Ligase. Incubar a ligadura durante 10 minutos a RT</li>
		<li>Prepare as células competentes de Escherichia coli DH5α.<ol>
<li>Semear em 100 mL de meio LB em um Erlenmeyer com 1 mL de uma cultura durante a noite. Cresce a cultura até OD 600 nm é entre 0,4-0,6. Dividir a cultura resultante em dois tubos de 50 mL e incubar as culturas no gelo por 10 min.</li>
			<li>Centrifugar as culturas a 1.700 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender cada cuidadosamente com 5 mL de solução RFI (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50mm MnCl2, ajustar pH 5,8 com ácido glacial, estéril filtrada). Encha cada tubo com adicional 45 mL de solução RFI.</li>
			<li>Centrifugar as culturas a 1.700 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender cada cuidadosamente com 6 mL de RFII (MOPS de 10 mM, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% de glicerol, autoclavado) solução. Ambas as fracções do pool e incube a suspensão de 12 mL no gelo por 15 min. Prepare alíquotas de suspensão de células (200 µ l). Armazenar as alíquotas a-80 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transferir a reação da ligadura para uma alíquota de competentes de Escherichia coli DH5α células e deixar a reação no gelo por 15 min. calor choque as células para 45 s a 42 ° C e adicionar 1 mL de meio LB.<ol>
<li>Incubar a transformação por 45 min a 37 ° C. Adicione 100 µ l da transformação para uma placa de ágar LB contendo ampicilina e incubar durante uma noite a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Execute colônia PCR de 8 transformants resultantes da placa de ágar LB de passo 5.1.5. Escolher cada colônia com um palito, mergulhe-o em um prato LB fresco contendo ampicilina (prato principal) e depois mergulhe o palito mesmo um bem contendo µ 5,5 l de água livre de nuclease em uma faixa PCR.<ol>
<li>Adicione 7,5 µ l do mix de x PCR 2, 0,5 µ l de primer para a frente de 10 µM e 0,5 µ l da diluição de primer reverso 10 µM. Use os mesmos pares da primeira demão, mencionados na seção 5.1.1.</li>
			<li>Executar o PCR (desnaturação inicial: 95 ° C por 5 min, desnaturação: 95 ° C por 1 min, recozimento: 60 ° C durante 30 anos, extensão: 72 ° C por 1 min, extensão final: 72 ° C por 7 min, repetição da desnaturação, recozimento e extensão para 35 ciclos).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verifique se o tamanho dos fragmentos em um gel de agarose 1% 16S. Use o tampão de Tris-borato-EDTA (TBE) x 0,5 para dissolver 1 g de agarose e fervê-lo em um microondas. Adicione corante 1:50,000 para gel e derramá-lo. Adicionar as reações de PCR de colônia e uma escada de DNA bp 100 para o gel e execute o gel por 45 min em 110 V.</li>
		<li>Inocule uma cultura durante a noite de 5ml LB contendo ampicilina com um clone da placa de mestre (secção 5.1.6) para cada e. coli e b. vulgatus 16S de plasmídeo que contém o tamanho certo de inserir.<ol>
<li>Centrifugar as culturas bacterianas durante a noite em um tubo de 2 mL a 1.700 x g. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em água estéril de 600 µ l.</li>
			<li>Adicione 100 µ l de tampão de Lise e homogeneizar por inversão do tubo 6 vezes. Adicione 350 µ l de frio (4° C) solução de neutralização e homogeneizar cuidadosamente por inversão do tubo.</li>
			<li>Centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para 3 min. Transfira o sobrenadante (~ 900 µ l) para uma coluna de rotação e centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para 15 s.</li>
			<li>Descartar o flowthrough e adicionar 200 µ l de lavagem de remoção de endotoxinas e centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para 15 s.</li>
			<li>Adicione 400 µ l da solução de lavagem para a coluna e centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para transferência de s. 30 a coluna para um tubo limpo 1,5 mL, adicionar 30 µ l de tampão de eluição para a coluna incube durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Centrifugar a velocidade máxima em uma centrífuga para 30 s (consulte a Tabela de materiais).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determine a concentração de DNA de plasmídeo misturando 1 µ l de plasmídeo com 199 µ l da solução de trabalho (1 µ l de tintura fluorescente por 199 µ l de buffer para cada reação). Prepare dois padrões misturando-se 10 µ l de padrão 1 ou 10 µ l de padrão 2 com 190 µ l. Vortex a amostra e tubos padrão e incubar a reação de 2 min. medida da concentração (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Preparar padrão concentrações em diluições em série 10 vezes em um intervalo de 10-100.000 cópias: cálculo da massa do único plasmídeo (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = tamanho do plasmídeo, m = massa). Calcular a massa de Plasmideo DNA necessário para conter o número de cópias desejado de interesse (copiar número de interesse x massa do plasmídeo único = massa de Plasmideo DNA necessária).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação das amostras para quantificação<ol>
<li>Sintetiza o cDNA. Misture 2 µ l de tampão de 7x, 1 µ l de RNA DNase-digerido da seção 4 e 11 µ l de água livre de nuclease. Incubar durante 2 min a 42 ° C.<ol>
