Name: Isolamento, propagação e expressão de proteína príon durante a diferenciação Neuronal de células-tronco humanas polpa Dental (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprenda a isolar e propagar células-tronco de polpa dental humana com eficiência de 90%, avaliando a expressão da proteína príon durante a diferenciação neuronal para aplicações em medicina regenerativa.

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Este trabalho foi apoiado pela "Fondazione Varrone" e Universidade de Rieti Hub "Sabina Universitas" de Vincenzo Mattei.
Figura 5 (A, B) reimpresso com permissão da editora Taylor & Francis Ltd de: complexo multimolecular de papel de príon proteína EGFR durante a diferenciação neuronal de dentais derivado de celulose células estaminais humanas. Martellucci, S., V. de Manganelli, Santacroce C. F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei prião. 4 de março de 2018. Taylor & Francis Ltd.

Terceiros molares utilizados no estudo foram extirpados de pacientes (13-19 anos de idade) com nenhuma história prévia de consumo de álcool ou de drogas, todos os não-fumantes e com adequada higiene oral. No dia da explicação, no departamento de ciência Odontologia e -maxilo-facial da Universidade de "Sapienza" de Roma, consentimento informado foi obtido os pacientes ou os pais. Consentimento informado foi obtido com base em considerações éticas e aprovação do Comitê de ética.
1. dente e extração de polpa dentária
<ol><li>
Preparação de meio adequado para a conservação ou transporte.
	<ol>
<li>Prepare-se média baixa concentração modificado águia de Dulbecco de glicose (DMEM-L) com L-glutamina (494,5 mL).</li>
		<li>Adicionar 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) e 0,5 mL de anfotericina (0,1%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrair o terceiro molar do paciente, rapidamente enxágue com PBS, colocar em um tubo de ensaio de 15 mL com o meio e transferi-lo para o laboratório em menos de 2 h.</li>
	<li>Sob uma capa de risco biológico, abra o dente com um cortador de passagem de corte coronal paralela e tangente através do telhado da câmara de celulose.</li>
	<li>Delicadamente, retire a polpa com uma escavadeira pequena e coloque-o em um tubo de ensaio.</li>
	<li>Lavagem com PBS três vezes e centrifugar a 2.500 x g durante 10 minutos a RT</li>
</ol>2. processamento da polpa Dental e liberação de células-tronco
<ol><li>Remover o sobrenadante, resuspenda o pellet em solução de Hank e colocá-lo em uma placa de Petri. Incube durante 2 h a 37 ° C em 5% de CO2.</li>
	<li>
Tipo de preparação de solução IV colagenase.
	<ol>
<li>Preparar 0,8 mL de DMEM-L.</li>
		<li>Derreta 1 mg de colagenase de tipo IV em 0,8 mL de DMEM-L e vortex durante vários minutos.</li>
		<li>Adicionar DMEM-L a 1 mL para ter uma concentração final de 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtre a solução com um filtro de 0,22 µM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remover a solução de Hank por centrifugação a 2.500 x g durante 10 minutos a RT e divida a polpa em fatias pequenas de aproximadamente 1 mm cada uma com um bisturi descartável.</li>
	<li>Coloque as fatias de polpa em um prato de petri e incubar com 1 mL de colagenase tipo IV por 15 min a 37 ° C em 5% CO2.</li>
	<li>
Preparação de meio de cultura (500 mL).
	<ol>
<li>A 445 mL de DMEM-L, com L-glutamina.</li>
		<li>Adicione 50 mL de soro Fetal bovino (FBS) (10%).</li>
		<li>Adicione 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 2.500 x g durante 10 minutos a RT, remover o sobrenadante, resuspenda o pellet a médio (etapa 2.5) e cultura T25 balão específico para células-tronco a 37 ° C em 5% CO2.</li>
</ol>3. propagação e cultura de células-tronco
<ol><li>Todos os dias Verifique a cultura e, após 3 dias de crescimento, observar diferentes clones de células aderentes dentro do frasco.</li>
	<li>Cada 3 dias mudar o meio de cultura.</li>
	<li>Entre 7 e 12 dias, uma vez que as células aderentes têm alcance confluência, desanexá-los por tratar as células com 1 mL de EDTA-tripsina por 3 min a 37 ° C ou delicadamente com uma espátula de célula.</li>
	<li>Adicione 4 ml (proporção 1:5) do meio de cultura (etapa 2.5) para parar a ação da tripsina.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos para 6 min a 259 x g, remover o sobrenadante e colocar as células em um frasco T25 para propagar. Nota: Cada 3 dias, as células alcançar confluência.</li>
	<li>Propaga as células até 21 ou 28 dias (aproximadamente 6-8 passagens) para evitar a presença do non-tronco, como as células em cultura.</li>
	<li>Separe as células com 1 mL de tripsina-EDTA para 3 min a 37 ° C ou raspando suavemente. Centrifugar a suspensão de eritrócitos para 6 min a 259 x g.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e testar as células para análise cytofluorimetric (etapa 6).</li>
</ol>4. transiente PrPC silenciar por siRNA
<ol><li>Cultura as placas de 6-poços de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) com 2 mL de meio de cultura (etapa 2.5) por 24 h.</li>
	<li>
No dia seguinte, prepare o suporte de PrP de siRNA (400 µ l).
	<ol>
<li>Para um tubo de ensaio estéril, adicionar µ l 384 DMEM-L.</li>
		<li>Adicionar 1 µ l para cada tipo de siRNA PrP para DMEM-L para ter uma concentração final de 5 nM (4 siRNA PrP foram usados e verificadas pelo fornecedor para garantir um "knockdown" eficiência ≥70%).</li>
