Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

Neste protocolo, podemos identificar as interações entre proteínas e DNA, revelando a regulação transcricional do gene. Isso ajuda a entender os mecanismos moleculares nas células. Modificamos os protocolos pré-existentes e, em seguida, estabelecemos protocolos de ensaio simples e mais claros.

Basta seguir o protocolo desde o primeiro passo para que o ensaio possa ser feito com sucesso. Para preparar a cromatina cruzada, em um capô de fumaça, adicione quatro mililitros de mídia de cultura celular 1%VCaP e 0,229 mililitros de 18,5% PFA a um prato de seis centímetros. Gire suavemente o prato para distribuir a PFA uniformemente.

Incubar em temperatura ambiente por exatamente 10 minutos. Em seguida, adicione 0,47 mililitros de solução de glicina de 1,25 molar ao prato, e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos para parar de atravessar ainda mais. Depois de lavar as células de acordo com o manuscrito, raspe as células e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Centrifugar o tubo com a suspensão celular a 3.000 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente para recuperar a pelota celular. Use uma pipeta para remover completamente o PBS. Grave o número de celular por tubo, e armazene a pelota da célula a menos 80 graus Celsius.

Para realizar a lise celular, primeiro descongele as pelotas de célula VCaP armazenadas no gelo. Adicione 300 microliters do tampão de lise celular ChIP preparado complementado com PIC em cada tubo, e resuspense a pelota completamente. Vórtice do tubo por 15 segundos, e incubar a suspensão no gelo por 10 minutos.

Centrifugar a 9.000 vezes g por três minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante completamente, e adicione 300 microliters de tampão de digestão MNase para resuspensar a pelota. Diluir mnase com tampão de digestão MNase em um tubo de 1,5 mililitro para produzir 50 unidades de gel por microliter.

Adicione o MNase diluído à suspensão e incubar a 37 graus Celsius por exatamente 10 minutos. Defina a mistura por inversão a cada 2 minutos e meio. Para terminar a digestão MNase, adicione 30 microlitadores de 0,5-molar EDTA em pH oito, e vórtice brevemente.

Após a incubação por cinco minutos no gelo, centrífuga a 9.000 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova completamente o supernatante e resuspenja a pelota em 300 microliters do tampão de diluição ChIP preparado complementado com PIC. Em seguida, em um sonicator equipado com uma sonda de microtáls, defina as condições de sônica para amplitude dois, tempo processado 15 segundos, pulso ON cinco segundos e pulso OFF 30 segundos.

Sonicar a suspensão no gelo. Desenhe um microliter da suspensão e localque em um vidro deslizante. Sob um microscópio, observe para garantir que a estrutura celular esteja quase quebrada.

Centrifugar o tubo a 9.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius, e transfira o supernascer para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Salve 20 microlitros da cromatina digerida em um tubo de parafuso de 1,5 mililitro para tratamento posterior, e armazene o restante a menos 80 graus Celsius. Primeiro, em cada tubo de parafuso de 1,5 mililitro, adicione 75 microlitros de água, quatro microlitros de cloreto de sódio de cinco molares, e um microliter de proteína K.To remover a ligação cruzada entre proteína e DNA, adicionar 20 microlitros de cromatina digerida de cada condição de digestão MNase a um tubo de parafuso.

Feche a tampa firmemente, misture completamente e incubar o tubo a 65 graus Celsius durante a noite. Pela manhã, depois de centrifugar o tubo a 2 a 3.000 vezes g por alguns segundos, adicione 100 microliters de PCI. Vórtice vigorosamente para formar uma emulsão.

Centrifugar o tubo novamente em velocidade máxima por 30 segundos à temperatura ambiente. Em seguida, prepare dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro por condição. Adicione 100 microliters de PCI a um tubo.

Adicione 10 microlitres de acetato de sódio de três molares no pH 5.2 e dois microliters de glicogênio a outro tubo. Do tubo retirado da centrífuga, retire cuidadosamente a fase superior contendo DNA, e adicione-a ao tubo que contém PCI. Vórtice vigorosamente, e centrifugar o tubo em velocidade máxima por 30 segundos à temperatura ambiente.

Em seguida, transfira a fase superior para o tubo contendo acetato de sódio e glicogênio preparado anteriormente. Adicione 250 microliters de etanol, e misture por inversão. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.

Centrifugar o tubo em velocidade máxima por 30 minutos a quatro graus Celsius. Confirme as pelotas na parte inferior do tubo. Remova cuidadosamente o supernascer para não perturbar a pelota, e adicione 500 microliters de 70% de etanol.

