Name: Modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de CRE-expressando Adenovirus na glândula mamária do mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprenda a modelar câncer de mama por injeção intraductal de adenovírus expressando Cre em glândulas mamárias de camundongos. Este método permite manipulação específica de eventos oncogênicos sem cruzamentos extensivos.

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Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) conceder R01 CA222560 e pelo departamento de defesa Breakthrough Award W81XWH-18-1-0037.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) do Brigham and Women ' s hospital.
1. geração e manutenção de camundongos floxed
<ol><li>Obtenha nocaute condicional com o câncer de mama relevante (por exemplo, Trp53tm1Brn [referido como Trp53l/l], Brca1tm1Aash [Brca1l/l]) ou linhas de mouse condicionais de Knock-in (por exemplo, Gt (rosa) 26SorTM1 (PIK3CA * H1047R) Egan) do repositório do laboratório de Jackson (JAX) ou do NCI mouse modelos de consórcio de câncer humano (MMHCC). Além disso, para facilitar a perseguição de MECs que passam por recombinação mediada por CRE, uma linha CRE-repórter condicional também pode ser obtida do JAX (por exemplo, gt (rosa) 26SorTM1 (eyfp) cos [referido como R26Y]).</li>
	<li>Produza camundongos homozygous de Trp53L/l com R26Y camundongos homzygous do repórter ou com os ratos homozygous que carreg os alelos do repórter R26Y e todo o nocaute condicional floxed adicional ou Knock-in alelos para diferente modelos do rato, para obter o macho e fêmea heterozygous de F1 progeny.</li>
	<li>Camundongos machos e fêmeas heterozygous de intercross F1 para obter os ratos fêmeas compostos F2 que são homozygous para cada alelo (como ratos experimentais), as well as fêmeas homozygous de R26Y-only (como ratos do controle). Camundongos F2 de genótipo com base nos primers de PCR e nas condições de ciclismo listados abaixo, configurando duas reações de PCR padrão de 20 μL (usando Taq 5X Master Mix) em dois tubos de PCR diferentes, um com os primers R26Y e outro com o Trp53L primers. Use camundongos adultos (tipicamente em torno de 2 – 4 meses de idade) para todos os reprodutores.<ol>
<li>Para R26Y, realize o PCR em 94 ° c por 3 minutos, a seguir em 94 ° c para 30 s, 60 ° c para 30 s, e 72 ° c por 1 minuto para 35 ciclos, seguidos por 72 ° c por 3 minutos, e manutenção em 14 ° c. Use primers (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG. Nota: uma única faixa do PCR de 250 BP indica um homozygote R26Y , uma única faixa do pcr de 500 BP indica um selvagem-tipo (WT), e duas faixas do PCR (R26Y: 250 bp, peso: 500 BP) indicam um Heterozygote R26Y (Figura 1a). Para Trp53L, execute o PCR em 94 ° c por 3 minutos, então em 94 ° c para 30 s, 60 ° c para 30 s, e 72 ° c para 1 minuto para 35 ciclos, seguidos por 72 ° c por 3 minutos, e manutenção em 14 ° c. Use primers (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (II) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA mordaça AC. Nota: uma única faixa do PCR de 370 BP indica um homozygote de Trp53l/l , uma única faixa do PCR de 288 BP indica um Trp53+/+ WT, e duas faixas do PCR (WT: 288 BP, Trp53l: 370 BP) indicam um Trp53l /+ heterozigoto (Figura 1b).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação pré-operatória
<ol><li>Autoclave todas as ferramentas cirúrgicas 1 dia antes da cirurgia.</li>
	<li>Prepare 0,1% de azul de bromofenol em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e guarde-o a 4 ° c. Diluir o AD-cre que será usado para a injeção intraductal em meio DMEM com 0, 1 M CaCl2 e azul de bromofenol em uma proporção de 1:10 (ou seja, a mistura de injeção). Nota: o AD-CRE utilizado aqui foi obtido a partir da Universidade de Iowa viral vector Core, com um título viral de ações de ~ 1010– 1011 pfu/ml.</li>
	<li>Anestesie o rato fêmea (geração F2 como descrito na etapa 1,2, idade variando de 3 – 4 semanas de idade para adulto) usando uma câmara de isoflurano e aplique pomada ocular. Durante o procedimento, Anestesie o rato continuamente assegurando-o inala 1%-isoflurano de 2.5% no oxigênio. Verifique a profundidade da anestesia pelo menos a cada 15 min, realizando uma pitada de dedo do pé. Monitore com cuidado o rato para toda a mudança na taxa respiratória, ajustando o nível do isoflurano conformemente, se necessário.</li>