		<li>Adicionar 12 µ l de transfectionreagent para DMEM-L.</li>
		<li>A mistura de vórtice e incubar durante 10 minutos a RT para permitir a formação de complexos do transfection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 400 μL de siRNA PrP médio para cada amostra e incubar durante 6 h a 37 ° C.</li>
	<li>Sem descartar siRNA PrP médio, adicione 1,6 mL (proporção de 1 a 5) do meio de cultura (etapa 2.5).</li>
	<li>Deixar as células por 72 h a 37 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e lavar 3 vezes com 2 mL de PBS em RT</li>
	<li>Adicione 2 mL de meio de cultura neuronal por 7 ou 14 dias (etapa 5.1).</li>
	<li>Altere o meio de cultura neuronal em 3 dias. Nota: Substitua o siRNA PrP solução substituir cada tempo o meio de cultura neuronal.</li>
	<li>No final do tempo, lavar 3 vezes com 2 mL de PBS em RT e testar para antígenos de superfície neuronais por análise de Western Blot.</li>
</ol>5. neuronal processo de indução de hDPSCs
<ol><li>
Preparação de meio de cultura neuronal (500 mL).
	<ol>
<li>Prepare 444,7 mL de mídia basal formulada para células neuronais.</li>
		<li>No meio de adicionar 50 mL de suplemento isento de soro usado para apoiar a viabilidade a longo prazo de adultas e embrionárias estaminais células neuronais (10%).</li>
		<li>Adicione 200 µ l de básico fator de crescimento fibroblástico (bFGF) (concentração final 40 ng/mL) e 100 µ l de fator de crescimento epidérmico (EGF) para o meio (concentração final 20 ng/mL).</li>
		<li>Adicionar 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) para o meio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HDPSCs de cultura em placas boas 6 (2 x 105 células/mL) até 28 dias de separação da polpa e estimulá-los com 2 mL de meio de cultura neuronal.</li>
	<li>Cada 3 dias, desprezar o sobrenadante, lavar 3 vezes com 2 mL de PBS em RT e substituir 2 mL do meio de cultura neuronal.</li>
	<li>Depois de 7 ou 14 dias, retire as células com 1 mL de EDTA-tripsina por 3 min a 37 ° C ou delicadamente com uma espátula.</li>
	<li>Adicione 4 mL (proporção 1:5) do meio de cultura (etapa 2.5) para parar a ação da tripsina.</li>
	<li>Testar para a presença de antígenos de superfície neuronais (etapa 6) ou a expressão de proteína príon (passo 7), análise de citometria de fluxo.</li>
</ol>6. caracterização de hDPSCs por citometria de fluxo
<ol><li>Selecione estroma mesenquimal (MSC)-antígenos de superfície específicas ou neuronais.</li>
	<li>Cultura do hDPSCs em placas de 6-poços (2 x 105 células/mL) com 2 mL de meio de cultura (etapa 2.5).</li>
	<li>Desanexe hDPSCs aos 28 dias de separação da polpa dental ou após 14 dias do meio de cultura neuronal (etapa 5.1) com 1 mL de EDTA-tripsina para 3 min a 37 ° C ou suavemente raspador.</li>
	<li>Adicione 4 ml (proporção 1:5) do meio de cultura (etapa 2.5) para parar a ação da tripsina e centrifugate em 259 x g durante 6 min à RT lavar outra 2 vezes com 2 mL de PBS no RT</li>
	<li>Corrigir o hDPSCs não tratada ou tratada com paraformaldeído 4% em PBS durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilize hDPSCS com surfactante não-iônico 0,1% (v/v) em PBS para adicional 10 min a RT</li>
	<li>Executar o bloqueio com leite em pó desnatado 5% em 1 mL de PBS por 1h no RT</li>
	<li>Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS e incube as celulas com anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-β3-tubulina (1: 100 / 5 x 105 células), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 células) e anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 células) mAb por 1h no RT</li>
	<li>Lavar as células 3 vezes com 1 mL de PBS e incubar com PE anti-rato (01:50 / 5 x 105 células) ou anticoelho CY5 mAb (01:50 / 5 x 105 células) por 1h adicional no RT</li>
	<li>Usar os anticorpos secundários para retenção de células immunopositive (anti-rato PE ou anticoelho CY5 mAb) e analisar todas as amostras com um citômetro de fluxo e adquirir pelo menos 20.000 eventos.</li>
</ol>7. avaliação da expressão de PrPC em hDPSCs pela análise de citometria de fluxo
<ol><li>Cultura as placas de 6-poços de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) com 2 mL de meio de cultura (etapa 2.5).</li>
	<li>Desanexar hDPSCs nos dias 21 e 28 de separação da polpa dental e depois de 7 ou 14 dias com meio de cultura neuronal (etapa 5.1) com 1 mL de EDTA-tripsina e parar a ação da tripsina, conforme descrito na etapa 6.4. Corrigir os espécimes com paraformaldeído 4% em PBS durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilize com surfactantin 0,1% (v/v) não-iónicos PBS por 10 min em RT. Remove o sobrenadante e as células com mAb anti-PrP de coelho EP1802Y (01:50 / 5 x 105 células) de mancha mAb por 1h no RT. Incubar com anticoelho CY5 (01:50 / 5 x 105 células) mAb para h 1 adicional no RT</li>
	<li>Analisar todas as amostras com um citômetro de fluxo e adquirir pelo menos 20.000 eventos.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste trabalho, concentrámo-na metodologia para isolamento e diferenciação neuronal de hDPSCs; Além disso, avaliamos o papel do PrPC neste processo. Existem vários métodos para isolar e diferenciar hDPSCs em células neurônio e passos críticos durante o processo. hDPSCs são capazes de se diferenciar em várias linhagens como condroblastos, osteoblastos, adipócitos e neurônios. Nosso papel, investigamos os mecanismos de diferenciação neuronal e a presença de PrPC. Como discutido acima, estas células ex...

