Name: Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda a analisar os efeitos combinados de miR-143 e miR-506 no ciclo celular e na angiogênese de células de câncer de pulmão. Este método utiliza transfecção celular, extração de RNA e PCR em tempo real para identificar atividade terapêutica de microRNAs.

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<li>Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and the cell cycle.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).</li>
<li>Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+for+highly+parallel+detection+and+quantitation+of+specific+proteins+and+antibodies+in+complex+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions.</a> Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).</li>
<li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Currrent+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Overview of protein microarrays.</a> Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Science Repository. 3, 1860(2013).</li>
</ol>

Os autores gostaria de reconhecer John Caskey na Louisiana State University por sua assistência na análise de dados de sequenciamento do RNA e o Universidade do Texas Southwestern Medical Center, McDermott próxima geração sequenciamento núcleo central para o caminho realizando a análise de dados e sequenciamento de RNA. Esta pesquisa foi apoiada pela faculdade de farmácia, Universidade de Louisiana, Monroe financiamento de start-up e os institutos nacionais de saúde (NIH) por meio do Instituto Nacional de geral médica ciência subsídios 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

os miRNAs pode operar como terapias alvo para tratamento de câncer, reconhecendo a desregulação dos níveis de expressão em doentes vs tecidos normais. Este estudo teve como objetivo determinar os miRNAs que potencialmente interromper a progressão do ciclo celular durante vários estágios. Identificou-se que miR-143 e miR-506 interromper o ciclo celular de células cancerosas e os protocolos apresentados objetivou compreender a atividade deste tratamento miRNA combinatória.
As metodologias descri...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.

Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

O ciclo celular é uma combinação de vários eventos regulatórios que permitem a duplicação de DNA e a célula proliferação através do processo mitótico1. Quinases cyclin-dependente (CDKs) regulam e promovem o ciclo celular2. Entre eles, o CDK mitótica (CDK1) e CDKs interfase (CDK2, CDK4 e CDK6) têm um papel essencial no ciclo celular progressão3. Proteína do retinoblastoma (Rb) é fosforilada pelo CDK4/CDK6 complexo para permitir de progressão do ciclo celular4, e ativação de CDK1 é essencial para o sucesso de divisão celular5. Inibidores CDK numerosas foram desenvolvidos e avaliados em ensaios clínicos ao longo das últimas décadas, indicando o potencial de segmentação CDKs no tratamento do câncer. Na verdade, três inibidores CDK foram aprovados para o tratamento do câncer de mama recentemente6,7,8,9,10. Assim, CDKs, e em particular, a CDK1 e CDK4/6, são de grande interesse na regulamentação da progressão de células de câncer.
os miRNAs (miRs) são RNAs pequenos, não-codificantes e reguladores pós-transcricional da expressão gênica, regulação de aproximadamente 30% de todos os genes humanos11. Sua atividade baseia-se na repressão translacional ou degradação de RNA mensageiro (mRNAs)12. Ilustrativos do seu significado biológico, mais de 5.000 miRNAs foram identificados e uma molécula de miRNA único pode regular vários genes11,13. Mais importante, miRNA expressão tem sido associado com doenças diferentes e status de doenças, incluindo câncer13. Na verdade, os miRNAs foram caracterizados como oncogênicos ou supressores de tumor, sendo capaz de promover ou suprimir tumor desenvolvimento e progressão de14,15. A expressão relativa de miRNAs em tecidos doentes pode regular a progressão da doença; assim, entrega exógena de miRNAs tem potencial terapêutico.
Câncer de pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer e maior do que 60% de todas as neoplasias malignas de pulmão não-pequenas células de pulmão câncer16,17com uma taxa de sobrevida de 5 anos de menos de 20%18. O uso de miR-143-3 p e p miR-506-3 foi avaliado recentemente para o direcionamento os ciclos de celular de células de câncer de pulmão11. miR-143 e miR-506 têm sequências que são complementaridade a CDK1 e CDK4/CDK6, e foram analisados os efeitos destes dois miRs sobre A549 células. Os detalhes experimentais são apresentados e discutidos neste artigo. Expressão gênica, progressão do ciclo celular e apoptose foram avaliados usando diferentes desenhos experimentais e momentos seguindo do transfection. Usamos métodos quantitativos em tempo real do PCR (RT-qPCR) juntamente com a análise de microarray para medir a expressão de genes específicos, e a sequenciação do ARN de próxima geração foi usada para determinar o gene global desregulagem11. O último método identifica a abundância relativa de transcrição do gene cada com alta sensibilidade e reprodutibilidade, enquanto milhares de genes podem ser analisados a partir de uma única análise experimental. Além disso, análise de apoptose devido ao tratamento de miRNA foi realizada e está descrito aqui. Bioinformática completada a análise de percurso. Aqui apresentados são protocolos usados para análise da terapêutica potencial de miR-143 a combinatória e miR-506.
O principal objectivo do presente protocolo é identificar os efeitos de miRNAs nas células, com um foco sobre o ciclo celular. A variedade das técnicas aqui apresentadas extensão de análise de expressão do gene tradução prévia (usando qPCR) para elaborar e novela técnicas para análise do gene no nível da proteína, tais como análise de microarray. Espera-se que este relatório é útil para pesquisadores interessados em trabalhar com os miRNAs. Além disso, é apresentada a metodologia para análise de fluxo cytometric do ciclo celular e apoptose de células.