	<li>Injetar Meloxicam como analgesia por via subcutânea na dose de 5 mg/kg, antes do procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Expor o sítio cirúrgico do mamilo aplicando várias gotas de creme de depilação; Remova o creme excessivo e o cabelo frouxo usando toalhas de papel macias. Nota: execute esta etapa em uma área separada de onde a cirurgia deve ser executada. Barbear não é recomendado a fim de evitar danos aos mamilos. Use o cuidado para remover o agente depilatório químico em uma forma oportuna. Deixar o agente por muito tempo pode resultar em queimadura química para a pele</li>
	<li>Desinfete o local cirúrgico com Iodóforos primeiramente, seguido pelo álcool de 70%, e termine com uma aplicação final de esfregue Iodóforos. Faça isso em um movimento circular do centro da área de trabalho em direção à periferia usando uma esponja de gaze ou aplicador com ponta de algodão. Repita o ciclo 3x – 4x.</li>
</ol>3. injeção intraductal
<ol><li>Use técnicas assépticas durante todo o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Faça um local de incisão sobre a pele a um comprimento de ~ 1 cm entre os dois quarto MGs inguinal (Figura 2). Separe cuidadosamente a aleta da pele (com o magnésio) do peritônio parietal para visualizar a árvore ductal mamária.</li>
	<li>Segure com cuidado o bocal com o fórceps do relojoeiro e remova o bocal exterior sem cortar nenhuma pele próxima, usando uma tesoura da microdissecção.</li>
	<li>Carga ~ 3 – 5 μL de mistura de injeção de AD-CRE numa seringa Hamilton de 25 μL com uma agulha de 33 G de cubo metálico afixada. Estimar o volume da mistura de injeção na seringa com base no corante azul incluído na mistura. Nota: Use um volume menor (por exemplo, 3 μL) ao injetar em MGs de fêmeas de 3 – 4 semanas de idade e um volume maior (por exemplo, 10 μL) ao injetar em MGs de fêmeas lactantes.</li>
	<li>Segure delicadamente a borda da aleta da pele com um pinça curvado fino e injete a mistura da injeção de AD-CRE lentamente no bocal, entrementes monitorando a propagação do corante azul na árvore ductal mamária. Manter a taxa de injeção tão baixa quanto possível para evitar danos ao lúmen ductal. Nota: o líquido injetado (como ilustrado pela tintura azul de bromofenol incluída) que espalha durante todo a árvore ductal inteira sem escape no compartimento stromal indica uma injeção intraductal bem sucedida.</li>
	<li>Retire suavemente a agulha do bocal para evitar qualquer vazamento do fluido injetado.</li>
	<li>Examine o lado distal (ou seja, longe do mamilo) do MG ou da área circundante do bocal injetado. Note que o inchaço da tintura azul (ou seja, a difusão da tintura para o estroma nas proximidades) indica uma injeção mamária de gordura pad em vez de uma injeção intraductal bem sucedida.</li>
	<li>Feche as feridas cirúrgicas (da etapa 3,2) na pele com grampos da ferida.</li>
</ol>4. cuidados pós-operatórios
<ol><li>Retire o mouse da anestesia e colocá-lo em uma almofada de aquecimento dentro de uma gaiola limpa para a recuperação.</li>
	<li>Administrar Meloxicam por via subcutânea em 5 mgs/quilograma outra vez, 24 h após a cirurgia.</li>
	<li>Monitore as condições gerais do animal e procure sinais de infecção no local da incisão por 5 dias.</li>
	<li>Os grampos da ferida são removidos ~ 7-10 dias após a cirurgia.</li>
</ol>5. acompanhamento do desenvolvimento do tumor mamário
<ol><li>Monitore os camundongos injetados duas vezes por semana por palpação para qualquer sinal de desenvolvimento do tumor mamário.</li>
	<li>Uma vez que o tumor é palpável, monitore o rato diariamente e meça o tamanho do tumor até que alcangue o valor-limite experimental, como determinado pelo tamanho (por exemplo, alcangando 10%-15% do peso de corpo do rato) ou a circunstância (por exemplo, ulcerada ou Necrotic) do tumor, ou pelo estado geral de saúde do rato (por exemplo, Comatose, moribundo).</li>
	<li>Eutanizar o rato por dióxido de carbono asfixia, seguido por um método secundário (por exemplo, luxação cervical).</li>
	<li>Isolar os tecidos do tumor mamário e analisá-los por citometria de fluxo, imunofluorescência ou perfil de expressão (por exemplo, por sequenciamento de RNA [RNAseq] ou microarray), como descrito anteriormente12.</li>
	<li>Realizar análise citométrica de fluxo por gating para células linhagem-negativas (Lin-: negativo para marcadores de linhagem CD45 [marcador de leucócitos], CD31 [marcador de células endoteliais] e TER119 [marcador de eritrócitos]), e analisar as células do tumor com base em sua expressão de YFP, CD24 e CD29.</li>
</ol>