<li>Ocorrer reação imediatamente no gelo. Mix 4 µ l de 5x Buffer RT, 1 µ l do mix de cartilha RT (Transcriptase reversa), 1 µ l da enzima RT e a reação da etapa 5.2.1. Incube por 15 min a 42 ° C. Incube durante 3 min a 95° C para inativar a enzima RT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quantificar o cDNA concentrações fluorometrically como descrito na etapa 5.1.9.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição da carga bacteriana<ol>
<li>Ajustar as concentrações de cDNA para 5 ng por reação de 12 µ l para PCR quantitativo. Misture a mistura de RT-PCR 2 x, 0,25 µ l de primer para a frente de 100 µM, 0,25 µ l de primer reverso de 100 µM (5.1.1) e 12 µ l do cDNA ajustado. Executar qPCR (desnaturação inicial: 95 ° C por 5 min, desnaturação: 95 ° C por 10 s, recozimento: 60 ° C por 30 s, repetição de desnaturação e recozimento para 35 ciclos, derretendo: 95 ° C, cool até 4 ° C).</li>
		<li>Trace log10 concentrações plasmídeo da curva de calibração (10-100.000 cópias), ou seja, 1-5 (eixo x), contra os correspondentes valores de ct (eixo y). Realize a regressão linear para obter a equação de regressão. Resolva a equação para x (concentração). Use a fórmula para calcular o log10 dos números de cópia inserindo a fórmula ct-valor. Calcule o Antilogaritmo para obter o número de cópias.</li>
	</ol></li>
</ol>6. determinação do gene marcador imune inata usando RT-PCR quantitativo
<ol><li>Verifique primers para o gene-especificidade por PCR e subsequente agarose gel de electroforese para verificar o tamanho do fragmento correto. Realize o PCR como descrito na seção 5.1.5. Bp Ubiquitin 130: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC da frente, reverse CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (limpeza) 4-Nox 159 bp: encaminhar TGGCACGGCATCAGTTATCA, reverso ACAGCGACTGTCATGTGGAA8 N º s 76 bp: encaminhar ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, reverso GCCATTTTACAATCGCCACAA8 Bp Gst 156: encaminhar GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, reverso TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8 ApoIII 265 bp: encaminhar AGACTTGCACGCCATCAAGA, reverso TGCATGCTGTTTGTCACTGC8 hemolin 267 bp: encaminhar CTCCCTCACGGAGGACAAAC, reverso GCCACGCACATGTATTCACC8 gallerimycin 161 bp: encaminhar GAAGTCTACAGAATCACACGA, reverso ATCGAAGACATTGACATCCA8 bp Cecropina 158: encaminhar CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, reverso GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8 gloverin 101 bp: encaminhar GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, reverso CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8 bp moricin 124: encaminhar GCTGTACTCGCTGCACTGAT, reverso TGGCGATCATTGCCCTCTTT8)</li>
	<li>Avaliar a eficiência da primeira demão para ser E = 2.<ol>
<li>Piscina 2 µ l de 5-10 amostras positivas diferentes (ou seja, os exemplos que estão expressando o gene para o qual o par de primer precisa ser investigado).</li>
		<li>Preparar uma série de diluição de 1:5 do grupo de amostra: 1 padrão (S1): sem diluir a piscina; S2:, 2 µ l de S1 + 8 µ l água nuclease-livre; S3:, 2 µ l de S2 + 8 µ l água nuclease-livre; S4: 2 µ l de S3 + água de nuclease livre 8 µ l.</li>
		<li>Aplica 1 µ l de S1-S4 e um controle de não-modelo (água livre de nuclease) para uma placa de 96 poços qPCR. Adicione 5 µ l de mistura de mestre RT, 0,1 µ l de cada 100 µM para diante e reverso da primeira demão, 3,7 µ l de água livre de nuclease e 0,1 µ l do mix de RT por bem.</li>
		<li>Executar a RT-PCR quantitativo (reverso transcrição: 50 ° C por 10 min, desnaturação inicial: 95 ° C por 5 min, desnaturação: 95 ° C por 10 s, recozimento: 60 ° C por 30 s, repetição de desnaturação e recozimento para 40 ciclos, derretendo: 95 ° C, cool até 4 ° C).</li>
		<li>Trama do log10 de unidades relativas para S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0.008) (eixo x) contra os correspondentes valores de ct (eixo y). Realize a regressão linear e determinar a inclinação da curva padrão. Calcule a eficiência e: E = 10-(1/slope). 20 Nota: Uma inclinação de-3.32 indica condições de reação ideal e eficiência da primeira demão de E = 2,00. Isto significa: a quantidade de produto do PCR dobra durante cada ciclo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uso 100 ng do RNA digerido (100 ng / µ l) como um modelo para o RT-PCR. Reagentes Mix RT-PCR e execução RT-PCR, como referido no ponto 6.2. Medir todas as amostras de bactérias-DPBS-administrados e com limpeza par de primer e pares da primeira demão de alvo. Sempre executar as diluições de S1-S4 com o par de primer faxina e S1-S4 com o par de primer de destino no mesmo prato para determinação de eficiência.</li>
	<li>Calcule a relação (R) da expressão do gene do RNA de acordo com a fórmula a seguir usando a eficiência de determinado experimentalmente cartilha de ambos o serviço de limpeza e o par de primer do alvo. Normalizar as bactérias estimulada amostras para zombar de controles20. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59270/59270eq1.jpg"> R: relação Edestino: eficiência de S1-4 medido com par de primer alvo Elimpeza: eficiência de S1-4 medido com par de primer faxina ΔCt-alvo(controle-amostra): Δct (CT da amostra DPBS-alimentados)-(ct da amostra de bactérias-alimentados) medido com par de primer alvo ΔCtlimpezacontrole (amostra): Δct (CT da amostra DPBS-alimentados)-(ct da amostra de bactérias-alimentados) medido com par de primer faxina</li>
</ol>

