Name: Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Aprenda a medir a atividade da citrato sintase em homogeneizados de tecido de Drosophila melanogaster sem isolar mitocôndrias. Este ensaio colorimétrico rápido quantifica a massa mitocondrial intacta para estudos de função celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelas subvenções da National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai, do Programa Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e da Fundação de Ciências Naturais Xangai (19ZR1446400).

1. Ensaio de atividade de citrato de citrato colorimtricpara D. melanogaster16
<ol><li>Coletar dez moscas adultas para cada amostra. Coletar pelo menos amostras de triplicado para cada genótipo.</li>
	<li>Prepare 500 μL de tampão de extração de gelo-frio contendo 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% triton X-100 em um tubo de ensaio de 1,5 mL para cada amostra.</li>
	<li>Anestesia adulto voa com CO2 em uma almofada de anestesia e isolar os tecidos desejados. Para isolar os thoraxes adultos da mosca, por exemplo, repara os thoraxes da mosca por um par de fórceps, e isola então os abdômens da mosca cortando ao longo da beira do tórax e do abdômen usando um par de tesouras. Recolher os thoraxes voar para o ensaio de atividade synthase citrato muscular. NOTA: Determine o peso fresco do tecido nesta etapa se usá-lo para normalizar a atividade do synthase da citrata.</li>
	<li>Transfira 10 thoraxes de mosca adulto para 100 μL de tampão de extração de gelo-frio imediatamente e homogeneize com um pilão no gelo. Para manter as amostras geladas, homogeneize as amostras para 5-10 s no gelo, em seguida, ter as amostras sentar no gelo por 5 s, e repita até que todos os tecidos do tubo são homogeneizados completamente. NOTA: Fita do tubo, verifique as homogeneizações para se certificar de que não há coágulos nas homogeneizações e que os tecidos no tubo são homogeneizados completamente. Todos os tratamentos de amostra devem ser realizados no gelo.</li>
	<li>Tome 10 μL de cada amostra homogeneizada em um novo tubo para medição de conteúdo proteico. Mantenha as amostras para medição de proteínano gelo. NOTA: As amostras de proteína podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C para análise posterior. As concentrações de proteínas servem como parâmetro interno para a normalização das atividades de sintetização de citrato.</li>
	<li>Adicione 400 μL de tampão de extração de gelo-frio para cada amostra restante para fazer um volume total de 500 μL. Misture bem por tubulação suavemente para cima e para baixo, pelo menos, 5x, evitando a formação de bolhas. Para cada reação, adicione 1 μL de lysate celular diluída a 150 μL da solução de reação recém-preparada (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetil CoA, 1 m oxaloáptico ácido). Misture bem e imediatamente por tubulação suave, evitando a formação de bolhas. Medir a absorção em 412 nm cada 10-30 s para 4 min em 25 °C usando um leitor de placa capaz de medir a absorção em 412 nm em intervalos mínimos de 10 s. NOTA: Mude a ponta antes de pipetting um reagent diferente e evite dar forma a bolhas nos poços. A mistura incompleta dos reagentes pode causar variações nas medidas. O ensaio de atividade de sintetização de citrato deve ser feito à temperatura ambiente imediatamente após as amostras serem coletadas, pois este ensaio é usado para quantificar a massa mitocondrial intacta. O buffer de reação deve ser preparado imediatamente antes do uso e não deve ser armazenado.</li>
	<li>Dados do enredo como absorção de densidade óptica (OD) (abs) (eixo Y) versus tempo (em minutos) (Eixo X). Em seguida, calcule a inclinação para a parte linear da curva, onde a taxa de reação é <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq1.jpg"> Divida o valor pela concentração de proteína da amostra para normalizar a atividade de sintese de citrato. A atividade de sintese de citrato é calculada como <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq2.jpg"> NOTA: A concentração da proteína da amostra pode ser medida por um jogo do ensaio da concentração da proteína.</li>
</ol>

<ol><li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells%3A+The+Discerning+Killers%21%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!</a> Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).</li>
<li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals%3A+Untangling+the+knot%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li>
<li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction%2C+oxidative+stress%2C+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death & Disease. 5, e984(2014).</li>
<li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li>
<li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate+synthase%3A+structure%2C+control%2C+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li>
<li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
<li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel%2FdPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).</li>
<li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spargel%2FdPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li>
<li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1%2FSpargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li>
<li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster%3A+oxidative+stress%2C+mitochondrial+activity%2C+and+survivorship%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram nenhum conflito de interesses.

