Microscopia de imagem hiperespectral de detecção de excitação para discriminar sinais de fluorescência de forma eficiente
22 de agosto de 2019
A imagem latente espectral transformou-se uma solução de confiança para a identificação e a separação de sinais múltiplos da fluorescência em uma única amostra e pode prontamente distinguir sinais do interesse do fundo ou do autofluorescence. A excitação-a imagem latente hiperespectrais da exploração melhora nesta técnica diminuindo o tempo necessário da aquisição da imagem ao simultaneamente aumentar a relação do sinal-à-ruído.
Este protocolo é significativo, pois descreve um método que pode ser usado para separar vários sinais fluorescentes em uma única amostra. Em comparação com os métodos tradicionais, a excitação-digitalização pode aumentar a velocidade do experimento e melhorar a sensibilidade dos dados. Usando diferentes fontes de iluminação, como um laser de supercontinuum, este método pode ser aplicável a sistemas de microscópio confocal de varredura de disco giratório ou laser.
Ao realizar varreduras de excitação, microscopia de imagem espectral, é importante verificar se o pico de excitação de cada rótulo fluorescente ocorre em um comprimento de onda diferente. Para começar, configure um microscópio e câmera de fluorescência invertidas, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, carregue a amostra no palco.
No menu suspenso da janela principal do microgerente, selecione 475 nanômetros para visualização inicial da amostra. Em seguida, clique duas vezes na caixa ao lado da exposição e digite 100 para definir o tempo de exposição em 100 milissegundos. Por fim, clique ao vivo para ver a amostra.
Agora clique em Auto. O botão de faixa de visualização de intensidade automática para trazer os valores mínimos e máximos para faixas visuais significativas. Em seguida, use os botões de foco do microscópio para concentrar a amostra.
Uma vez em foco, ajuste a posição da amostra para que sua borda esteja no centro do campo de visão. Então ajuste o foco. A amostra está em foco quando as características de borda na imagem parecem nítidas.
Agora, abra a ferramenta de aquisição multidimensional. No menu, clique no botão de carga e escolha uma configuração predefinida contendo uma faixa de comprimento de onda apropriada para aquisição espectral. Uma vez confirmadas as configurações de aquisição, mova-se para uma região em branco da amostra e clique em adquirir para coletar uma pilha de imagens espectrais contendo fundo e ruído para usar para subtração posteriormente.
Em seguida, mova-se sobre a amostra para encontrar as regiões mais brilhantes. É provável que as amostras tenham fluorescência mais intensa longe da borda da amostra. Uma vez localizada a região mais brilhante, pegue uma única pilha de imagens.
Carregue a imagem adquirida na Imagem J e use a função de medida da Imagem J para confirmar que nenhum comprimento de onda contém pixels superexpostos. Se for necessário um tempo de exposição reduzido devido à superexposição, a imagem de fundo deve ser retomada com um novo tempo de exposição também. Se alguma das imagens estiver contendo o limite de detecção ascendente da câmera, ajuste o tempo de exposição da varredura espectral para garantir que o sinal máximo em toda a faixa espectral não exceda o alcance dinâmico da câmera.
Com um tempo de exposição apropriado agora determinado, coloque uma amostra sem rótulo no palco. Adquira dados de imagem espectral da amostra não rotulada para determinar se há alguma autofluoresência subjacente. Em seguida, coloque uma amostra de um único rótulo no palco.
Adquira dados de imagem espectral de cada uma das amostras de rótulo único para usar como controles espectrais para construir uma biblioteca espectral. Execute a varredura para cada amostra de controle usando um tempo de exposição de comprimento de onda idêntico e configurações da câmera. Em seguida, coloque um slide contendo a amostra experimental no microscópio.
Selecione um campo de visão que tenha rotulado adequadamente as células e adquira os dados de imagem espectral da amostra usando as configurações de aquisição determinadas. Corrigir imagens para uma resposta espectral plana subtraindo o espectro de fundo da imagem da amostra e multiplicando a imagem pelo coeficiente de correção. Aqui, um script MATLAB é usado para processar rapidamente as imagens.