<ol><li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li>
<li>Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+antimicrobial+peptides+during+homeostasis%2C+infection%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease.</a> Frontiers in Immunology. 3, 310(2012).</li>
<li>Ivanov, I. I., Honda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commensal+microbes+as+immune+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal commensal microbes as immune modulators.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).</li>
<li>Ayres, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome-microbiota+interplay+in+host+physiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).</li>
<li>Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+G.+mellonella+Larvae+to+Provide+Reliable+and+Reproducible+Results+in+the+Study+of+Fungal+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens.</a> Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).</li>
<li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. , (2016).</li>
<li>Buchmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Innate+Immunity%3A+Clues+from+Invertebrates+via+Fish+to+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals.</a> Frontiers in Immunology. 5, 459(2014).</li>
<li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella%3A+A+Novel+Invertebrate+Model+to+Distinguish+Intestinal+Symbionts+From+Pathobionts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts.</a> Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).</li>
<li>Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. , 1-16 (2016).</li>
<li>Bolouri Moghaddam, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+the+Galleria+mellonella+innate+immune+system+is+maximized+by+the+co-presentation+of+diverse+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides.</a> Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).</li>
<li>Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Signaling+and+Antimicrobial+Peptide+Expression+in+Lepidoptera%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera.</a> Insects. 4 (3), 320-338 (2013).</li>
<li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+as+a+model+system+for+studying+Listeria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).</li>
<li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunological+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).</li>
<li>Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Galleria+mellonella+caterpillar+as+a+model+host+to+study+the+role+of+the+type+III+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).</li>
<li>Waidmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteroides+vulgatus+protects+against+Escherichia+coli-induced+colitis+in+gnotobiotic+interleukin-2-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice.</a> Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).</li>
<li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Mobilome-Driven+Genome+Diversification+in+Mouse+Gut-Associated+Bacteroides+vulgatus+mpk%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).</li>
<li>Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut+Microbiotassay%3A+a+high-throughput+qPCR+approach+combinable+with+next+generation+sequencing+to+study+gut+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity.</a> BMC Genomics. 14, 788(2013).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OmpA+variants+affecting+the+adherence+of+ulcerative+colitis-derived+Bacteroides+vulgatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+and+Dental+Science%22%5BJournal%5D)">OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus.</a> Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).</li>
<li>Freitak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+transfer+of+bacteria+can+mediate+trans-generational+immune+priming+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects.</a> Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).</li>
<li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).</li>
<li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O modelo de g. mellonella é um modelo frequentemente usado para avaliar os fatores de virulência bacteriana em uma abordagem de infecção sistêmica21. Desde que muitos patógenos e bactérias entrarem o hospedeiro através da rota de colonização ou infecção oral, novos insights precisam ser encontrado para avaliar mellonella g. como um modelo para a colonização oral e infecção.
A possibilidade de traseira mellonella g. entre 15 e 37 ° C é uma gran...

