Estabelecimento e caracterização de três linhagens de células PC-9 de adenocarcinoma de pulmão resistentes ao Afatinib desenvolvidas com doses crescentes de Afatinib

O estudo de novos mecanismos de resistência adquiridos contribuirá para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes e seguras em pacientes com câncer resistente ao agente cancerígeno e ressecáveis. Infelizmente, os casos em que a resistência às drogas não se desenvolveu geralmente não são relatados. Este método de escalonamento de dose stepwise é considerado a técnica mais confiável para a obtenção de células de resistência adquirida.

Para determinar a concentração adequada de resistência ao afatinib, cultura células PC-9 em meio de crescimento em um prato tratado de cultura celular de 10 centímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Resuspenque as células PC-9 em quatro células de quatro a quatro por mililitro de concentração média de crescimento, e acontece as células a 50 microliters de suspensão celular por poço em uma microplata de 96 poços. Após uma incubação durante a noite na incubadora de cultura celular, trate as células com 50 microliters de solução de afatinibe por poço, a seis réplicas das concentrações indicadas, e após uma incubação de 96 horas na incubadora de cultura de cull, adicione 15 microliters de corante MTT a cada poço.

Após quatro horas na incubadora de cultura celular, adicione 100 microliters de solução de solubilização/parada a cada poço, e devolva a placa à incubadora durante a noite. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica em 570 nanômetros em um leitor de microplacões. Para exposição contínua ao afatinib, cultura células PC-9 em pratos P-100 contendo 10 mililitros de meio de crescimento até que as células atinjam a subconfluência.

Transfira as culturas subconfluentes em três novos pratos P-100 de nove mililitros de meio de crescimento por prato de cultura inicial, e devolva as células para a incubadora de cultura celular. Na manhã seguinte, adicione 0,1 nanomolar, ou 1/10 da concentração inibitória semi-máxima de afatinib, a cada conjunto de três pratos culturais. Quando as células tratadas com afatinib se tornarem subconfluentes, use uma pipeta de um mililitro para misturar completamente as culturas, e transfira um mililitro de células de cada prato para nove mililitros de meio de crescimento fresco em novos pratos P-100.

Adicione concentrações de afatinibe de 10% a 20% maiores às novas culturas, aumentando a concentração de afatinibe por escalonamento de dose passo a passo cada vez que as culturas atingem a subconfluência durante um período de 10 a 12 meses. Quando uma concentração de afatinib de um micromolar é atingida, realize o ensaio MTT como demonstrado para confirmar que as células desenvolveram resistência afatinib. Para determinar a curva de crescimento das linhas celulares, cultura parental PC-9 e as três linhas celulares resistentes ao afatinib em meio de crescimento na incubadora de cultura celular por 24 horas.

Resuspend as células de cada cultura em uma célula cinco vezes 10-10-para-o-terço por mililitro de concentração média de crescimento, e assento 12 100-microliter replica de cada população celular por poço em uma microplato de 96 poços. Em seguida, realize o ensaio MTT nos dias zero, um, dois, três, cinco e sete da cultura como demonstrado, e plote os resultados usando um programa de análise estatística apropriado. Para identificar alterações no receptor do fator de crescimento epidérmico, ou expressão de DNA genômico EGFR, por análise da cadeia de polimerase de transcriptase reversa, isole o DNA genômico da cultura celular de interesse usando um kit de purificação de DNA de acordo com as instruções do fabricante.

Meça a concentração de 25 concentrações de nanograma-microliter do DNA genômico isolado em um espectrofotômetro. Em seguida, amplie 50 nanogramas de DNA genômico usando uma mistura mestre verde SYBR, e analise os resultados usando um sistema de detecção de reação em cadeia de transcriptase reversa baseado em fluorescência. Para identificar alterações na expressão de DNA genômico EGFR por sequenciamento, amplie o DNA genômico usando primers específicos para exons EGFR 19 a 21.