Células-tronco mesenquimais foram isoladas de vários tecidos, incluindo a medula óssea, sangue de cordão umbilical, polpa dentária humana, tecido adiposo e sangue1,2,3,4,5 , 6. como relatado por vários autores, hDPSCs mostrar aderência de plástico, uma morfologia típica de fibroblasto tipo. Estes representam uma população altamente heterogênea com clones distintos e diferenças na capacidade proliferativa e diferenciação7,8. hDPSCs express marcadores específicos para células-tronco mesenquimais (ou seja, CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), são negativos para alguns marcadores hematopoiéticas (tais como o CD14 e CD19) e são capazes de diferenciação in vitro de multilineage9, 10,11.
Vários autores têm mostrado que essas células são capazes de se diferenciar em células neurônio usando protocolos diferentes, que incluem a adição de NGF, bFGF, EGF em combinação com o específico mídia e suplementos7,12. Além disso, muitas proteínas estão envolvidas durante o processo de diferenciação neuronal e, entre estes, vários trabalhos mostram um papel relevante e significativa expressão da proteína príon celular PrP (C), ambos em células-tronco adultas e embrionárias13, 14. PrPC representa uma molécula pleiotrópicos capaz de executar diferentes funções no interior das células como metabolismo de cobre, apoptose, e resistência à oxidativo estresse15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
Nosso papel anterior23, investigamos o papel do PrPC no processo de diferenciação neuronal hDPSCs. Na verdade, hDPSCs express precocemente PrPC e, após a diferenciação neuronal, foi possível observar um aumento adicional. Outros autores a hipótese de um possível papel de PrPC em processos de diferenciação neuronal de células-tronco. Com efeito, PrPC dirige a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em neurônios, oligodendrócitos e astrócitos24. O objetivo deste estudo foi enfatizar a metodologia para a obtenção de células-tronco da polpa dentária, seu processo de diferenciação e o papel do PrPC durante a diferenciação neuronal.