A microbiome intestinal é um componente essencial para a manutenção da homeostase e envolve ambas as respostas de imune inata e adaptativa1,2. A Comunidade microbiota comensal é caracterizada por diferentes componentes principais de comensais: simbiontes que conferem efeitos benéficos por funções immunomodulatory importante e pathobionts que pode ter efeitos prejudiciais geneticamente predispostos hospeda e promover e provocar inflamação intestinal3,4. Muitos estudos sobre simbiontes e pathobionts e sua influência sobre o sistema imunológico do hospedeiro têm sido publicados principalmente estudar respostas imunes adaptáveis.
Uma vez que estes estudos envolvem muitos animais para as investigações e a proteção e a substituição dos animais utilizados para experimentação é de aumentar o interesse público, buscamos encontrar um modelo de substituição para permitir a exibição de diferentes bactérias imunogênicas Propriedades. Insetos, especialmente Galleria mellonella, são um modelo de substituição amplamente utilizado na investigação de infecção. G. mellonella combina diferentes vantagens como baixo custo e alto rendimento; Ele permite que a administração oral de bactérias, que é a rota de exposição natural, e permite a infecção sistêmica5,6. G. mellonella mais permite a incubação a 37 ° C, qual é a temperatura do corpo fisiológico de mamíferos e o ideal para o factor de virulência bacteriana expressão5. A principal vantagem do mellonella g. é conservado sistema imunitário inato que permite a discriminação do self da não-auto e codifica uma variedade de receptores de reconhecimento padrão como apolipophorin ou o opsoninas hemolin6, 7. sobre reconhecimento de micróbio, g. mellonella pode desencadear respostas diferentes a jusante imune humorais. Pode induzir respostas de estresse oxidativo e secretam espécies reativas de oxigênio (ROS), que envolve a atividade de n º s (oxidase nítrico sintase) e NOX (oxidase de NADPH)6,8. Além disso, g. mellonella ativa uma resposta potente peptídeo antimicrobiano (AMP), que resulta na secreção de uma mistura de AMPs diferentes tais como gloverin, moricin, Cecropina ou o defensina-como gallerimycin6, 8,9,10. Geralmente, amplificadores têm bastante amplo acolhimento especificidade contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas e fungos e tem que dar uma resposta potente, desde que os insetos estão faltando qualquer resposta adaptativa10. Gloverin é um amplificador ativo contra bactérias e fungos e inibe a formação de membrana exterior6,11. Moricins exibem sua função antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas por penetrar a membrana e formando um poro9,11. Cecropins fornecer atividade contra bactérias e fungos e permeabilize a membrana da mesma forma como moricins9,10. Gallerimycin é um peptídeo de defensina-como com propriedades anti-fúngicos9. Curiosamente, verificou-se que a combinação de Cecropina e gallerimycin tinha uma atividade sinérgica contra e. coli10.
Devido ao seu caráter de easy-to-use mellonella g. as larvas são um modelo de infecção frequentemente usados para avaliar a patogenicidade bacteriana. Em particular, estudos em que dados obtidos de g. mellonella correlacionam com dados obtidos de ratos apoio a força deste modelo hospedeiro alternativo. Verificou-se que os serótipos mais patogênicos de Listeria monocytogenes em um modelo de infecção do rato também conduzem a maiores taxas de mortalidade em g. mellonella após infecção sistêmica. Além disso, menos serotipos virulentos acabou por ser também menos virulentos no modelo mellonella g. 12. Observações semelhantes foram feitas com os fungos patogênicos humanos Candida albicans. Virulência de c. albicans de diferentes estirpes tenha sido avaliada por infecção sistêmica e posterior acompanhamento de sobrevivência larval. Cepas avirulentas mouse também foram expostas ou avirulentas reduzida virulência em g. mellonella, Considerando que as estirpes virulentas rato conduzem também a alta mortalidade larval13. O modelo de g. mellonella mais poderia ser usado para identificar fatores de patogenicidade de sistema tipo 3 secreção de Pseudomonas aeruginosa14.
Desde que a maioria das investigações que envolvem mellonella g. concentraram-se em fatores de virulência usando a abordagem de infecção sistêmica estávamos especialmente interessados em fornecer um método adequado para a análise dos comensais intestinais em uma alimentação oral forçada modelo em que podemos aplicar uma dosagem distinta de bactérias por larvas e não apenas observar a taxa de mortalidade larval mas analisar diferentes marcas da inatas respostas imunes para manter a homeostase intestinal.