Em seguida, purifique os produtos PCR amplificados usando um kit de purificação PCR de acordo com as instruções do fabricante e sequencie os amplicons. Para identificar alterações na expressão de proteína do receptor do fator de crescimento epidérmico pela análise da mancha ocidental, trate as células com afatinibe por 24 horas. Depois de 24 horas, lave as culturas celulares duas vezes com cinco mililitros de PBS gelado por cultura por lavagem.

Lyse as células em tampão de ensaio radioimunoprecipitação, complementado com coquetel inibidor de 1%protease e inibidores de fosfatase coquetel dois e três por 30 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, recolhe os lises por centrifugação. Use o ensaio de ácido bicinchonínico para determinar a concentração proteica das amostras de lisato.

Ajuste as amostras de proteínas para 0,5, ou um micrograma por concentrações de microliter, em tampão de amostra de 4 X, e ferva as amostras a 96 graus Celsius por cinco minutos. Para a análise das manchas ocidentais das amostras, monte placas de vidro e espaçadores limpos com etanol e carregue o molde com um gel de poliacrilamida de 8% com os suplementos experimentais apropriados. Enquanto o gel estiver polimerizando, adicione a solução de gel de empilhamento a um molde apropriado, insira o pente e deixe o gel de empilhamento polimerizar por 20 a 30 minutos à temperatura ambiente.

Quando ambos os géis tiverem polimerizados, coloque-os no aparelho de eletroforese e encha o tanque com tampão de corrida. Em seguida, carregue um volume de 20 a 30 microliter de cada amostra de proteína em cada poço, e execute o gel a 180 volts. Pare a eletroforese após aproximadamente 60 minutos, uma vez que a frente de corante flua para fora do gel, e lave o gel com soro fisiológico tris-tampão, complementado com Tween, por um a dois minutos.

Transfira as proteínas para uma membrana de flúor de polivinida por manchas semi-secas por uma e meia hora em uma corrente constante de 300 miliamperes. Bloqueie a membrana com leite seco 5% sem gordura diluído com solução salina tris-tamponada mais Tween por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, teste a membrana com os anticorpos apropriados de interesse a quatro graus Celsius durante a noite.

Na manhã seguinte, lave as membranas com três lavagens de 10 minutos de soro fisiológico fresco por lavagem antes de expor a membrana ao anticorpo secundário apropriado por uma a uma e 1/2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, lave a membrana cinco vezes com soro fisiológico fresco por lavagem e exponha a membrana à solução aprimorada de chemiluminescência para visualização de sinais usando filmes. Aqui, ilustra-se a diminuição observada na proliferação celular das células pc-9 parentais em resposta ao aumento das concentrações de afatinibe, confirmando que as células PC-9 são sensíveis à exposição ao afatinibe.

No entanto, nenhuma das três linhas celulares resistentes ao afatinib demonstra uma supressão da proliferação celular sob exposição afatinibe. As linhas celulares resistentes ao afatinib apresentam curvas de crescimento significativamente mais lentas do que as células pc-9 parentais. As células resistentes ao afatinib expressam níveis significativamente mais elevados de DNA genômico EGFR e expressão proteica EGFR do que as células pc-9 parentais.

O sequenciamento EGFR demonstra que as células PC-9 exibem 15 exclusões de pares de base no EGFR exon 19, e do tipo selvagem EGFR no exon 20. As células de linha de células resistentes afatinib, no entanto, exibem uma amplificação do exon EGFR tipo selvagem 19. As células da linha de células resistentes ao afatinib contêm as mesmas exclusões de par de 15 bases em exon 19 EGFR como em células PC-9, mas uma mutação de ponto em T790M é observada no exon EGFR 20.

O crescimento celular pode se tornar bastante lento quando a concentração do inibidor está perto do valor IC-50. Não discuta cultura, pois a célula continuará a proliferar gradualmente. Essas estratégias foram desenvolvidas para imitar as condições em que os pacientes com câncer desenvolvem resistência clinicamente relevante para avaliar mecanismos de resistência adquiridos e desenvolver estratégias terapêuticas seguras e eficazes.