<table><tbody><tr><td>Solução de Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>É usado para suplementar o meio de cultura celular, é um antibiótico antifúngico polieno da Tecnologia de</td></tr><tr>Sinalização<td>Celular Anti-B3tubulina</td><td>Streptomyce&nbsp;</td><td>#4466</td><td>Uma das seis isoformas de tubulina B, é altamente expressa durante o desenvolvimento fetal e pós-natal, permanecendo alta no sistema nervoso periférico</td></tr><tr><td>Anti-CD105&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611314</td><td>Endoglin (CD105), uma glicoproteína principal do endotélio vascular humano, é uma proteína de membrana integral tipo I com uma grande região extracelular, uma região transmembrana hidrofóbica e uma cauda citoplasmática curta</td></tr><tr><td>Anti-CD44</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>Anticorpos marcadores celulares positivos direcionados contra células-tronco mesenquimais</td></tr><tr><td>Anti-CD73&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>13160</td><td>CD73 é uma glicoproteína de 70 kDa glicosil fosfatidilinositol, ancorada em membrana, que catalisa a hidrólise de monofosfatos de nucleosídeos extracelulares em nucleosídeos bioativos</td></tr><tr><td>Anti-CD90</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>Anticorpos marcadores celulares positivos direcionados contra células-tronco mesenquimais</td></tr><tr><td>Anti-GAP43&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>#8945</td><td>É uma proteína associada ao crescimento específica do sistema nervoso em cones de crescimento e áreas de alta plasticidade</td></tr><tr><td>PE anti-camundongo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>É um anticorpo usado em citometria de fluxo ou análise FACS</td></tr><tr><td>Anti-NFH&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>#2836</td><td>É um anticorpo que detecta níveis endógenos de proteína total do Neurofilamento-H</td></tr><tr><td>Anti-PrP mAb EP1802Y&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>Coelho monoclonal [EP 1802Y] para proteína PrP Prion</td></tr><tr><td>Anti-coelho CY5&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>É um anticorpo usado em citometria de fluxo ou análise FACS</td></tr><tr><td>Anti-STRO 1</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>Marcadores celulares positivos anticorpos direcionados contra células-tronco mesenquimais</td></tr><tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibco por life technologies</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp; pode ser usado para apoiar a indução de células-tronco neurais humanas (hNSCs) a partir de células-tronco pluripotentes (PSCs), expansão de hNSCs, diferenciação de hNSCs e manutenção de neurônios diferenciados maduros em cultura</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td><td>Citômetro de fluxo equipado com um laser azul (488 nm) e um laser vermelho (640 nm)</td></tr><tr><td>Software BD Accuri C6</td><td>A BD Biosciences</td><td></td><td>controla o sistema de citômetro de fluxo BD Accuri C6 para adquirir dados, gerar estatísticas e analisar resultados</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>basic Fibroblast Growth Factor&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga CL30R</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>11210908</td><td>é um dispositivo utilizado para a separação de fluidos, gases ou líquidos, com base na densidade</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora 3541</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>garante condições de crescimento ótimas e reprodutíveis para culturas celulares</td></tr><tr><td>Colagenase, tipo IV&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>Collagenase é uma protease que cliva a ligação entre um aminoácido neutro (X) e a glicina na sequência Pro-X-Glyc-Pro, que é encontrada com alta frequência no colágeno</td></tr><tr><td>Bisturi descartável&nbsp;</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td>É usado para cortar tecidos</td></tr><tr><td>DMEM-L</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose com L-Glutamina com Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15 Fator de</td><td>Crescimento Epidérmico&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco da life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS é um suplemento de mídia popular porque fornece uma ampla gama de funções na cultura de células. FBS fornece nutrientes, fatores de crescimento e fixação e protege as células de danos oxidativos e apoptose por mecanismos que são difíceis de reproduzir em sistemas de meios sem soro (SFM)</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0,2.500 mL Filtro superior de frasco</td><td>Sarstedt</td><td>831.823.101</td><td>é um dispositivo usado para filtração de soluções</td></tr><tr><td>Flexitube GeneSolution para PRNP</td><td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td>4 siRNAs para o gene Entrez 5621. Sequência alvo N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&nbsp; N.4&nbsp; CAGTGACTATGAGGACCGTTA</td></tr><tr><td>Solução de Hank 1x</td><td>Gibco da life technologies</td><td>240200083</td><td>A função essencial de Hanks&prime; A solução salina balanceada é para manter o pH e o equilíbrio osmótico. Também fornece água e íons inorgânicos essenciais para as células</td></tr><tr><td>Reagente de Transfecção HiPerFect&nbsp;</td>O <td>Reagente de</td> Transfecção <td>Qiagen</td> 301705 <td>HiPerFect é uma mistura única de lipídios catiônicos e neutros que permite a absorção eficaz de siRNA e a liberação eficiente de siRNA dentro das células, resultando em alta redução de genes mesmo quando se usa baixas concentrações de siRNA</td></tr><tr><td>Neurobasal A&nbsp;</td><td>Gibco da life technologies</td><td>10888022</td><td>Neurobasal-A Medium é um meio basal projetado para manutenção e maturação a longo prazo de neurônios cerebrais pós-natais e adultos puros&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>O paraformaldeído tem sido usado para fixação de células e seções de tecido durante procedimentos de coloração</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td>É usado para suplementar meios de cultura de células para controlar a contaminação bacteriana</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004LX10&nbsp;</td><td>PBS é uma solução salina balanceada usada para o manuseio e cultura de células de mamíferos. O PBS é usado para irrigar, lavar e diluir células de mamíferos. O tamponamento de fosfato mantém o pH na faixa fisiológica</td></tr><tr><td>TC-Platte 6 bem, Cell+,F</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>É uma superfície de crescimento para células aderentes</td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos T-25,Cell+,Tampa ventilada</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>Frasco de cultura de tecidos T-25, poliestireno, Cell+ superfície de crescimento para células aderentes sensíveis, por exemplo, células primárias, pescoço inclinado, tampa de ventilação, amarelo, estéril, livre de pirogênio, não citotóxico, 10 pcs./saco</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Surfactante não iônico amplamente utilizado para recuperação de componentes de membrana sob condições leves e não desnaturantes</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D&nbsp;</td><td>A tripsina cliva os peptídeos no lado C-terminal dos resíduos de aminoácidos lisina e arginina. A tripsina é usada para remover células aderentes de uma superfície de cultura</td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td>Tubo 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 Compact</td><td>Steril</td><td>ST-003009000</td><td>Oferece proteção total para o meio ambiente e o trabalhador</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 - Invertido&nbsp; O microscópio</td><td>Zeiss</td><td>3849000962</td><td>ZEISS Axio Vert.A1 oferece um preço de nível de entrada exclusivo e pode fornecer todas as técnicas contrastantes, incluindo campo claro, contraste de fase, PlasDIC, VAREL, contraste de modulação Hoffman aprimorado (iHMC), DIC e fluorescência. Incorpore iluminação LED para imagens suaves para células marcadas com fluorescência. O Axio Vert.A1 foi ergonomicamente projetado para trabalhos de rotina e compacto o suficiente para ficar dentro de capuzes de cultura de tecidos.</td></tr></tbody></table>