Nosso método ajuda a aumentar o uso de g. mellonella como um modelo de substituição, desde que combinamos a aplicação de bactérias e a análise da expressão do RNA. Não só é útil reforçar o significado dos estudos de patogênese bacteriana quando incluindo a análise das respostas imunes após administração oral e não apenas a observação das taxas de mortalidade após infecção sistêmica. Nossos métodos permite que para a análise das propriedades imunogênicas de bactérias não-patogênicas comensais desde que é fornece condições mais complexas do que a cultura celular, oferecendo uma barreira intestinal em um organismo vivo.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA ladder&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>1-Bromo-3-Cloropropano (BCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>2x Mangomix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25033</td><td>Colony PCR Tubos</td></tr><tr>de<td>50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210 261</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Cera</td> <td>de abelha Mixed-Store.de-Caldo de</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>infusão de coração cerebral</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>CloneJET PCR Cloning Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1232</td><td>Vetor de clonagem para fragmentos 16S</td></tr><tr><td>Grãos de milho</td><td>Osterm&uuml; hle Naturkost GmbH</td><td>306</td><td>Cultivo orgânico</td></tr><tr><td>Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD</td><td></td></tr><tr><td>Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Becton Dickinson</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Kit de remoção de DNA sem DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>244510</td><td>&nbsp; Digestão de Dnase</td></tr><tr><td>Levedura seca</td><td>Rapunzel</td> <td>-</td><td>Cultivo orgânico</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W252506</td><td></td></tr><tr><td>Honey</td><td>Osterm&uuml; hle Naturkost GmbH</td><td>487</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>VWR</td><td>20842.330</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 Instrumento II</td><td>Roche Molecular Systems</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, branco</td><td>Roche Molecular Systems</td><td>4729692001</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Microsseringa Manual com Display Digital</td><td>World Precision Instruments</td><td>DMP</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine+ Seringa de insulina U-100 0,3 x 8 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>324826</td><td>Argamassa de administração oral</td></tr><tr><td>, não esmaltada</td><td>VWR</td><td>410-9327&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease&nbsp;</td><td>Sachês Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>Oxoid AnaeroGen&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AN0025A</td><td>Qualidade e quantidade de</td></tr><tr><td>listras de RNA PCR</td><td>Biozym</td><td>710970</td><td></td></tr><tr><td>Pilão, superfície de moagem não esmaltada</td><td>VWR</td><td>410-9324&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de revisão de phusion</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F553S</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Biomers</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Minipreparação de Plasmídeo PureYield</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFast SYBR Green PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>204056</td><td>qPCR para medição do número de cópias bacterianas</td></tr><tr><td>QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>204156</td><td>qRT-PCR para medições de expressão gênica</td></tr><tr><td>Kit de Transcrição Reversa QuantiTect&nbsp;</td>Tubos <td>de Ensaio Qubit de Síntese de</td><td>cDNA</td> <td>Qiagen</td> 205311</tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsHS DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Quantificação de amostras de plasmídeo e cDNA</td></tr><tr><td>Fluorômetro</td><td>Qubit Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td>Quantificação de amostras de plasmídeo e cDNA</td></tr><tr><td>RNase-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7153</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin Ribonuclease Inibidor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Sucofin</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de Gel DNA segura SYBR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>TRI reagente&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Barco de pesagem</td><td>VWR</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr><td>Farinha de trigo</td><td>Osterm&uuml; hle Naturkost GmbH</td><td>6462</td><td>Cultivo orgânico</td></tr></tbody></table>