<table><tbody><tr><td>-80 &deg; C Freezer</td><td>VWR</td><td>VWR40086A</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços</td><td>CELLTREAT Scientific&nbsp;</td><td>50-607-511</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Micropoços de 96 poços&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>A549 Células de Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>0710-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalisador</td><td>Silenciador Ambion Agilent Technologies</td><td>G2938c</td><td></td></tr> Controle <tr><td>Negativo No. 1 siRNA</td><td>Ambion</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Solução Antibiótica-Antimicótica (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Anticorpos, 2 Reações</td><td>Lua Cheia Bio</td><td>KAS02</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de campo brilhante&nbsp; &nbsp;</td><td>Microscóptica&nbsp;</td><td>IV-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de campo brilhante&nbsp; &nbsp;</td><td>Novo Star Environment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides</td><td>Full Moon Bio</td><td>ACC058</td><td></td></tr><tr><td>Cell Logic+ Biosafety Cabinate</td><td>Labconco</td><td>342391100</td><td></td></tr><tr><td>Cellquest Pro</td><td>BD bioscience Passos</td><td>5.14; 6.13: Usado para calcular a distribuição da população de acordo com a fase do ciclo celular e para calcular a distribuição da população para a análise de apoptose&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Tempo Real CFX96</td><td>Módulo</td><td></td>de <td>Óptica BioRad CFX96</td></tr><tr><td>Sistema de Imagem de Toque Chemidoc</td><td>Sistema</td> de Imagem de <td>Toque</td><td></td>BioRad</tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Membrana de Pouso com Fator de Crescimento Reduzido Cultrex Câmera</td> Digital <td>Trevigen</td><td>3433-010-01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AmScope&nbsp;</td><td>FMA050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L de glicose, sem piruvato de sódio, com L-glutamina</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Suplemento de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crescimento de Células Endoteliais (ECGS)</td> <td>BD Biosciences</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos Eppendorf Pipeta Pick-A-Pack Eppendrof</td><td></td><td>05-403-152</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Absoluto (200 Provas), Molecular Grau de Biologia,&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Alfa acar</td><td>L07462</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Mistura de Nutrientes (Mod de Kaighn) com L-glutamina, Corning Corning</td><td></td><td>45000-354</td><td></td></tr><tr><td>FACS Citômetro de Fluxo Calibur Soro</td> Fetal <td>Bovino Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Premium</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Basix Tubos de Microcentrífuga com Tampas de Pressão Padrão</td><td>Fisherbrand Basix</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 de Jaqueta de Água Forma Série II</td> Solução de Heparina <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5000 U/mL)</td><td>Hospira</td><td>NDC#63739-920-11</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese Horixontal</td><td>Bancada sistema de laboratório</td><td>BT102</td><td></td></tr><tr><td>tem-miR-143-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH01315</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-506-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH02824</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Endotelial Vascular Recombinante Humano (VEGF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)</td><td>Doadores individuais</td><td>IRB# A15-3891</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td>Resultados: Usado para análise</td><td></td>de vias de bioinformática</tr><tr><td>Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10-977-015</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11-668-027</td><td></td></tr><tr><td>Carregando corante 10X</td><td>ward's science+</td><td>470024-814</td><td></td></tr><tr><td>Médio M199 (com Earle&prime; sais, L-glutamina e bicarbonato de sódio)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Câmera Digital</td><td>AmScope&nbsp;</td><td>MU130</td><td></td></tr><tr><td>Modfit LT</td><td>Verity Software</td><td>Etapa 5.15: Software alternativo para análise de distribuições</td><td></td>populacionais do ciclo celular</tr><tr><td></td><td>Nanodrop Thermo Scientific</td><td>NanoDrop one C</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina 10/10</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>B21210</td><td></td></tr><tr><td>Power UP sybr green master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>MP Biochemicals LLC</td><td>IC19545825</td><td></td></tr><tr><td>Proscanarray HT Microarray scanner</td><td>Perkin elmer</td><td>ASCNPHRG. Usamos o comprimento de onda do laser de excitação em 543 nm.</td><td></td></tr><tr><td>q Capa adesiva óptica PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA Kits</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express</td><td>PerkinElmer</td><td>Etapa 7.33: Software</td><td></td>de análise de microarray</tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador SimpliAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga SpectraTube 15ml</td><td>VWR</td><td>470224-998</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga SpectraTube 50ml</td><td>VWR</td><td>470225-004</td><td></td></tr><tr><td>TBS Tampão, 20x líquido</td><td>VWR</td><td>10791-796</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura controlada&nbsp; centrífuga matchine</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrífuga com temperatura controlada</td><td>Eppendrof</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific BioLite Frascos tratados</td><td>com cultura de células Thermo Scientific</td><td>12-556-009</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI23225</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Thermo</td><td>Scientific</td><td>PI89900</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Saia Completa Thermo-Fast Thermo-Fast 96-Well</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0800WL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Verso Kit de Síntese de cDNA (100 execuções)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Range DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>VWR refrigerador de laboratório de porta sólida padrão</td><td>VWR VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise de combinatória mirna tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