isolamento, propagação e expressão de proteína príon durante a diferenciação neuronal de células-tronco humanas polpa dental

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Problemas bioéticos relacionados à manipulação de células-tronco embrionárias tem dificultado avanços no campo da pesquisa médica. Por esta razão, é muito importante obter células-tronco adultas de diferentes tecidos como adiposo, cordão umbilical, medula óssea e sangue. Entre as fontes possíveis, a polpa dental é particularmente interessante, porque é fácil de obter em relação às considerações bioéticas. Com efeito, Dental Pulp células estaminais humanas (hDPSCs) são um tipo de células-tronco adultas possam diferenciar em células neuronais e pode ser obtido o terceiro molar de pacientes saudáveis (idade 13-19). Em particular, a polpa dental foi removida com uma escavadeira, corte em fatias pequenas, tratada com colagenase IV e cultivada em um balão. Para induzir a diferenciação neuronal, hDPSCs foram estimulados com EGF/bFGF por 2 semanas. Anteriormente, temos demonstrado que durante o processo de diferenciação do conteúdo de celular prion proteínas (PrPC) no hDPSCs aumentaram. A análise cytofluorimetric mostrou uma expressão inicial de PrPC que aumentou após o processo de diferenciação neuronal. Ablação do PrPC por siRNA PrP impediu a diferenciação neuronal induzida pelo bFGF/EGF. Neste trabalho, ilustramos que como temos realçado o isolamento, separação e em vitro métodos de cultivo de hDPSCs com vários procedimentos fácil, mais eficientes clones de células foram obtido e em grande escala de expansão das células tronco mesenquimais (MSCs) observou-se. Também mostramos como os hDPSCs, obtidos com métodos detalhados no protocolo, são um excelente modelo experimental para estudar o processo de diferenciação neuronal de MSCs e subsequentes processos celulares e moleculares.

Os procedimentos de isolamento e separação de hDPSCs da polpa dental, obtida a partir do terceiro molar, são processos complexos, em que pequenas mudanças podem levar a um resultado desastroso. Neste trabalho, utilizamos o protocolo de Arthur et al.. 12 com várias melhorias. Um esquema representativo dos procedimentos é mostrado na Figura 1.
hDPSCs representa uma pop...

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolamento de células-tronco polpa Dental humana e propagação a fim de avaliar a expressão da proteína príon durante o processo de diferenciação neuronal.

Isolamento, propagação e expressão de proteína príon durante a diferenciação Neuronal de células-tronco humanas polpa Dental