Estudos metabólicos usando Drosophila como modelo devem levar em consideração o fundo genético, dieta e manutenção de estoque das moscas18. Para evitar os efeitos de diferentes origens genéticas na medição da atividade de sintese de citrato, diferentes cepas de Drosophila devem ser backcrossed para a cepa de controle por 10 gerações. O fundo genético de todas as cepas drosophila usado em nossos experimentos é w1118, por isso usamos w1118</sup...

As mitocôndrias são mais conhecidas como organelas produtoras de energia na maioria dos organismos eucarióticos, que produzem a moeda energética, atp, através do ciclo de ácido tricarboxílico (ou seja, ciclo Krebs) e fosforialation oxidativo. Mitocôndrias também são encontrados para desempenhar papéis importantes em uma série de outros processos fisiológicos, tais como a regulação da apoptose1, Ca2 + homeostase2,3, espécies de oxidação reativa (ROS) geração4, e reticulum endoplasmic (ER) -resposta ao estresse5. Disfunção mitocondrial pode afetar qualquer órgão do corpo em qualquer idade e é uma das principais causas metabólicas, relacionadas ao envelhecimento6, e doenças neurodegenerativas7. Mitocôndrias intactas estão mecanicamente relacionadas à função mitocondrial. Assim, quantificação adequada da massa mitocondrial intacta é muito importante para avaliar a função mitocondrial8. A sintetização de citrato, uma enzima limitante da taxa na primeira etapa do ciclo do ácido tricarboxílico9,é localizada na matriz mitocondrial dentro das células eucarióticas e, portanto, pode ser usada como um marcador quantitativo para a presença de massa mitocondrial intacta9,10. A atividade de sintese de citrato também pode ser usada como um fator de normalização para proteínas mitocondriais intactas11,12.
A mosca da fruta, Drosophila melanogaster,é um excelente sistema modelo para estudar a função mitocondrial, como muitas moléculas e vias que desempenham papéis fundamentais na mitocôndria são evolutivamente conservados de Drosophila para os seres humanos13,14,15. Aqui, apresentamos um protocolo para um método rápido e simples para a medição da atividade de sinteta de citrato por um ensaio colorimétrico no tecido Drosophila homogeneia16 em um formato de placa de 96 poços. No ensaio de atividade de citrato synthase, citrato synthase no tecido Drosophila homogeneizar catalisa a reação de oxaloacetate com coenzima acetil A (acetil CoA) para formar o citrato CoA-SH e H+. O CoA-SH reage posteriormente com 5,5'-dithiobis(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) para gerar um produto colorido, 2-nitro-5-thiobenzoato (TNB), que pode ser facilmente medido espectrofotomicamente a 412 nm. A atividade de sintetizador de citrato pode ser refletida pela taxa de produção de cores.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanossulfônico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Base TRIZMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900483</td><td></td></tr><tr><td>Acetil-CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ditio-bis-nitrobenzóico (DTNB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Oxaloacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>Pilão de pellets</td><td>Sangon</td><td>F619072</td><td></td></tr><tr><td>Motor de pilão de pellets</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y10</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>BioTek</td><td>Eon</td><td></td></tr><tr><td>Protein BCA Kit de ensaio</td><td>Beyotime</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>WPI</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon</td><td>A110694-0100</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em drosophila melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitocôndrias desempenham os papéis mais proeminentes no metabolismo celular, produzindo ATP através da fosforia oxidativa e regulação de uma variedade de processos fisiológicos. A disfunção mitocondrial é a principal causa de uma série de doenças metabólicas e neurodegenerativas. Mitocôndrias intactas são fundamentais para o seu bom funcionamento. A enzima citrato synthase é localizada na matriz mitocondrial e, portanto, pode ser usada como um marcador de enzima quantitativa de massa mitocondrial intacta. Dado que muitas moléculas e vias que têm funções importantes nas mitocôndrias são altamente conservadas entre humanos e Drosophila,e que uma série de poderosas ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila, Drosophila serve como um bom sistema de modelo para estudar a função mitocondrial. Aqui, apresentamos um protocolo para a medição rápida e simples da atividade de sintese de citrato no tecido homogeneado de moscas adultas sem isolar mitocôndrias. Este protocolo também é adequado para medir a atividade de sintese de citrato em larvas, células cultivadas e tecidos de mamíferos.