<ol><li>Wagner, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).</li>
<li>Selbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+BLG-Cre+mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).</li>
<li>van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX1%2C+a+transcription+factor+mutated+in+breast+cancer%2C+controls+the+fate+of+ER-positive+mammary+luminal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells.</a> eLife. 3, e03881(2014).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Long-Lived+Luminal+Subpopulation+Enriched+with+Alveolar+Progenitors+Serves+as+Cellular+Origin+of+Heterogeneous+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mutation+of+Brca1+in+mammary+epithelial+cells+results+in+blunted+ductal+morphogenesis+and+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation.</a> Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV6-NTRK3+fusion+oncogene+initiates+breast+cancer+from+committed+mammary+progenitors+via+activation+of+AP1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex.</a> Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+loss+of+BRCA1+and+p53+in+mice+induces+mammary+tumors+with+features+of+human+BRCA1-mutated+basal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+multipotency+by+oncogenic+PIK3CA+induces+breast+tumour+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity.</a> Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).</li>
<li>Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+p53+loss+in+mouse+luminal+cells+causes+clonal+expansion+and+development+of+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours.</a> Nature Communications. 8, 14431(2017).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+of+Mammary+Epithelial+Cells+Using+Cell-Type-Specific+Cre-Expressing+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>The Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+21+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The life history of 21 breast cancers.</a> Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).</li>
<li>Abba, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+Portrait+of+High-Grade+Ductal+Carcinoma+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ.</a> Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O sucesso desta aproximação para induzir tumores mamária das subpopulações diferentes dos MECS confia não somente em escolher o Cell-Type-específico apropriado promotores (para conduzir a expressão de CRE) mas igualmente no procedimento intraductal da injeção próprio. A idéia por trás dessa abordagem é que os vírus ad-CRE injetados são retidos na árvore ductal, que é uma estrutura oculta com lúmen, e, portanto, apenas os MECs estão expostos aos vírus e estão infectados pelo AD-CRE. Devido ao espaço limitado do lúmen dent...