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

A maneira padrão de obter uma célula-tronco da polpa dentária é pouco eficiente, e isso depende de várias variáveis. Nosso protocolo permitiu obter um isolamento bem sucedido de células-tronco de dentes tratados em 90% dos casos. Obter um alto número de células em poucas semanas é a principal vantagem.Isso nos permite usar a célula em medicina regenerativa e criar um biobanco fornecendo a outros cientistas esta ferramenta útil. O procedimento para abertura do dente será realizado pelo Dr. Constantino Santacroce. Posteriormente, o protocolo será apresentado por Stefano Martellucci, o doutorando do meu laboratório, que é o primeiro autor do artigo.Para começar, extrair o terceiro molar do paciente, enxágüe-o rapidamente com PBS, coloque um tubo de ensaio de 15 mililitros com o meio e transfira-o para o laboratório em menos de duas horas. Sob um capô de risco biológico, use um cortador para abrir o dente por uma passagem de corte coronal, paralela e tangente, através do teto da câmara de polpa. Com uma pequena escavadeira, retire suavemente a polpa e coloque-a em um tubo de ensaio.Em seguida, lave com PBS três vezes, e centrífuga a 2.500 vezes g em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a centrifugação, remova o supernatante. Resuspend a pelota na solução de Hank, e transfira a amostra para uma placa de Petri.Remova a solução do Hank por centrifugação a 2.500 vezes g à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, com um bisturi descartável, divida a polpa em fatias de aproximadamente um milímetro e adicione um mililitro de colagem tipo IV. Em seguida, centrifugar a amostra a 2.500 vezes g em temperatura ambiente por 10 minutos.Remova o supernatante e resuspense a pelota no meio. Cultuá-lo em um frasco T25 específico para células-tronco a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Durante o período de incubação, mude o meio cultural a cada três dias.Uma vez que as células aderentes atinjam a confluência, adicione um mililitro da solução trypsin-EDTA às células para descolá-las, e incubar as células a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros do meio de cultura em uma proporção de um a cinco para parar a ação de trippsina, e centrifugar a suspensão da célula a 259 vezes g por seis minutos. Remova o supernatante.Em seguida, coloque as células em um frasco T25 para se propagar. Em seguida, desprende as células com um mililitro de trippsin-EDTA a 37 graus Celsius por três minutos. Centrifugar a suspensão da célula a 259 vezes g durante seis minutos.Remova o supernascedor e prossiga para testar as células para análise citofluormétrica. Para realizar o passo de silenciamento da proteína prion transitória, primeiro cultura as células-tronco de polpa dentária humana em placas de seis poços com dois mililitros do meio cultural por 24 horas. Em seguida, adicione 400 microliters do pequeno RNA PrP médio interferindo a cada amostra, e incuba-os a 37 graus Celsius por seis horas.Sem descartar o meio siRNA PrP, adicione 1,6 mililitros do meio de cultura em uma proporção de um a cinco, e deixe as células a 37 graus Celsius por 72 horas. Após o período de incubação, remova o sobrenante e lave as células com dois mililitros de PBS três vezes à temperatura ambiente. Em seguida, adicione dois mililitros do meio de cultura neuronal, e mantenha as células por sete a 14 dias em uma incubadora a 37 graus Celsius.Após o período de incubação, lave as células com dois mililitros de PBS três vezes à temperatura ambiente, e prossiga para a análise de manchas ocidentais para testar antígenos da superfície neuronal. Para realizar o processo de indução neuronal, cultura 2 milhões de células-tronco de polpa dentária humana em placas de seis poços, até 28 dias da separação da polpa. A cada três dias, descarte o supernaspe.Lave três vezes com dois mililitros de PBS à temperatura ambiente, e substitua dois mililitros do meio de cultura neuronal. Após sete a 14 dias, desprende as células com um mililitro de trippsin-EDTA a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros do meio de cultura em uma proporção de um a cinco para parar a ação de trypsin.Para caracterizar as células-tronco da polpa dentária humana por citometria de fluxo, cultura 2 milhões por mililitro das células em placas de seis poços com dois mililitros do meio de cultura. Aos 28 dias de separação da polpa pós-dentária