Centrifugar o tubo em velocidade máxima por cinco minutos a quatro graus Celsius. Retire completamente o sobrenatante e seque a pelota por aproximadamente cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 20 microliters de TE para dissolver a pelota.

Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro UV. Após a preparação da cromatina digerida, descongele todas as amostras no gelo. Adicione 1200 microliters do tampão de diluição chip preparado complementado com PIC para diluir cromatina digerida à concentração de cinco microgramas por 500 microliters.

Adicione cinco microlitros da cromatina digerida diluída a um tubo de parafuso de 1,5 mililitro como uma amostra de entrada. Armazene a amostra a menos 80 graus Celsius. Adicione 500 microlitros cada um da cromatina digerida diluída a um tubo de parafuso de 1,5 mililitro como uma amostra de imunoprecipitação.

Adicione dois microgramas de anticorpos em cada tubo e feche a tampa. Incubar os tubos a quatro graus Celsius durante a noite com uma mistura suave em uma plataforma de balanço. Pela manhã, adicione 30 microliters de contas magnéticas de proteína G de grau ChIP a cada tubo.

Incubar os tubos novamente a quatro graus Celsius por duas horas com mistura suave. Depois disso, gire o tubo brevemente a 2 a 3.000 vezes g, e coloque o tubo em um rack de polietileno contendo ímãs de neodímio por um minuto. Em seguida, remova cuidadosamente o supernatante por aspiração.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tampão de lavagem do complexo imunológico de baixo sal a cada tubo. Brevemente vórtice do tubo para dispersar as contas. Incubar o tubo a quatro graus Celsius por cinco minutos com uma mistura suave em uma plataforma de balanço.

Repita a lavagem com complexo imunológico de alto sal e complexo imunológico do cloreto de lítio de acordo com o manuscrito. Depois de remover completamente o supernatante restante, adicione 150 microliters de tampão de elução ao tubo. Vórtice do tubo para dispersar as contas completamente.

Feche a tampa e incuba o tubo a 65 graus Celsius por 30 minutos. Para dispersar completamente as contas, misture por inversão a cada cinco minutos. Durante a incubação, prepare um tubo de parafuso de 1,5 mililitro, e adicione seis microlitros de cloreto de sódio de cinco molares e dois microlitros de proteinase K.Descongelar a amostra de 1% de entrada previamente preparada no gelo.

Adicione 150 microliters de tampão de elução, seis microliters de cloreto de sódio de cinco molares, e dois microliters de proteinase K à amostra de entrada. Após a incubação do tubo contendo contas, gire para baixo. Coloque o tubo em um rack magnético por um minuto, e transfira o supernascer para o tubo de parafuso contendo cloreto de sódio e proteinase K.As microfotografias representativas de pelotas de células cruzadas antes e depois da sônica mostram diferenças distintas.

Sem a sônicação, a estrutura celular permanece intacta, indicando que a cromatina está presente nos núcleos. Uma breve sônica quebra a estrutura celular. A cromatina cruzada foi preparada a partir de células VCaP e digerida com várias quantidades de MNase.

Sem adicionar MNase, apareceu um padrão de difamação com um peso molecular muito alto. A adição de MNase deu um padrão de escada, que mostra que mNase digere internucleossomo. Apenas a condição que produziu fragmentos de cromatina de até 900 bp pode ser considerada digestão adequada, enquanto um padrão de digestão inadequado mostra superdigestão resultou principalmente na produção mononucleossomo.

Padrão de digestão de cromatina em células VCaP indicam digestão adequada da cromatina. A maior ocupação de H3K4methyl3 foi observada em torno de 0,5 quilobase e um quilobase a montante do AR-TSS. Regiões localizadas a 19 quilobase e oito kb rio acima e 12 quilobase a jusante de AR-TSS, no entanto, tiveram pouca ocupação de H3K4methyl3, indicando que estas podem ser usadas como regiões negativas.

Determinar a condição de digestão de MNase é o mais importante. Mantenha o número da célula, o volume do buffer e a quantidade de enzimas em cada experimento. A condição deve ser identificada para cada tipo de célula.

Podemos realizar sequenciamento chip para ocupação global dos fatores e capturas de conformação de cromatina para determinar as interações entre lesões genômicas distal. Este método poderia revelar mecanismos de processo da transcrição. O ensaio chip é uma ferramenta poderosa para investigar a regulação transcricional, mas é complicado e não reproduzível.

Nosso método incentiva os pesquisadores a realizar o ensaio de forma rotineira e fácil.