Em seguida, gere a biblioteca espectral. Para obter melhores resultados, normalize cada membro final para a faixa de comprimento de onda de maior intensidade, determinando qual faixa de comprimento de onda tem o valor mais intenso e dividindo a medição em cada faixa de comprimento de onda por esse valor máximo. Em seguida, salve os dados espectrais como um arquivo dat.
Quando concluído, desmixe os dados de imagem espectral. A etapa desmixagem gerará uma imagem de abundância para cada rótulo fluorescente, onde a abundância é a quantidade de sinal fluorescente relativo na imagem do rótulo prospectivo. Em seguida, abra cada imagem não misturada para inspecionar visualmente a distribuição de componentes puros.
Compare a magnitude da imagem de erro com a das imagens não misturadas. Se a magnitude da imagem de erro for semelhante às imagens de abundância não misturadas, os sinais nos dados de imagem espectral podem não ser contabilizados com precisão. Finalmente, verifique se não há estruturas residuais não identificadas comparando a imagem de erro com as imagens não misturadas.
Quando realizado corretamente, o processo de desmcompra espectral permite a separação de uma pilha de imagem espectral em suas respectivas contribuições de cada rótulo de fluorescência. Aqui, um conjunto de imagens espectrais não misturadas com imagens individuais destacando a autofluorescência de células musculares lisas das vias aéreas, uma sonda GCaMP e um rótulo mitocondrial. Há um alto erro associado às regiões nucleares e perinucleares das células indicando que os espectros medidos dessas regiões não são bem contabilizados pelo espectro na biblioteca espectral.
Espectros puros coletados de células rotuladas que também são autofluorescentes provavelmente contaminarão o perfil espectral para o componente puro. Aqui, pode-se ver a diferença de descomprturação com espectro puro contaminado com autofluorescência, versus o espectro puro corrigido após subtração dimensionada. A aquisição adequada de dados é essencial quando amostras sensíveis à imagem só podem sobreviver a uma única sessão de imagem, ao contrário do fundo e controles que podem ser reimaged.
Certifique-se de que as configurações adequadas de hardware e aquisição sejam predeterminadas o máximo possível. Como próximo passo, vídeos criados a partir de dados de lapso de tempo adquiridos usando este sistema podem ser usados para rastrear fontes fluorescentes em locais discretos ao longo do tempo, como a localização do sinal de segundo mensageiro. Tome cuidado ao usar fontes de luz poderosas para evitar a exposição ocular.
Além disso, certifique-se de usar luvas adequadas ao manusear rótulos biológicos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para separar múltiplos sinais fluorescentes em uma única amostra utilizando imagem hiperespectral com varredura de excitação. Esta técnica aumenta a velocidade dos experimentos e melhora a sensibilidade dos dados em comparação com os métodos tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia de fluorescência
- Técnicas de imagem
- Processamento de sinal
Contexto
- Os sinais de fluorescência podem ser difíceis de distinguir devido ao ruído de fundo.
- Métodos tradicionais de imagem podem ser lentos e menos sensíveis.
- A imagem hiperspectral com varredura de excitação oferece uma solução para esses desafios.
- Diferentes fontes de iluminação podem ser utilizadas para obter melhores resultados.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para separar múltiplos sinais de fluorescência.
- Aumentar a velocidade e a sensibilidade de experimentos de imagem por fluorescência.
- Demonstrar a aplicabilidade deste método a diversos sistemas de microscopia.
Métodos Utilizados
- Configuração de um microscópio de fluorescência invertido e câmera.
- Uso de um laser supercontinuum como fonte de iluminação.
- Carregamento de amostras na platina do microscópio.
- Verificação dos picos de excitação em diferentes comprimentos de onda para cada marcador fluorescente.
Resultados Principais
- A imagem hiperspectral com varredura de excitação reduz significativamente o tempo de aquisição.
- A melhoria na razão sinal-ruído aprimora a qualidade dos dados.
- O método é adaptável a sistemas confocais de disco giratório ou com varredura a laser.
- Demonstrou-se a separação bem-sucedida de múltiplos sinais de fluorescência.
Conclusões
- A imagem hiperespectral com varredura de excitação é uma ferramenta valiosa para pesquisadores.