O objetivo geral deste método é desenvolver uma nova abordagem de modelagem de câncer de mama com base em uma injeção intraductal de AD-CRE no rato MG. A abordagem genética baseada em recombinação CRE/loxP tem sido amplamente utilizada para modelar o câncer de mama humano em camundongos. A primeira geração de modelos de ratos de câncer de mama baseados em CRE/loxP é gerada usando camundongos transgênicos que expressam CRE o controle de promotores específicos do MEC (por exemplo, MMTV-CRE para MECS luminais e uma porção de MECS basal, WAP-CRE e Blg-CRE para progenitores Luminal e MECs Luminal alveolares, K14-CRE para a parte basal e uma parcela de MECS Luminal1,2,3,4,5)6, 7 anos de , 8 . º , 9. Entretanto, quando estas linhas do CRE transgênicas permitirem o controle espacial da expressão de CRE (isto é, em subconjuntos diferentes dos MECS), não permitem o controle temporal da expressão de CRE e da manipulação genética de CRE/loxp-negociada. A segunda geração de modelos de mouse de câncer de mama baseados em CRE/loxp utilizam abordagens induzível de atividade/expressão CRE (por exemplo, uso de fusão do receptor de CRE-estrogênio [creer], que só pode induzir recombinação CRE/loxp após a administração de tamoxifeno), e Como resultado, essas ferramentas genéticas permitem o controle espacial e temporal da ativação de eventos oncogênicos em MECS (por exemplo, modelosbaseados em K8-creer-e K5-creer)10,11,12 . Em ambas as gerações de modelos de rato de cancro da mama, como promotores utilizados para conduzir CRE ou CreER expressão (por exemplo, Krt8, Krt5) também pode ser ativo em células epiteliais de outros órgãos (ou seja, eles são específicos do tipo de célula, mas não órgão específico) ou têm uma expressão gotejante em tipos de células que não as epiteliais (por exemplo, MMTV, que tem atividade de vazamento em células hematopoiéticas da medula óssea), essas abordagens podem levar ao desenvolvimento de câncer indesejado (s) em outros órgãos (s). Se esses cânceres inesperados causarem letalidade nos camundongos afetados, a finalidade original de modelar o câncer de mama nesses camundongos pode ser proibida (por exemplo, eventos oncogênicos conduzidos por MMTV-CREpodem levar a malignidades hematopoiéticas e morte precoce dos camundongos , devido à fuga do promotor MMTV em células hematopoiéticas)4.
Aqui nós relatamos uma aproximação de modelagem do cancro da mama nos ratos que permite a manipulação Cell-Type-e órgão-específica de eventos oncogênico em uma maneira temporally controlada. Esta aproximação é baseada em uma injeção intraductal de AD-CRE em MGs do rato (e é, assim, órgão-específico). A expressão CRE pode ser controlada usando diferentes promotores específicos da subpopulação do MEC incorporados no vetor adenoviral (por exemplo, Krt8 para MECS LUMINAIS, Krt5 para MECS basais, conseguindo assim a especificidade do tipo celular). A indução do cancro em MGs pode ser controlada temporally por uma injeção de AD-CRE em ratos em idades diferentes, partindo de 3-4 semanas da idade (pubertal) ao estágio adulto.

<table><tbody><tr><td>agulha de calibre 33</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>estilo de ponto 3 sem corte</td></tr><tr><td>7mm Clipe de Reflexo</td><td>Braintree Scientific</td><td>RF7 CS</td><td></td></tr><tr><td>Adenovírus, Ad-K5-Cre</td><td>Núcleo de Vetor Viral da Universidade de Iowa</td><td>Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)</td><td></td></tr><tr><td>Adenovírus, Ad-K8-Cre</td><td>Núcleo de Vetor Viral da Universidade de Iowa</td><td>Ad5mK8-nlsCre</td><td></td></tr><tr><td>Álcool</td><td>Fisher</td><td>HC800-1GAL</td><td>Prepare para 70% em uso</td></tr><tr><td>CD31 biotinilado</td><td>eBiosciences</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45 biotinilado</td><td>eBiosciences</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>biotinilado TER119</td><td>eBiosciences</td><td>13-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CD24-AF-700</td><td>BD Pharmingen</td><td>564237</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0242-83</td><td></td></tr><tr><td>CD29-APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>Loção Removedora de Pêlos</td><td>Nair</td><td></td><td>9 Oz</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Hamilton Hamilton</td><td>7636-01</td><td>0.025 mL</td></tr><tr><td>Iodóforos</td><td>Betadine</td><td></td><td>10% Povidona-iodo</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>1-2,5%</td></tr> <tr><td>Loxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>5 mg / ml</td></tr><tr><td>Lubrificante Pomada para os Olhos</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação</td><td>Pentair</td><td>9M</td><td>Relojoeiro Fórceps Pinças</td></tr><tr><td>de microdissecação</td><td>Dumont</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Taq 5X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0285L</td><td></td></tr></tbody></table>

modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de cre-expressando adenovirus na glândula mamária do mouse

