Cromatografia de troca iónica (IEX) acoplada ao multi-ângulo espalhamento de luz (MALS) para caracterização e separação de proteínas

Este protocolo apresenta MALs de intercâmbio de íons, um novo método para controle e caracterização da qualidade da proteína, controle de qualidade essencial para a consistência e integridade dos resultados na pesquisa em ciências da vida e desenvolvimento de produtos farmacêuticos. O MALS de troca de íons determina pureza proteica, estado oligomerico, homogeneidade, identidade, conformação, estrutura, modificações pós-tradução e outras propriedades. As medidas não são destrutivas e são feitas em solução em condições quase fisiológicas de tampão.

Este método determina com precisão a massa molar de proteínas ou peptídeos, o estado oligomerico e o grau de conjugação, por exemplo, glicoproteínas. Também pode ser aplicado a proteínas de membrana. O IEX separa macromoléculas por sua carga superficial.

A troca de ânion, AIEX e cation exchange, CIEX, matrizes se ligam variantes negativas e positivamente carregadas, respectivamente. Com uma separação fina entre populações proteicas que compartilham uma massa ou forma relativamente próxima, o IEX-MALS determina com sucesso a massa molar de cada estado proteico individual em uma amostra de mistura. Para começar, use um filtro de 0,1 micrômetro para filtrar todos os reagentes, incluindo os buffers de lavagem e eluição.

Filtre os primeiros 50 a 100 mililitros de tampão em uma garrafa de lixo, a fim de eliminar partículas dos filtros secos. Em uma garrafa limpa e estéril que foi lavada completamente com água filtrada e tampada para evitar a entrada de poeira, filtre o restante do tampão. Com tampão de pH-oito Tris e cloreto de sódio de 50 milimilas, diluir uma amostra de BSA para seis miligramas por mililitro para que o pH e a força iônica permitam a ligação à coluna de troca de íons.

Use uma seringa para injetar pelo menos 0,3 a 0,5 miligramas de BSA em uma coluna de um mililitro para obter uma análise MALS de boa qualidade. Para iniciar um experimento MALS de troca de íons, abra o Novo, Experimente o Método no software MALS e selecione o método on-line na pasta métodos do sistema de dispersão de luz. Se o módulo DLS estiver disponível e os dados DLS forem adquiridos, selecione o método on-line da dispersão de luz, com a subpastos QELS.

Para definir os parâmetros, sob a seção Configuração, defina primeiro a taxa de fluxo da execução na seção Bomba Genérica para a taxa de fluxo utilizada no FPLC como 1,5 mililitros por minuto. Na seção Solvente, digite ou verifique os parâmetros do buffer. Na seção Injetor, digite o nome da proteína como BSA, incremento de índice refrativo como 0,185 mililitros por grama, e o coeficiente de extinção UV no comprimento de onda de 280 nanômetros como 0,66 litros por grama por centímetro.

Na guia Amostral, insira a concentração da amostra de proteínas como seis miligramas por mililitro e, em seguida, insira o volume amostral para injeção como 170 microliters também. Na seção Procedimentos, na guia Coleta Básica, selecione a caixa de seleção Gatilho em Auto-Injeção e defina a duração da execução para 70 mililitros para que a coleta de dados seja continuada por pelo menos cinco minutos após o gradiente ter atingido seu valor final. Em seguida, no software FPLC, crie um novo experimento na guia Editor de métodos.

Para o experimento inicial, crie um gradiente linear de sal ou pH, enquanto para o método otimizado crie um gradiente mais específico ou um programa stepwise de acordo com o manuscrito. Inclua um sinal de pulso no método que acionará a coleta de dados no software MALS. Em seguida, abra a válvula da bomba e lave com hidróxido de sódio de 0,5 molar para remover impurezas fortemente ligadas, seguida de uma lavagem tampão de neutralização.

Em seguida, lave a coluna com o tampão Tris pH oito, a válvula A com tampão de lavagem e a válvula B com tampão de eluição. Use o tampão de lavagem com a baixa concentração de sal como uma lavagem final para enxaguar a coluna, para permitir a ligação da proteína à matriz da coluna. Antes da injeção da amostra, após a lavagem, e no final da eluição, a linha de base de dispersão de luz deve ser estabilizada para garantir baixo ruído e diluição completamente pura.

Usando uma seringa, coloque a amostra de proteína no laço. Inicie o experimento primeiro no software MALS clicando no botão Executar e, em seguida, no software FPLC. Os dados serão coletados após o recebimento do sinal de pulso do instrumento FPLC através do detector MALS.

