Name: Identificação de receptores de Orexin e endocanabinoides em zebrafish adulto usando métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda técnicas de imunoperoxidase e imunofluorescência dupla para localizar receptores de orexina e endocanabinoides em zebrafish adulto. Este protocolo auxilia na análise de alterações moleculares em condições patológicas.

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Este estudo foi apoiado por Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Universidade de Sannio.

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Preparação da amostra
A preparação da amostra é o primeiro passo crítico no IHC. Um protocolo confiável permite A manutenção da morfologia celular, da arquitetura tecidual e da antigenicidade. Esta etapa exige a coleção, a fixação, e o seccionamento corretos do tecido22,23. A finalidade da fixação é preservar o tecido e reduzir a ação de enzimas ou de micro-organismos do tecido. Em particular, a etapa de fixação...

Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica clássica bem estabelecida usada para identificar componentes celulares ou do tecido (antígenos) pela interação do antígeno-anticorpo1,2. Ele pode ser usado para identificar a localização e distribuição de biomoléculas alvo dentro de um tecido. O IHC utiliza reações imunológicas e químicas para detectar antígenos em secções teciduais3. Os principais marcadores utilizados para a visualização de interações antígeno-anticorpo incluem corantes fluorescentes (imunofluorescência) e reações de cor de substrato enzimático (imunoperoxidase), ambos conjugados a anticorpos4. Usar a observação microscópica é possível determinar a localização do tecido etiquetado, que corresponde aproximadamente à localização do antígeno do alvo no tecido.
Existem dois métodos para reações fluorescentes ou cromogênicas para detectar proteínas: o método de detecção direta, no qual o anticorpo primário específico é rotulado diretamente; e o método de detecção indireta, no qual o anticorpo primário é não conjugada enquanto o anticorpo secundário carrega o rótulo5,6,7. O método indireto tem algumas vantagens, que é principalmente a sua amplificação de sinal. Além disso, diferentemente de outras técnicas moleculares e celulares, com imunofluorescência, é possível visualizar a distribuição, localização e coexpressão de duas ou mais proteínas diferencialmente expressas dentro de células e tecidos7. A escolha do método de detecção utilizado depende dos detalhes experimentais.
Até o momento, o IHC é amplamente utilizado na pesquisa básica como uma ferramenta poderosa e essencial para a compreensão da distribuição e localização de biomarcadores e o perfilamento geral de diferentes proteínas no tecido biológico de humanos a invertebrados8, 9 anos de , 10 de , a técnica 11. The ajuda a indicar um mapa da expressão da proteína em um grande número de órgãos animais normais e alterados e de tipos diferentes do tecido, mostrando possível para baixo ou acima-regulação da expressão induzida por mudanças fisiológicas e patológicas. A IHC é uma técnica altamente sensível que requer precisão e a escolha correta dos métodos para obter os melhores resultados12. Em primeiro lugar, muitos fatores diferentes, como fixação, reatividade cruzada, recuperação de antígenos e sensibilidade de anticorpos, podem levar a sinais falsos positivos e falsos negativos13. A seleção dos anticorpos é uma das etapas mais importantes do IHC e depende da especificidade do antígeno e sua afinidade com a proteína e as espécies investigação7.
Recentemente, nós otimizamos a técnica de IHC para detectar membros de sistemas do hipocretin e do endocanabinóide do orexin/no tecido adulto do zebrafish. Temos focado principalmente na fixação, incorporação de tecidos usando duas abordagens diferentes, corte e montagem (o que pode afetar a resolução e detalhes durante a análise microscópica), e bloqueio (para evitar falsos positivos e reduzir o fundo)14. Outras características importantes são a especificidade do anticorpo e a seletividade e reprodutibilidade de protocolos individuais de IHC. A chave para fornecer a especificidade do anticorpo é o uso de controles negativos (incluindo sem anticorpos primários ou tecido que é conhecido por não expressar as proteínas-alvo), bem como controles positivos (incluindo o tecido que é conhecido por expressar as proteínas-alvo)15 . A seleção de anticorpos para IHC é feita com base em sua espécie-especificidade (a probabilidade com que reagem com o antígeno de interesse) e os sistemas de detecção de ligação antígeno-anticorpo que é usado4,5,6 ,7. No caso da imunoperoxidase, a cor da reação é determinada pela seleção do cromogénio precipitante, geralmente diaminobenzidina (marrom)16. Por outro lado, immunofluorescência utiliza anticorpos conjugados com um fluorophor para visualizar a expressão protéica em secções de tecido congelado e permite uma análise fácil de múltiplas proteínas em relação ao sistema de detecção cromogênica 5. º , o 7.
Na técnica da imunoperoxidase, o anticorpo secundário é conjugado à biotina, uma molécula de vinculador capaz de recrutar uma molécula de repórter cromogênica [complexo avidina-biotina (ABC)], levando à amplificação do sinal de coloração. Com o método do repórter do ABC, a enzima peroxidase reage com 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB), produzindo uma mancha intensamente marrom-colorida onde a enzima se liga ao anticorpo secundário, que pode então ser analisado com um microscópio claro ordinário. A coloração do ABC, devido à alta afinidade da avidina para a biotina, produz uma reação rápida e ótima, com poucos anticorpos secundários anexados ao local da reatividade do anticorpo primário. Este método de detecção cromogênica permite a análise densitométrica do sinal, fornecendo dados semiquantitativos baseados na correlação de níveis de sinal marrom com níveis de expressão protéica18.
Com técnicas da imunofluorescência, a deteção simultânea de proteínas múltiplas é possível devido à habilidade de fluorochromes diferentes emitir a luz em comprimentos de onda originais, mas é importante escolher fluorochromes com cuidado para minimizar a sobreposição espectral 5. Além disso, a utilização de anticorpos primários em diferentes espécies hospedeiras minimiza as dificuldades em relação à reatividade cruzada. Neste caso, cada anticorpo secundário espécie-específico reconhece somente um tipo de anticorpo preliminar. Os repórteres fluorescentes são moléculas orgânicas pequenas, incluindo derivados comerciais, tais como tinturas de Alexa fluor.
Muitos modelos animais são usados para compreender circunstâncias fisiológicas e patológicas particulares. Até o momento, estabelece-se que muitas vias metabólicas são conservadas ao longo da evolução. Conseqüentemente, os estudos de IHC em organismos modelo tais como o zebrafish podem fornecer a introspecção na génese e na manutenção de circunstâncias patológicas e não-patológicas17. É um objetivo deste relatório ilustrar protocolos de IHC que podem ser executados no tecido adulto do zebrafish e ser usados para obter imagens detalhadas da distribuição e da localização de OXA, de OX-2R, e de CB1R em níveis periféricos e centrais. Também são relatados protocolos para a aplicação de dois principais métodos indiretos de IHC em tecidos periféricos e centrais de zebrafish adulto. Descrito é o método indireto, que permite a amplificação do sinal nos casos onde um anticorpo secundário é conjugado a um corante fluorescente (método da imunofluorescência) ou ao repórter da enzima (método do immunoperoxidase). Os métodos de detecção cromogênico e fluorescente possuem vantagens e desvantagens. Relatado neste protocolo é o uso de IHC, principalmente a imunofluorescência, em zebrafish adulto, um modelo animal amplamente utilizado para estudar sistemas que são evolutivos conservadas em diferentes condições fisiológicas e patológicas.