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

O câncer de mama é uma doença heterogênea, possivelmente devido a interações complexas entre diferentes células de origem e eventos oncogênicos. Os modelos de mouse são fundamentais para obter insights sobre esses processos complexos. Embora muitos modelos do rato sejam desenvolvidos para estudar contribuições de vários eventos e pilhas oncogênico da origem à tumorigenese do peito, estes modelos são frequentemente não Cell-Type ou órgão específico ou não podem induzir o início do tumorigênese mamária em um forma temporalmente controlada. Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar um novo tipo de modelos do rato do cancro da mama baseados na injeção intraductal do adenovírus CRE-expressando (AD-CRE) em glândulas mamária do rato (MGS). Devido à injeção direta de AD-CRE em dutos mamários, esta abordagem é específica de MG, sem qualquer indução de câncer indesejada em outros órgãos. O procedimento intraductal da injeção pode ser executado nos ratos em estágios diferentes de seu desenvolvimento do magnésio (assim, permite o controle temporal da indução do cancro, partindo de ~ 3-4 semanas da idade). A especificidade do tipo celular pode ser alcançada usando diferentes promotores específicos do tipo célula para impulsionar a expressão de CRE no vetor adenoviral. Nós mostramos que as pilhas epithelial mamária Luminal e basais (MECS) podem fortemente ser alvejadas para a manipulação genética CRE/loxp-baseada através de uma injeção intraductal de AD-CRE o controle do promotor da queratina 8 ou da queratina 5, respectivamente. Incorporando um repórter condicional de CRE (por exemplo, repórter de CRE/loxP-inducible Rosa26-YFP ), nós mostramos que os MECS alvejados por AD-CRE, e as pilhas do tumor derivou deles, podem ser traçados seguindo as pilhas repórter-positivas após a injeção intraductal.

Os resultados de genotipagem do PCR representativo para os alelos R26Y e Trp53L são mostrados na Figura 1.
Embora, em princípio, todos os 10 MGs podem ser submetidos ao procedimento de injeção intraductal, praticamente, os dois quarto MGs inguinal são tipicamente selecionados para injeção, devido à sua acessibilidade mais fácil e maiores tamanhos de MG (<strong class="x...

O objetivo deste protocolo é descrever uma nova abordagem de modelagem de câncer de mama baseada na injeção intraductal de adenovírus expressando CRE em glândulas mamárias de camundongo. Esta aproximação permite a manipulação Cell-Type-e órgão-específica de eventos oncogênico em uma maneira temporally controlada.

Modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de CRE-expressando Adenovirus na glândula mamária do mouse

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Este protocolo ajudará os pesquisadores a gerar um novo tipo de modelo de camundongo para recapitular o desenvolvimento do câncer de mama humano a partir de diferentes subconjuntos de células epiteliais mamárias. Essa técnica permite que os pesquisadores gerem modelos de camundongos com câncer de mama em tecido de estágio de desenvolvimento de forma específica do tipo celular e sem a necessidade de criação extensiva de camundongos. Para iniciar esse procedimento, gerar, manter e anestesiar camundongos floxed como descrito no protocolo de texto.Leve o rato para uma área separada de onde a cirurgia deve ser realizada. Após confirmar a anestesia realizando uma pitada de dedo do pé, injete Meloxicam como analgesia subcutânea a uma dose de cinco miligramas por quilograma para se preparar para o procedimento cirúrgico. Exponha o local cirúrgico do mamilo aplicando várias gotas de creme para depilação.Remova o creme excessivo e os cabelos soltos usando toalhas de papel macios. A barba não é recomendada para evitar danos aos mamilos. Desinfetar o local cirúrgico com iodophors primeiro seguido por 70% de álcool e terminar com uma aplicação final de iodophors de esfoliação.Faça isso em um mo

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste artigo, discutimos como estabelecer um modelo de câncer de mama em camundongos fêmeas injetando células de câncer de mama na almofada de gordura mamária. O protocolo de exemplo demonstra a injeção ortotópica.