ou depois de 14 dias adicionais com meio de cultura neuronal, adicione um mililitro da trippsina-EDTA a 37 graus Celsius por três minutos para desacoplar as células. Em seguida, adicione quatro mililitros do meio de cultura em uma proporção de um a cinco para parar a ação de trippsina, e centrifugar a 259 vezes g à temperatura ambiente por seis minutos.Fixar as células não tratadas ou tratadas com 300 microlitrais de 4% de paraformaldeído em PBS a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, centrífuga, descarte o supernasce e permeabilifique as células com surfactante 1% não iônico na PBS à temperatura ambiente por mais 10 minutos. Em seguida, centrífuga novamente, descarte o supernascente, e realize o bloqueio com 5% de leite seco sem gordura em um mililitro de PBS à temperatura ambiente por uma hora.Lave três vezes com um mililitro de PBS, e incuba as células com anticorpos anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-três-tubulin, anti-NFH e anticorpos monoclonais anti-GAP43 à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, centrifugar as células novamente três vezes consecutivas com um mililitro de PBS em intervalos de seis minutos, e, em seguida, incubar com anticorpos monoclonais anti-rato PE ou anti-coelho CY5 à temperatura ambiente por uma hora adicional. Use os anticorpos secundários para gating das células imuno-positivas, e analise todas as amostras com um citômetro de fluxo.Cultura 2 milhões de células por mililitro das células-tronco da polpa dentária humana em placas de seis poços com dois mililitros do meio cultural. Aos 21 e 28 dias de separação da polpa pós-dentária ou depois de mais sete a 14 dias com o meio de cultura neuronal, adicione um mililitro da trippsina-EDTA a 37 graus Celsius por três minutos para desacoplar as células. Em seguida, centrífuga, descarte o supernasce e, em seguida, fixe os espécimes com 4% de paraformaldeído em PBS a quatro graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, centrífuga, descarte o supernaspeuta e, em seguida, permeabilize com surfactante 1% não iônico na PBS à temperatura ambiente por 10 minutos. Remova o supernatante e manche as células com anticorpo monoclonal anti-PrP de coelho à temperatura ambiente por uma hora. Finalmente, centrífuga, descarte o supernasce e, em seguida, incubar com anticorpo monoclonal anti-coelho CY5 à temperatura ambiente por mais uma hora.Analise todas as amostras com um citômetro de fluxo. Após a separação da polpa, os aglomerados de células-tronco de polpa dentária humana foram expandidos na periferia. Uma comparação entre o crescimento dessas células antes e depois da diferenciação neuronal induzida pelo EGF/bFGF mostrou mudanças significativas na morfologia celular e no crescimento dos neurites.Células-tronco de polpa dentária humana não tratadas expressaram antígenos superficiais mesenquimais mesenquimais multipotentes, como CD44, CD90, CD105, CD73 e STRO-1. Após estímulos de indução neuronal apropriados, essas células expressaram marcadores neuronais específicos, como beta-três-tubulina, NFH e GAP43. Células não tratadas ou tratadas não expressaram marcadores hematopoiéticos, como CD14 e CD19.Após 28 dias, a proteína prion foi expressa precocemente em células-tronco de polpa dentária humana em comparação com o controle negativo correspondente, e sua expressão foi aumentada após o processo de diferenciação neuronal induzido pelo EGF/bFGF. A análise da mancha ocidental mostrou que silenciar a proteína prion por sRNA antes dos estímulos EGF/bFGF poderia afetar o processo de diferenciação neuronal das células-tronco de polpa dentária humana, impedindo a expressão de marcadores neuronais beta-três-tubulina e NHF. O mais importante é a escolha da enzima para separar as células da polpa.Na verdade, se a enzima é muito agressiva, as células podem ser danificadas e sua capacidade de crescimento e diferenciação pode ser comprometida. As células-tronco da polpa dentária são um excelente modelo experimental que pode ser empregado em estudos in vivo e in vitro no campo da medicina regenerativa. Uma vez que a PrP desempenha um papel fundamental no processo de diferenciação neuronal das células-tronco da polpa dentária, este marcador pode ser um excelente candidato como alvo eficaz em doenças neurodegenerativas.O aspecto mais importante a ser aconselheira é a condição de saúde dos pacientes, como a ausência de doenças infecciosas.