- Este método pode levar a uma imagem de fluorescência mais eficiente e sensível.
- Aplicações futuras podem se expandir para diversas áreas da pesquisa biológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem hiperespectral com varredura de excitação resolve um gargalo fundamental em fluxos de trabalho de descoberta baseados em fluorescência: a incapacidade de separar rapidamente e com sensibilidade sinais sobrepostos de múltiplos sondas em amostras biológicas complexas. Ao melhorar a velocidade de aquisição e a relação sinal-ruído, este método aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas, especialmente em triagens fenotípicas de estágio inicial, onde a separação de sinais é crítica. Sua compatibilidade com plataformas de microscopia padrão favorece a integração escalável em pipelines de imagem empresariais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar sinais de fluorescência de sondas distintas, esclarecendo o envolvimento de vias e a especificidade do alvo.
- Valor Operacional: Reduz a ambiguidade mecanicista por meio da separação espectral, apoiando a validação funcional do alvo com a desconvolução quantitativa do sinal.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na identificação de compostos líderes ao minimizar falsos positivos decorrentes de sobreposição espectral ou interferência da autofluorescência.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente ao gerar bibliotecas espectrais que garantem leituras reproduzíveis e quantitativas.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diversos projetos por meio de fluxos de trabalho padronizados de aquisição e separação espectral, reduzindo o tempo de readequação do ensaio.
- Saída Quantitativa: Gera imagens de abundância por fluoróforo, permitindo comparação precisa da intensidade do sinal entre diferentes condições para seleção de alvos positivos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a fidelidade do sinal desde a descoberta até modelos pré-clínicos, corrigindo a autofluorescência e a contaminação espectral.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de prosseguimento ou interrupção fornecendo dados limpos por canal, separados, que refletem o sinal biológico real em vez de artefatos.
- Redução de Riscos Mecanística: Isola sinais de organelas ou compartimentos (por exemplo, mitocôndrias, citosol) para validar o engajamento do alvo em sistemas relevantes para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a otimização do composto líder, no qual leituras fluorescentes multiplexadas são utilizadas para avaliar mecanismo, toxicidade e modulação de vias. Ele permite uma transição confiável entre as equipes de biologia e análises ao fornecer saídas padronizadas e quantificáveis de imagem.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao separar sinais provenientes de múltiplas marcações (por exemplo, GCaMP, corante mitocondrial, autofluorescência) na imagem de células vivas.
- Triagem: Melhora a prontidão do ensaio por meio da aquisição espectral reprodutível e subtração de fundo, aumentando o fator Z e a confiabilidade na identificação de hits.
- Análises: Fornece mapas de abundância desmisturados e métricas de erro que permitem a comparação estatística das contribuições dos fluoróforos entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao garantir que os sinais de fluorescência utilizados como biomarcadores não sejam afetados por vazamento espectral ou autofluorescência.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma biblioteca espectral centralizada e um POP para a aquisição hiperspectral, promovendo consistência entre projetos e reduzindo o desenvolvimento redundante de métodos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir ambiguidades espectrais e melhorar a fidelidade do sinal.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a produtividade por meio de aquisição mais rápida e calibração padronizada utilizando iluminação supercontínua.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir mais dados por amostra e reduzir imagens repetidas devido à fraca separação de sinais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados de imagem mais limpos e interpretáveis para portas decisórias entre as fases de descoberta e pré-clínica.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência, imageamento espectral e ferramentas de processamento de imagens, como ImageJ e MATLAB.
- Depende de fontes de iluminação ajustáveis (por exemplo, laser supercontinuum) e detectores com faixa dinâmica e sensibilidade suficientes.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de aquisição, tempos de exposição e geração de bibliotecas espectrais para resultados reprodutíveis.
- Deve levar em conta a autofluorescência em amostras biológicas, exigindo medições de controle e subtração espectral para evitar contaminação dos espectros dos componentes puros.
- Limitado pelos riscos de fototoxicidade em aplicações com células vivas, exigindo gerenciamento cuidadoso da exposição para preservar a viabilidade da amostra durante a aquisição.