Câncer de pulmão (LC) é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Semelhante a outras células de câncer, uma característica fundamental das células LC é a proliferação desregulada e divisão celular. Inibição da proliferação de travar a progressão do ciclo celular tem demonstrada ser uma abordagem promissora para o tratamento de câncer, incluindo o LC.
miRNA terapêutica têm emergido como reguladores do importante gene pós-transcricional e cada vez mais estão sendo estudadas para uso no tratamento do câncer. Em recente trabalho, utilizamos dois miRNAs, miR-143 e miR-506, para regular a progressão do ciclo celular. Células de câncer (NSCLC) de pulmão não-pequenas células A549 foram transfectadas, analisaram-se alterações de expressão de gene e atividade apoptotic devido ao tratamento foi finalmente analisada. Downregulation de quinases cyclin-dependente (CDKs) foram detectados (i.e., CDK1, CDK4 e CDK6), e o ciclo celular parou nas transições de fase G1/S e G2/M. Análise do caminho indicado potencial atividade antiangiogênica do tratamento, que dota a abordagem com atividade multifacetada. Aqui descritos são as metodologias utilizadas para identificar a atividade de miRNA relativas à inibição do ciclo celular, indução da apoptose e efeitos do tratamento em células endoteliais através da inibição da angiogênese. Espera-se que os métodos apresentados aqui vão apoiar pesquisas futuras na terapêutica de miRNA e atividade correspondente e que os dados representativos guiará outros pesquisadores durante as análises experimentais.

Análise da expressão de gene usando a electroforese do gel e RT-qPCR
Análise da expressão de genes diferencial usando RT-qPCR demonstrou significativa downregulation de genes alvo CDK1, CDK4 e CDK6. CDK1 e CDK4/6 foram mostrados para ser instrumental para o G2/M e transições de G1/S, respectivamente. A análise realizada permitiu a comparação directa entre miRs individuais e atividade combinatória miR. O uso de s...

miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

Este método ajudará a entender e executar técnicas de laboratório necessárias para identificar a atividade de dois microRNA em células cancerígenas de pulmão in vitro. O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Aqui, apresentamos técnicas que abrangem desde metodologias básicas de laboratório até protocolos mais complexos, como análise de expressão genética e microRNA de proteína de anticorpos, especificamente utilizados para identificar o efeito das ações do microRNA.Os seguintes métodos nos ajudarão a responder a perguntas-chave sobre o efeito de dois microRNAs, microRNA 143 e microRNA 506, sobre a regulação do ciclo celular em células cancerígenas de pulmão. Apresentamos diferentes técnicas de laboratório, como transfecção celular, extração de RNA, análise quantitativa de PCR em tempo real e microRNA. Esperamos que nossa apresentação contribua para concluir com sucesso essas análises.Primeiro, acomodar as células cultivadas em um frasco apropriado suficiente para extração de RNA e proteína, para realizar a expressão genética usando qPCR ou análise de micro array. Em seguida, incubar durante a noite com mídia suplementada com 10% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina. No dia seguinte, prepare a amostra de microRNA para transfecção diluindo o microRNA 143 e o microRNA 506 em mídia a uma concentração de 100 nanomolar cada.Tire o frasco da incubadora e remova a mídia. Lave com 1x PBS. Todos os controles não tratados conterão apenas mídia incompleta com células.Incubar as células com mídia de transfecção por seis horas em uma incubadora. Após seis horas, remova a mídia e substitua por quatro mililitros de mídia fresca e completa. Colher as células após 24 horas e 48 horas por experimentação.Em seguida, lave duas vezes com 1x PBS em cada tubo e remova o supernasciente. A fim de realizar a extração de RNA mais tarde, congele as células a menos 80 graus Celsius. A extração de RNA foi realizada utilizando-se um kit RNA, seguindo as instruções do fabricante.Primeiro, remova os tubos de menos 80 graus Celsius e deixe descongelar. Adicione 300 microliters de tampão de lise e pipeta para cima e para baixo para quebrar a membrana celular. Adicione o mesmo volume de 100% de etanol ultra-puro.Em seguida, misture bem e coloque em coluna separada. Centrifugar e remover o fluxo. Adicione 400 microliters de lavagem e tampão e centrífuga para remover o buffer.Adicione 5 microliters de DNAse 1 com 75 microliters VNA tampão de digestão em cada amostra e incubar por 15 minutos. Em seguida, lave a amostra com 400 tampão de preparação de RNA microliter. Em seguida, lave duas vezes com tampão de lavagem de RNA.Agora, adicione água sem nuclease à coluna, centrífuga e, em seguida, colete o RNA. Meça a concentração de RNA. Nesta fase, dois microgramas de amostra de RNA podem ser enviados para o sequenciamento de RNA.Prepare o cDNA de acordo com o protocolo descrito na seção texto, usando termociclador. Prepare soluções de primer para frente e invertida com água livre de DNAse RNAse para uma concentração de 10 micromolar. Prepare uma mistura mestra para que cada gene seja detectado de acordo com o número de amostras.Para cada amostra de cDNA, a quantidade de reação é de acordo com a tabela descrita no texto. Coloque cada amostra em seus respectivos poços. Para qPCR, é sempre bom preparar um documento Excel com layout de placa de 96 poços, a fim de acompanhar as amostras.Para cada amostra e gene analisado, realize sua reação em triplicados, ou pelo menos duplicados. Sele a placa de plástico com um selador plástico transparente e opticamente transparente. Evite tocar na fina camada plástica com os dedos, pois isso pode produzir sinal falso.Gire rapidamente a placa para misturar todos os reagentes ao fundo de seus poços. Em seguida, execute a placa de amostra usando uma máquina PCR quantitativa em tempo real. Obtenha os valores de TC gerados pela máquina qPCR e analise para a expressão genética relativa.Transfeito as células como descrito na seção anterior deste vídeo. Células de colheita de cada amostra em tubos estéreis separados de 15 mililitros para trippsinização. Em seguida, lave as células duas vezes com 1x PBS, por centrifugação a 751G por cinco minutos, e depois remova o supernante.Suspenda e quebre a paleta adicionando 200 microliter gelado 1x PBS através de uma pipeta. Adicione dois mililitros de 70% de etanol gelado, em termos de gota ao tubo, enquanto o vórtice do tubo suavemente para consertar as células. Incubar tubos por 30 minutos em temperatura ambiente e colocá-los em quatro graus Celsius por uma hora.Remova os tubos de quatro graus Celsius e centrífuga. Adicione 2ml de PBS gelado e vórtice e, em seguida, remova o sobrenatante por centrifugação. Adicione 500 microliters de 1x PBS contendo iodeto de propídio e ribonuclease A com concentração de 50 e 200 microgramas por mililitro, respectivamente, em cada amostra, e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.Transfira amostras para tubos apropriados, protegendo da luz e execute em citômetro de fluxo. Este experimento é identificar toda a expressão das proteínas da via do ciclo celular alterada pelo tratamento microRNA. Coletar amostras de proteína de acordo com o procedimento descrito na seção de transfecção e quantificar com o ensaio BCA.Remova os slides de menos quatro graus Celsius uma hora antes do experimento para trazer à temperatura ambiente e remover a umidade. Pegue 70 microgramas de amostras de proteínas e prepare slides de amostra de acordo com as instruções do fabricante, que também é descrito passo a passo na seção de texto. Aqui para notar, a lavagem adequada de lâminas com água deionizada ultra-pura é outro passo importante, pois isso ajudará a reduzir o fundo dos slides.Além disso, é muito crítico neste experimento não secar os slides da amostra até a etapa final. Finalmente, escaneie o slide usando a máquina de micro array e analise os dados. A análise qPCR das amostras tratadas com microRNA ocorreu para determinar a expressão genética de CDK1, CDK4 e CDK6.Esses genes regulam o ciclo celular de células normais e cancerosas, e têm sido alvo como um meio de inibir a progressão do tumor. Os dados demonstraram o efeito de baixa regulação desses genes devido ao tratamento com microRNA 143 e 506. Os dados de distribuição do ciclo celular da citometria de fluxo demonstraram um aumento populacional na fase G0 e G1, e uma diminuição populacional na fase S devido ao efeito do tratamento combinatório do microRNA 143 e 506.A análise específica de micro array do ciclo celular detectou alterações na expressão proteica de aproximadamente 60 genes. O mapa de calor representado indicou a baixa regulação no nível proteico de múltiplos genes necessários para a progressão do ciclo celular e proliferação, como CDK2, Helen 1 e 3, RE2F1. Em contraste, as proteínas comumente reconhecidas pelo seu efeito inibidor crescido foram reguladas.Embora os resultados sejam semi-quantitativos e uma análise mais aprofundada seja necessária, a análise de micro array fornece uma visão geral rápida da atividade da via. Acreditamos que, depois de assistir a este vídeo, você será capaz de realizar experimentações de laboratório fundamentais, bem complexas, que irão ajudá-lo na identificação da atividade de microRNA nas células.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A Biblioteca de ID de destino é um plasmídeo baseado em coleta de todo o genoma de cDNA clonado usado para identificar alvos miRNA. Aqui nós demonstrar o seu uso e aplicação.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