isolation-propagation-prion-protein-expression-during-neuronal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Este vídeo mostra uma técnica para estabelecer uma co-cultura de neurônios trigêmeos e células primárias da polpa dentária usando um filtro transwell. Nessa condição fisicamente separada, as células mesenquimais obtidas do tecido da polpa dentária secretam moléculas sinalizadoras parácrinas que atravessam os poros, promovendo a diferenciação e migração de neurônios em direção às células mesenquimais, estabelecendo um sistema de co-cultura.

Estabelecendo uma co-cultura de células da polpa dentária e neurônios do trigêmeo para comunicação cruzada

Este vídeo demonstra o processo de indução de células-tronco pluripotentes humanas a se diferenciarem em neurônios, transfectando-as com lentivírus modificados carregando um gene do fator de transcrição neurogênico sob o controle do elemento responsivo à tetraciclina, seguido de tratamento com um derivado de tetraciclina e meio de maturação.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em neurônios usando lentivírus projetados

Este procedimento gera os neurónios telencefálicos atravessando checkpoints que são semelhantes aos observados durante o desenvolvimento humano. As células são deixadas a diferenciar-se espontaneamente, são expostas a factores que os empurram no sentido da linhagem neural, são isolados, e são plaqueadas em lamelas de cobertura para permitir a diferenciação terminal e maturação.

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo descreve a transiente engenharia genética de células-tronco dentárias extraídas do folículo dental humano. A estratégia de modificação não-virais aplicada pode tornar-se uma base para a melhoria dos produtos terapêuticos células-tronco.

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Este artigo fornece um guia passo a passo para estabelecer uma cultura primária de células-tronco de polpa dentária usando o método de cultura de explante e caracterização dessas células com base nas diretrizes do ICSCRT. As células isoladas por este protocolo podem ser consideradas como células-tronco mesenquimais para futuras aplicações.

Cultura Primária de Células-Tronco da Polpa Dentária

Este protocolo enfatiza a extração, cultura e preservação de células-tronco multipotentes da polpa dentária por meio da digestão enzimática. Além disso, demonstra seu potencial de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condrócitos, destacando a importância da precisão e consistência no processo.

Isolamento, Cultura e Caracterização de Células-Tronco da Polpa Dentária de Dentes Humanos Decíduos e Permanentes

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo de porco (pADSC) de tecidos adiposos subcutâneos com exame de multipotência. O pADSC multipotente é usado para delinear processos de diferenciação de adipócitos e estudar a transdiferenciação em múltiplas linhagens celulares de mesênquima mesodérmico ou outras linhagens de ectoderma e endoderme para estudos regenerativos.

Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

Aprenda a isolar e propagar células-tronco de polpa dental humana com eficiência de 90%, avaliando a expressão da proteína príon durante a diferenciação neuronal para aplicações em medicina regenerativa.

Isolamento, propagação e expressão de proteína príon durante a diferenciação Neuronal de células-tronco humanas polpa Dental

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