<table><tbody><tr><td>Anti CB1</td><td>Abcam</td><td>ab23703</td><td></td></tr><tr><td>Anti OX-2R</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-OXA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc8070</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex</td><td>Merck</td><td>1.085.620.050</td><td></td></tr><tr><td>Coelho biotinilado anti-cabra</td><td>Vector Lab</td><td>BA-5000</td><td></td></tr><tr><td>ácido cítrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica Biosystem</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>Câmera Digital</td><td>Leica Biosystem</td><td>DFC320</td><td></td></tr><tr><td>Câmera Digital para microscópio confocal</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti cabra Alexa fluor 488-conjugado secundário anticorpos</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos secundários conjugados com fluor 594 anti-cabra Alexa</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos secundários conjugados com Alexa fluor 488 anti-coelho</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos secundários conjugados com fluor 594 anti-coelho</td><td>Alexa Thermo Fisher</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>20.821.330</td><td></td></tr><tr><td>Composto de seção congelada</td><td>Leica Biosystem</td><td>FSC 22 Mídia</td><td></td>de seção congelada</tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20.252.290</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>Laboratório vetorial</td><td>SK4105</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica Biosystem</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica Biosystem</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Soro de coelho normal</td><td>Laboratório vetorial</td><td>S-5000</td><td></td></tr><tr><td>cera de parafina</td><td>Carlo Erba</td><td>46793801</td><td></td></tr><tr><td>Paraphormaldeyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>citrato de sódio di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Analytical</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>VectaStain Elite ABC Kit</td><td>Vector lab</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Xileno Puro</td><td>Carlo Erba</td><td>392603</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de receptores de orexin e endocanabinoides em zebrafish adulto usando métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica altamente sensível e específica envolvida na deteção de antígenos do alvo em seções do tecido com anticorpos etiquetados. É um processo multistep no qual a otimização de cada etapa é crucial para obter o sinal específico ideal. Através do IHC, pode-se detectar a distribuição e a localização de biomarcadores específicos, revelando informações sobre a conservação evolutiva. Além disso, o IHC permite a compreensão das mudanças de expressão e distribuição de biomarcadores em condições patológicas, como a obesidade. IHC, principalmente a técnica da imunofluorescência, pode ser usado no zebrafish adulto para detectar a organização e a distribuição de moléculas filogeneticamente conservadas, mas um protocolo padrão de IHC não é estasblished. Orexin e endocanabinóide são dois sistemas altamente conservados envolvidos no controle da ingestão de alimentos e patologia da obesidade. São relatados aqui os protocolos usados para obter a informação sobre o peptide do Hipocretina (Oxa), o receptor do Hipocretina (Ox-2R), e a localização e a distribuição do receptor do canabinóides (CB1R) no intestino e no cérebro de modelos adultos obesos normais e dieta-induzidos do zebrafish (Dio). Também são descritos os métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência dupla, bem como a preparação de reagentes, fixação, incorporação de parafina, e crio-proteção do tecido zebrafish e preparação para um passo de bloqueio de atividade endógena e fundo contracoloração. O conjunto completo de parâmetros é obtido a partir de experimentos prévios de IHC, através dos quais mostramos como a imunofluorescência pode ajudar na compreensão de OXs, OX-2R e distribuição CB1R, localização e conservação da expressão em zebrafish adulto Tecidos. As imagens resultantes com intensidade de sinal altamente específica levaram à confirmação de que os zebrafish são modelos animais adequados para estudos imuno-histoquímicos de distribuição, localização e conservação evolutiva de biomarcadores específicos em condições fisiológicas e patológicas. Os protocolos aqui apresentados são recomendados para experimentos de IHC em zebrafish adulto.