Se o MALS de troca de íons for realizado manualmente com um modo de fluxo contínuo em vez de um método autônomo, aplique os mesmos parâmetros da execução e instruções descritas anteriormente. Uma vez verificado e executado o método final, execute exatamente o mesmo método usando uma injeção em branco carregando tampão em vez da amostra. É importante que o tempo entre o pulso de injeção automática e o gradiente da corrida em branco seja idêntico ao da amostra executada.

Para iniciar a análise, na seção Procedimentos no software MALS, use a guia Despiking e o nível Normal para suavizar os cromatógrafos. Se eles exibem muito barulho, coloque o nível para Heavy. Na visão da linha de base, defina a linha de base para todos os sinais, incluindo detectores LS, UV e RI.

Na visão peaks, defina os picos para análise. Verifique os valores corretos do valor de incremento de RI dn/dc e coeficiente de extinção UV para a proteína sob cada pico. Sob a massa molar e raio da vista de dispersão de luz, analise a massa molar e o raio usando o modelo Zimm e ajuste grau de zero.

Se o QELS estiver disponível, sob a exibição Rh da QUELS, observe os valores de Rh e a qualidade do ajuste da função de correlação. O sinal RI muda significativamente durante a corrida mals de troca de íons devido ao aumento da concentração de sal. Para subtrair o sinal de linha de base da injeção em branco, abra tanto os experimentos mals de proteína quanto de troca de íons em branco.

Clique com o botão direito do mouse no nome do experimento proteico, selecione Aplicar método e escolha a pasta de Subtração da linha de base da caixa de diálogo do arquivo. Selecione o método on-line para análise de massa molar padrão. Sob a exibição de Subtração da linha de base, clique em Importar Em branco para importar os sinais da execução em branco.

Sob instrumentos, verifique todos os detectores para subtrair. Para calibrar o sistema MALS de troca de íons com o monômero BSA, sob a visualização procedimentos e configuração, alinhe os picos. Sob a visão De normalização, digite 3,0 nanômetros como o valor rg para realizar a normalização.

Em seguida, em Ampliação da banda na mesma guia Configuração, escolha o pico e use o botão Executar ajuste para combinar os sinais UV e LS com o sinal RI. O gráfico dos resultados é mostrado na exibição de ajuste de resultados. Altere as escalas do eixo e outros parâmetros de gráfico clicando com o botão direito no gráfico, selecionando Editar e, em seguida, clicando no botão Avançado.

Para ter mais opções de exibição, selecione a guia Gráfico FÁCIL e na parte superior da janela no menu suspenso do Display, selecione Molar Mass ou Rh Q.Todos os resultados, incluindo massa molar, raio, nível de pureza e outros estão disponíveis na exibição do Relatório na seção Resultados. Use o botão Desenhista de relatórios para adicionar mais resultados ou parâmetros, bem como números, ao relatório. Neste experimento, a BSA foi analisada no MALS de troca de íons utilizando uma coluna analítica de troca de ânion.

Os cromatógramas exibiram o UV a 280 nanômetros, a dispersão da luz em um ângulo de 90 graus, o índice de refração e as curvas de condutividade juntamente com a massa molar de cada pico. Um gradiente linear amplo composto por 30 volumes de colunas de 75 milimães a 350 mililitros de sódio separados monômeros BSA de dimers e oligômeros mais altos. A análise de MALS a jusante resultou em uma massa molar monômera calculada de 66,8 kilodaltons e uma massa molar de dez quilos calculada de 130 kilodaltons.

Com base na condutividade tampão nos picos elucidos, o gradiente foi alterado para um programa diferente, um longo passo de cloreto de sódio de 175 mililitros, seguido por um gradiente linear de 175 milimólares para 500 mililitros de sódio. O novo gradiente melhorou muito a resolução e produziu excelente separação entre monômeros BSA e espécies oligomericas mais altas. Um programa stepwise de cloreto de sódio de 200 mililitros e 250 mililitros foi aplicado para se concentrar também nas espécies oligomeméricas altas.

Resultou em uma excelente separação entre monômero BSA, mais escuro e aparador. Após este procedimento, métodos como espectrometria de massa, atividade SDS-PAGE e testes de estabilidade podem ser realizados em cada variante separada pela troca de íons para identificar e caracterizar ainda mais cada uma delas. Descobrimos que o MALS de troca de íons estende o poder da análise mals a amostras que não podem ser totalmente analisadas pela SEC-MALS.

Separação por carga resolvem espécies distintas que coelute em SEC.