um modelo de administração oral galleria mellonella para respostas imunes study commensal-induced inata

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A investigação do potencial imunogênico de bactérias comensais sobre o sistema imunológico do hospedeiro é um componente essencial ao estudar interações do anfitrião-micróbio intestinal. Está bem estabelecido que os comensais diferentes apresentam um potencial diferente para estimular o sistema imunitário intestinal do hospedeiro. Tais investigações envolvem animais vertebrados, especialmente roedores. Que crescentes preocupações éticas estão relacionadas com a realização de experiências com vertebrados, existe uma alta demanda por modelos de invertebrados substituições.
Aqui, nós fornecemos um modelo de administração oral de Galleria mellonella usando bactérias não-patogênicas são comensais e a possível avaliação do potencial imunogênico de comensais no sistema imunitário mellonella g. . Demonstramos que mellonella g. é um modelo de substituição de invertebrados alternativa útil que permite a análise dos comensais com potencial imunogênico diferente tais como Bacteroides vulgatus e Escherichia coli. Curiosamente, as bactérias não exibiram nenhum efeito sobre as larvas, que é semelhante para os mamíferos. As respostas imunes de g. mellonella eram comparáveis com respostas de imunes inatas vertebradas e envolvem a produção de moléculas antimicrobianas e reconhecimento das bactérias. Propomos que mellonella g. foi capaz de restaurar o equilíbrio anterior de microbiota, que é bem conhecido de indivíduos saudáveis de mamíferos. Apesar de fornecer respostas de imune inatas comparáveis em vertebrados e mellonella g. , g. mellonella não abriga um sistema imune adaptativo. Desde que os investigados componentes do sistema imunitário inato são evolutivos conservada, o modelo permite uma análise prescreening e primeira de propriedades imunogênicas bacterianas.