A Figura 1 apresenta um exemplo das curvas cinéticas para a absorção de OD em 412 nm ao longo do tempo obtida usando o ensaio colorítrico da atividade synthase citrato para medir as homogeneas do tecido drosophila thorax de diferentes genótipos. É sabido que o PGC-1α é um regulador mestre da biogênese mitocondrial. Pgc-1α é funcionalmente conservado entre Drosophila e os seres humanos. Drosophila Drosophila RNF34 (dRNF34) é uma liga...

Apresentamos um protocolo para um ensaio colorirétrico da atividade de sintese de citrato para quantificação de massa mitocondrial intacta no tecido Drosophila homogeneia.

Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A drosophila serve como um bom sistema de modelo para estudar a função mitocondrial. Aqui apresentamos um protocolo para medir a atividade de sinthase citrato em tecido homogeneado de moscas adultas. Este protocolo não requer isolamento das mitocôndrias.É rápido e simples e é adequado para medir a atividade de sinthase citrato em larvas, células cultivadas e tecidos mamíferos. Comece coletando moscas adultas para cada amostra, certificando-se de coletar pelo menos amostras triplicadas para cada genótipo. Prepare 500 microliters de tampão de extração gelada com HEPES de 20 mililitros, um EDTA mililitro e 0,1% tritão X-100 em um tubo de ensaio de 1,5 mililitro para cada amostra.Anestesiar as moscas adultas com dióxido de carbono em uma almofada de anestesia. Para isolar os tóraxs, fixá-los com um par de fórceps e isolar os abdômens de mosca cortando ao longo da borda do tórax e abdômen com uma tesoura. Colete os tóraxs de mosca para o ensaio de atividade de sinthase citrato.Transfira 10 tóraxs de mosca adultos para 100 microliters de tampão de extração gelada imediatamente e homogeneize-os com um pilão no gelo. Mantenha as amostras frias homogeneizando por cinco a 10 segundos no gelo, deixando-as sentar no gelo por cinco segundos, repetindo-as até que todos os tecidos sejam completamente homogeneizados. Alíquota 10 microliters de cada amostra homogeneizada em um novo tubo para medição de teor de proteínas, mantendo esses tubos no gelo também.Adicione 400 microliters de tampão de extração gelada a cada amostra restante para um volume total de 500 microliters e pipeta para cima e para baixo suavemente para misturar. Para cada reação, adicione um microliter de diluído lysato celular a 150 microliters da solução de reação recém-preparada. Misture bem afim por tubos suavemente, certificando-se de evitar a formação de bolhas, em seguida, use um leitor de placas para medir a absorvância em 412 nanômetros a cada 10 a 30 segundos durante quatro minutos a 25 graus Celsius.Plote os dados como absorvância ao longo do tempo e, em seguida, calcule a inclinação para a porção linear da curva. Por fim, divida a taxa de reação ou inclinação pela concentração de proteínas amostrais para normalizar a atividade de sinthase citrato. Foi hipótese de que o knockdown de dRNF34 no músculo Drosophila aumentaria a atividade de sintetizador mitocondrial enquanto o knockdown de dPGC-1 reverteria esse aumento.Estabeleceu-se uma taxa enzimática linear inicial para cada ensaio;as inclinações das linhas de tendência representam as taxas de reação máxima que são equivalentes às atividades de sinthase citrato maximal dos diferentes genótipos. As atividades máximas de sinthase citrato foram calculadas a partir das curvas cinéticas e normalizadas pela concentração proteica. Os resultados demonstraram que a atividade de synthase dos tóraxes-mosca realmente aumentou com o knockdown dRNF34 específico do músculo e o aumento foi revertido por knockdown dPGC-1 específico para músculos.Ao homogeneizar a amostra, é importante virar o tubo e verificar o homogeneizado para ter certeza de que não há coágulos e que os tecidos do tubo estão completamente homogeneizados. Após a coleta da amostra, todos os tratamentos amostrais devem ser realizados no gelo. O ensaio de atividade de sinthase citrato é usado para quantificar massa mitocondrial intacta.A quantificação adequada da massa mitocondrial intacta é muito importante para avaliar a função mitocondrial.