Este vídeo descreve o protocolo de extração de RNA de células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA. Essa abordagem pode ser usada para identificar uma atividade de tratamento combinatório de miRNA na interrupção do ciclo celular e da angiogênese.

Ensaio de extração de RNA: um método para extrair RNA de células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA

miRNA ou microRNA são os principais reguladores da progressão do ciclo celular. Este vídeo descreve uma análise do ciclo celular baseada em citometria de fluxo de células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA, para estudar o efeito do miRNA na regulação do ciclo celular. A inibição da proliferação pela interrupção da progressão do ciclo celular mostrou potencial para ser uma abordagem promissora para o tratamento do câncer.

Análise do ciclo celular: uma abordagem para estudar a regulação do ciclo celular de células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA

Este vídeo descreve a técnica para estudar a expressão de proteínas em células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA usando microarray de anticorpos para medir a expressão gênica específica. No protocolo apresentado, realizamos microarray de anticorpos para a identificação da atividade de um tratamento combinatório de miRNA na interrupção do ciclo celular e angiogênese.

Microarray de anticorpos: uma técnica para estudar a expressão proteica de células de câncer de pulmão tratadas com miRNA

Este vídeo demonstra a entrega in vivo de inibidores de miRNA como agentes terapêuticos contra o crescimento tumoral em modelos ortotópicos de camundongos. A administração intratumoral de inibidores sintéticos de miRNA ou antagomiRs permite que eles se liguem e inibam miRNAs endógenos, causando assim a regulação positiva do mRNA e a supressão do crescimento tumoral.

Modelagem do tratamento intratumoral com inibidores de miRNA: um método para analisar o efeito dos inibidores de miRNA no crescimento tumoral em modelo murino

Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

É descrito aqui um protocolo para caracterizar os módulos de miRNAs biologicamente sinérgica e seu conjunto em transgenes curtos, que permite o superexpressão simultâneo para aplicações da terapia de Gene.

Caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.

Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a analisar os efeitos combinados de miR-143 e miR-506 no ciclo celular e na angiogênese de células de câncer de pulmão. Este método utiliza transfecção celular, extração de RNA e PCR em tempo real para identificar atividade terapêutica de microRNAs.

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

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