O modelo de infecção de hemolinfa mellonella g. em amplamente utilizado para analisar os fatores de virulência de uma enorme variedade de agentes patogénicos. A maioria das medições incluem a análise da mortalidade de larvas, que é um método muito fácil. No entanto, esse método não permitem conclusões sobre respostas imunes em geral e vincular os resultados das respostas imunes de g. mellonella com vertebrados mecanismos imunes. O modelo de administração oral mellone...

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de administração oral usando Galleria mellonella larvas e como caracterizar induzido inatas respostas imunes. Usando este protocolo, será capazes de usar a alimentação forçada método mellonella g. pesquisadores sem experiência prática.

Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Nosso protocolo expande o uso de G.mellonella de um modelo de infecção sistêmica para um modelo que permite a administração bacteriana através da rota oral natural. G.mellonella é um modelo de substituição adequado para roedores na análise de diferentes marcas de interações inatas de micro-pós, pois as larvas podem ser usadas para bactérias patogênicas humanas. Comece transferindo os ovos colocados por mariposas adultas para duas caixas de litro contendo substrato de mariposa de cera, a 30 graus Celsius, no escuro.Após uma a duas semanas, transfira 25 gramas de larva contendo substrato em substrato fresco, quando pequenas e pequenas larvas se tornarem visíveis. Sincronizar as larvas após duas semanas de acordo com seu tamanho, em grupos de 30 a 40 larvas em novos recipientes de dois litros no substrato de mariposa de cera. Depois de duas semanas, selecione larvas para o experimento em peso.Usando apenas larvas pálidas e rápidas com uma massa de 180 a 200 miligramas. Para forçar a alimentação das larvas, carregue uma seringa de insulina com uma agulha sem corte para aplicação oral, com uma vezes 10 a sétima bactéria por 10 microliters de DPBS por larva. Coloque a seringa em uma bomba de micro-seringa.Aguarde que uma larva abra suas partes da boca antes de inserir a seringa cuidadosamente entre as mandíbulas e entregar as bactérias. Quando toda a larva for alimentada, incubar os animais no escuro a 37 graus Celsius, entre uma e 24 horas. Para o processamento de larvas, limpe uma capa de segurança com etanol e reagente de spray para evitar a contaminação da RNase.Esto jato congele a larva viva em nitrogênio líquido. Homogeneize cada larva congelada individual usando uma argamassa e pilão e um pequeno volume de nitrogênio líquido. Quando um homogeneato em pó tiver sido produzido, transfira o homogeneado para um barco de espera descartável e espere que o nitrogênio líquido evapore.Quando toda a larva tiver sido homogeneizada, misture os homogeneizados em pó com um mililitro de TRIzol em um tubo de dois mililitros. Incubar a mistura em temperatura ambiente por uma hora. No final da incubação, pelota o homogeneizar por centrifugação.Transfira o supernatante para um novo tubo. Misture o supernatante com 200 microlitres de 1-Bromo-3-cloropropano, ou BCP. Vórtice e incubação por cinco minutos em temperatura ambiente, seguido de uma incubação de 10 minutos no gelo.No final da segunda incubação, centrífuga a reação adicionada bcp e transferir a camada superior transparente para um novo tubo de dois mililitros. Precipitar o RNA da camada superior transferida com 500 microliters de isopropanol misturando e invertendo o tubo por cinco minutos. Em seguida, colete o RNA precipitado por centrifugação.Lave a pelota de RNA precipitada com 500 microlitadores de 75% de etanol e seque o RNA por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Quando o etanol evaporar, adicione 100 microliters de inibidor de ribonuclease em água sem nuclease à pelota seca de RNA, e cuidadosamente vórtice do tubo até que a pelota seja completamente dissolvida. Meça a qualidade e a quantidade do RNA por protocolos padrão, garantindo que a proporção de 260 a 280 seja aproximadamente duas, e a razão de 260 a 230 esteja na faixa de dois a 2,2.Em seguida, use cinco microgramas do RNA isolado para digestão DNase e análise de expressão genética, de acordo com protocolos padrão. G.mellonella é capaz de limpar a força inicial alimentada com carga bacteriana até que nenhuma bactéria seja detectável. Com o número de cópias genéticas de 16s de B.vulgatus e E.coli diminuiu substancialmente em 24 horas.A Commensal administrou uma larva g.mellonella induzir a expressão genética do RNA de vários genes marcadores de imunidade inata. Por exemplo, as moléculas de reconhecimento de LPS, apolipophorina e hemolina são geralmente expressas mais altamente nas larvas administradas por E.coli em comparação com larvas administradas por B.vulgatus. Além disso, a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio são fortemente reguladas sobre a alimentação da força de E.coli em comparação com b.vulgatus, bem como a expressão genética antioxidativa GST.Além disso, a expressão diferencial de peptídeo microbiano é induzida mais fortemente após a administração de E.coli do que em resposta à alimentação da força b.vulgatus. Lembre-se de usar apenas larvas saudáveis, brancas, em movimento rápido, para usar a paciência durante a alimentação forçada para evitar estressar as larvas e incluir todos os controles necessários. A ativação dos marcadores imunológicos G.mellonella pode ser determinada diretamente por ensaios de atividade RUS ou GST e a abundância de ANPs pode ser determinada por ensaios de inibição de crescimento bacteriano.Esta técnica pode ser usada como uma ferramenta de triagem para bactérias commensais e patogênicas e para explorar simbiomas e pathobiomas intestinais sem sacrifício de muitos vertebrados. Use sempre os equipamentos de proteção individual adequados ao trabalhar com substâncias de nitrogênio líquido, BCP ou TRIzol.