a-colorimetric-assay-citrate-synthase-activity-drosophila

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Drosophila melanogaster é um sistema modelo de genética e comportamentalmente tratável que tem sido usada para compreender a base molecular e celular de muitos processos biológicos importantes para mais de um século 1. Drosophila tem sido bem explorado para obter insights sobre a base genética do comportamento da mosca.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Este vídeo descreve um ensaio colorimétrico para medir o ensaio de atividade da citrato sintase mitocondrial presente no homogeneizado tecidual de Drosophila.

Ensaio de Atividade de Citrato Sintase: Um Ensaio Colorimétrico para Medir a Atividade da Citrato Sintase Mitocondrial em Homogenato de Tecido de Drosophila

Introdução de moléculas pequenas para o embrião de Drosophila em desenvolvimento oferece um grande potencial para a caracterização de actividade biológica de novos compostos, medicamentos e toxinas, bem como para sondar as vias de desenvolvimento fundamentais. Métodos descritos aqui delinear medidas que superem as barreiras naturais para essa abordagem, ampliando a utilidade do modelo embrião Drosophila.

Um método de permeabilização de<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões para Ensaios de pequena molécula Atividade

Este artigo descreve um método para a medição da oxidação de combustível em Drosophila melanogaster, no qual vestígios de substratos metabólicos radiomarcados específicos são alimentados às moscas. O CO2 radiomarcado exalado que é produzido a partir da oxidação do combustível é coletado e medido.

Medição da produção de dióxido de carbono da Radiolabeled Substratos em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

O ensaio CApillary FEeder (CAFE) é um método simples, econômico e altamente confiável para investigar os mecanismos subjacentes à ingestão de alimentos. Usado com o organismo modelo genético altamente versátil Drosophila melanogaster, ele fornece um meio poderoso de obter novos insights sobre os mecanismos regulatórios da ingestão de alimentos.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Transporte de iões celular muitas vezes pode ser avaliado pelo monitoramento pH intracelular (pHeu). Geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação do pH intracelular em células intactas. Este protocolo detalha a quantificação do pH intracelular através de celular ex vivo ao vivo-imagens de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster com pHerry, um pseudo-ratiometric geneticamente codificado indicador de pH.

PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

O protocolo descreve um ensaio simples para identificar larvas de Drosophila melanogaster que estão enfrentando a hipóxia sob os níveis de oxigénio atmosférico normal. Este protocolo permite hipóxicos larvas ser distinguido de outros mutantes que mostram fenótipos sobrepostos como lentidão ou crescimento lento.

Um ensaio de buraqueira/Tunneling para deteção de hipóxia em larvas de Drosophila melanogaster

Neste trabalho, é descrito um método para medir o consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução em permeabilized avermelhado da drosófila. Esta técnica requer uma quantidade mínima de tecido, em comparação com a técnica de isolamento mitocondrial clássico e os resultados obtidos são fisiologicamente mais relevantes.

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

Apresentamos um protocolo para medição de consumo de oxigênio e a acidificação extracelular nos cérebros de larvas e adultos de Drosophila melanogaster . Um analisador metabólico é utilizado com um protocolo adaptado e otimizado. Microtecido restrições são uma componente essencial do presente protocolo e foram concebidas e criadas especificamente para a sua utilização nesta análise.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

A respirometria coulométrica é ideal para medir a taxa metabólica de pequenos organismos. Quando adaptado para Drosophila melanogaster no presente estudo, o consumo medido de O2 estava dentro da faixa relatada para D. melanogaster selvagem por estudos anteriores. O consumo por mosca O2 pelos mutantes CAS , que são menores e menos ativos, foi significativamente menor do que o selvagem.

Mensuração do Consumo de O2 em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica

Aprenda a medir a atividade da citrato sintase em homogeneizados de tecido de Drosophila melanogaster sem isolar mitocôndrias. Este ensaio colorimétrico rápido quantifica a massa mitocondrial intacta para estudos de função celular.

Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster

Explorar mais vídeos