Os dados representativos para a coloração da imunoperoxidase são mostrados na Figura 1 e na Figura 2. A análise de immunohistochemical da distribuição de OX-A e de OX-2R no intestino do zebrafish adulto mostrou locais diferentes da localização de OX-A e de OX-2R e seus aumentos na expressão nas pilhas intestinais do zebrafish do DIO. Observou-se coloração marrom intensa para OX-a nas células do intestino medial e anterior (Figura 1a...

São apresentados aqui protocolos para caracterização imuno-histoquímica e localização de peptídeo de Hipocretina, receptores de Hipocretina e receptores endocanabinoides no intestino e cérebros de modelos adultos de zebrafish de obesidade normal e induzida por dieta (Dio) usando immunoperixidase e métodos dobro da imunofluorescência.

Identificação de receptores de Orexin e endocanabinoides em zebrafish adulto usando métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Atualmente, a imunohistoquímica é utilizada com frequência crescente para identificar a presença de marcadores moleculares específicos e suas alterações no caso de patologias, dando raiz à possibilidade de realização de análise quantitativa. A imunohistoquímica, principalmente a técnica de imunofluorescência, é usada no modelo animal larval e zebrafish adulto, mas pouco se sabe sobre um bom protocolo imunohistoquímico padrão para zebrafish. Aqui, descrevemos e ilustramos um protocolo que pode ser usado para estudar a conservação evolutiva de proteínas importantes em zebrafish adultos.Um bom protocolo para imunohistoquímica em zebrafish adulto pode ajudar a fundamentar a utilidade deste modelo animal para estudar a expressão morfológica e a distribuição de biomoléculas altamente conservadas. Este método também pode ajudar a analisar possíveis alterações dessas biomoléculas devido a condições patológicas correlacionadas à fisiopatologia humana. Demonstrando o procedimento será a Dra.Para iniciar este procedimento, transfira os blocos de tecido congelado preparados para um criostat a menos 20 graus Celsius. Corte o bloco em seções coronais ou sagiais de 10 micrômetros. Em seguida, colete os tecidos em seções seriais alternativas em lâminas de vidro adesivos adequadas para a imunohistoquímica, e armazene-os a menos 20 graus Celsius até que estejam prontos para prosseguir.Primeiro, use uma caneta resistente a solventes para demarcar a área de tecido na lâmina. Enxágüe as seções três vezes por cinco minutos cada, usando tampão fosfato de 0,1 molar. Em seguida, dissolva 0,3 mililitros de Triton X-100 em 100 mililitros de tampão fosfato de 0,1 molar para preparar Triton X-100 0,3%Dissolver 0,1% soro de burro normal em tampão fosfato contendo 0,3% Triton X-100 para preparar a solução de bloqueio.Incubar as seções com a solução de soro de burro normal dissolvido no tampão de permeabilização PB-Triton X-100 0,3% durante 30 minutos à temperatura ambiente para permeabiliizar a membrana celular e bloquear os locais de ligação inespecíficos. Primeiro, enxágüe as seções três vezes por cinco minutos cada com tampão fosfato molar de 0,1. Adicione a mistura de anticorpos primários diluídos em PB-T, e incubar as seções durante a noite em uma caixa úmida à temperatura ambiente.No dia seguinte, enxágue as seções três vezes por cinco minutos cada com tampão fosfato de 0,1 molar. Incubar seções em temperatura ambiente por duas horas em uma mistura apropriada de anticorpos secundários diluídos em PB-T. Para começar, enxágüe as seções três vezes por cinco minutos cada uma com tampão fosfato de 0,1 molar.Dissolva 1,5 microliters de DAPI em três mililitros de tampão fosfato para preparar o DAPI de corante nuclear. Contra-retenham as seções no corante. Em seguida, use o meio de montagem para cobrir os slides para estabilizar o tecido e a mancha para uso a longo prazo.Amostras fluorescentes podem ser armazenadas no escuro a quatro graus Celsius. Repita