a-galleria-mellonella-oral-administration-model-to-study-commensal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Oral e intra infecção haemocolic de larvas de traça da...

O inseto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um modelo de infecção poderosa para investigar Patogênese Bacteriana

A larva da cera traça Galleria mellonella foi recentemente estabelecido como um modelo in vivo para estudar a infecção Legionella pneumophila. Aqui, nós demonstramos técnicas fundamentais para caracterizar a patogênese da Legionella nas larvas, incluindo a inoculação, a medida da virulência bacteriana e replicação, bem como extração e análise de hemócitos infectados.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Galleria mellonella serve como um modelo de invertebrados para candidíase disseminada. Aqui, detalhamos a infecção do protocolo e fornecer dados de apoio para a eficácia do modelo.

O modelo de infecção Waxworm Galleria mellonella para candidíase disseminada

A Galleria mellonella foi recentemente estabelecida como um modelo de infecção reprodutível, barato e eticamente aceitável para o complexo Mycobacterium tuberculosis . Aqui nós descrevemos e demonstramos as etapas tomadas para estabelecer a infecção bem sucedida de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG .

Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

Este estudo apresenta uma estrutura padronizada para otimizar os modelos de infecção por G. mellonella para uso na avaliação antimicrobiana pré-clínica. A aplicação de um modelo de G. mellonella como parte de um pipeline de desenvolvimento antimicrobiano pré-clínico pode diminuir o número de compostos ineficazes que progridem para ensaios clínicos.

Galleria mellonella como modelo de triagem antimicrobiana

O vírus sincicial respiratório humano (HRSV) pode causar bronquiolite grave em lactentes pequenos. Parte da patogênese da doença grave por HRSV é causada pela resposta imune do hospedeiro. A estimulação de células imunes humanas primárias com HRSV fornece um sistema modelo rápido e reprodutível para estudar a ativação de vias inflamatórias e infecções.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração e imagem de uma infecção bacteriana localizada na vesícula ótica do peixe-zebra.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

A estimulação do nervo vago provou ter uma forte eficácia na diminuição da inflamação periférica. Aqui, apresentamos um protocolo de estimulação do nervo vago modificado que permite exames adicionais dos mecanismos anti-inflamatórios colinérgicos em respostas inflamatórias limitadas.

Aumento do tempo de recuperação e diminuição da Administração LPS para estudar o nervo vago Estimulação Mecanismos em respostas inflamatórias Limitada

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Aprenda a administrar bactérias por via oral em larvas de Galleria mellonella para estudar respostas imunes inatas. Este protocolo acessível substitui roedores em pesquisas imunológicas.

Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

Explorar mais vídeos