Injeção ortotópica na almofada de gordura mamária: estabelecendo câncer de mama em camundongos

Este vídeo descreve uma técnica de injeção intraductal em que administramos uma mistura de injeção nos dutos das glândulas mamárias de camundongos.

Injeção intraductal: Aplicação da mistura de injeção nos ductos da glândula mamária do camundongo

Um protocolo para a entrega intraductal não-invasivo de reagentes aquosas para a glândula mamaria do rato está descrito. O método aproveita injecção localizada nos mamilos das glândulas mamárias destinadas especificamente ductos mamários. Esta técnica é adaptável para uma variedade de compostos, incluindo o siRNA, agentes quimioterapêuticos e moléculas pequenas.

Injeção Intraductal para localizada Drug Delivery ao Rato glândula mamária

Ativação de mutações latentes com adenovírus-Cre no sistema ductal resultados mamárias em um câncer de mama metastático clinicamente relevante. Incorporação de um promotor YFP permite o rastreamento de células tumorais metastáticas distais. Este modelo é útil para estudar metástase latente, a imunidade anti-tumor, e para a concepção de novas imunoterapias para tratar o câncer de mama.

Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

O cancro é uma doença complexa que é influenciada pelo tecido circundante do tumor, bem como pro- local e anti-inflamatórias mediadores. Portanto, os modelos de injeção ortotrópicas, ao invés de modelos subcutâneos pode ser útil para estudar a progressão do câncer de uma forma que melhor mimetiza patologia humana.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Aqui, apresentamos um protocolo para implante de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de forma simples, menos invasiva e fácil de manusear de maneira, e este modelo de câncer de mama ortotópico rato com um ambiente adequado do tecido mamário pode ser usado para investigar vários aspectos da câncer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) e modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados recapitulam fielmente a doença humana e são modelos preferidos para pesquisas básicas e translacionais sobre câncer de mama. Aqui, um método é descrito para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária para estudar biologia tumoral e avaliar a resposta medicamentosa.

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Descrevemos um modelo de metástase cerebral de câncer de mama em camundongos xenoenxerto gerada por injeção na veia caudal de uma linhagem de células inflamatórias de câncer de mama amplificadas endogenamente por HER2.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

Um método de injeção intradutal de reagentes para uma solução ablativa à base de etanol para a árvore ductal mamária do camundongo para a imagem in vivo e prevenção do câncer de mama é descrito. A injeção diretamente na abertura do mamilo permite atingir células epiteliais mamárias com danos colaterais mínimos.

Entrega intraduto e visualização de raios-X da solução ablativa baseada em etanol para prevenção e tratamento local do câncer de mama em modelos de camundongos

Um procedimento para a entrega de uma solução química ablativa à árvore ductal mamária de ratos para tratamento preventivo guiado por imagem do câncer de mama é descrito. As células epiteliais mamárias podem ser alvo de dano tecidual colateral mínimo por meio de canulação diretamente na abertura do mamilo e infusão intraductal de uma solução ablativa à base de etanol a 70%.

Visualização de Raios-X do Tratamento Ablativo Intraductal à Base de Etanol para Prevenção do Câncer de Mama em Modelos de Rato

O presente protocolo descreve a injeção intraductal de vetores virais via teto para entregar genes de interesse nas células epiteliais mamárias.

In vivo Entrega de Genes em Células Epiteliais Mamárias de Camundongos Através de Injeção Intraductal Mamária

Aprenda a modelar câncer de mama por injeção intraductal de adenovírus expressando Cre em glândulas mamárias de camundongos. Este método permite manipulação específica de eventos oncogênicos sem cruzamentos extensivos.

Modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de CRE-expressando Adenovirus na glândula mamária do mouse

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