o protocolo de imunofluorescência e omita o anticorpo primário ou secundário, ou substitua o antiserum primário ou secundário com tampão fosfato para preparar o controle negativo. Em seguida, repita o protocolo de imunofluorescência e pré-absorva cada anticorpo primário com um excesso do peptídeo relativo.Repita o protocolo de imunofluorescência em fatias do cérebro do rato para preparar o controle positivo. Usando um microscópio confocal equipado com um estágio motorizado X-Y-Z, uma câmera digital e software de aquisição e análise, observe e analise as seções imunossuadas. Adquira imagens digitais com os objetivos 5x, 20x e 40x.Tire imagens de cada seção com baixa ampliação em cada um dos canais disponíveis para compor uma montagem de baixa ampliação. Normalize as imagens de fluorescência ao máximo de contraste e sobreposição. Em toda a área de interesse, colete pilhas de imagens Z em série através de seis planos focais com passos focais de um a 1,8 micrômetros.Execute esta coleção para cada canal separadamente. Depois disso, use o software de desconvolução de imagens para desconvolver imagens por aplicação de 10 iterações e colapsar as imagens de plano Z em série em uma única imagem de projeção máxima. Use um software de edição de imagem apropriado para ajustar os micrografos para luz e contraste.A análise imunohistoquímica da distribuição ox-A e OX-2R no intestino de zebrafish adulto mostra diferentes locais de localização de OX-A e OX-2R e seus aumentos de expressão nas células intestinais do DIO zebrafish. Uma mancha marrom intensa para OX-A é observada nas células do intestino medial e anterior. A imunoexpressão do OX-A dá sinais claros nos diferentes compartimentos intestinais, diminuindo do anterior em direção ao intestino medial.Resultados semelhantes são observados para a imunoexpressão OX-2R no intestino do DIO e controle de zebrafish diet. Um sinal ox-A aumentado em DIO zebrafish adulto é acompanhado pela superexpressão de OX-2R em outros compartimentos intestinais. A análise precisa das imagens imunofluorescentes mostra o aumento da colocalização ox-2R/CB1R no intestino de zebrafish adulto DIO em comparação com a dieta de controle zebrafish.Situação semelhante é observada em diferentes regiões cerebrais, como o telencephalon dorsal, hipotálamo, tectum óptico, torus lateralis e núcleo difuso do lobo inferior. Ao dobrar a imunostaining com a colocalização orexina-A e CB1R, observa-se que houve um aumento da colocalização nos neurônios orexinérgicos do hipotálamo, acompanhados de um aumento do sinal fluorescente orexina-A. Esses resultados mostram como a dupla imunofluorescência pode ajudar a identificar a expressão fisiologicamente conservada da proteína, a colocalização de proteínas-alvo e suas mudanças de distribuição e/ou expressão em diferentes condições patológicas.Usando a imunofluorescência, podemos entender melhor a codistribução e coexpressão das biomoléculas, suas possíveis interações, e também podemos ter uma imagem visível de suas mudanças em caso de diferentes patologias. Além disso, a distribuição neuroanatomical da expressão ou receptores de enzimas metabólicas pode revelar ainda mais o papel da sinalização proteica dentro dos tecidos. O presente trabalho técnico introduziu a abordagem da imunofluorescência para estudar dois sistemas altamente conservados, orexina e endocanabinóides, no uso de um modelo adulto de zebrafish.Usando este protocolo descrito aqui pela primeira vez no cérebro de zebrafish adulto, a distribuição anatômica e coexpressão de receptores orexin-2 e os receptores endocanabinóide-CB1 não foi determinada. Recomendamos os protocolos descritos aqui para experimentos de imunohistoquímica e para detectar distribuição espacial e organização de receptores em peptídeos em zebrafish adultos para entender melhor suas funções.

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