Name: Coleção de tecidos de morcegos para análises de Omics e cultura de células primárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Aprenda a coletar tecidos de morcegos de forma humanitária para análises de genômica, transcriptômica e proteômica. Este protocolo não letal preserva amostras de alta qualidade para estudos moleculares e cultura de células primárias.

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Agradecemos ao centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo, e Fanny Fernández Melo para a confecção de tecidos coleção no Peru possível. Agradecemos também a todos os membros do grupo Jaragua e Yolanda León para fazer coleção de tecidos na República Dominicana possível, bem como para Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, e todos na estação de pesquisa biológica la selva, na Costa Rica, para fazer amostragem possível. Agradecemos a Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe para acesso e coleta de amostras de socos de asa de Phyllostomus descolorir morcegos para geração de cultura de células. Phyllostomus descolorir morcegos originados de uma colônia de reprodução no departamento de biologia II da Ludwig-Maximilians-Universidade de Munique. A aprovação para manter e produzir os morcegos foi emitida pelo escritório veterinário do distrito de Munique. LMD, SJR, KTJD e LRY foram financiados pela NSF-DEB 1442142. LMD foi financiado por NSF-DEB 1838273. LRY foi financiado pelo NSF-PRFB 1812035. SCV e PD foram financiados por um prêmio do grupo de pesquisa Max Planck, e um programa de pesquisa de fronteiras humanas (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016). SJR, JHTP, e KTJD foram financiados pelo Conselho Europeu de investigação (ERC começando Grant 310482 [EVOGENO]) concedido a SJR, ECT foi financiado pelo Conselho Europeu de investigação Grant (ERC-2012-StG311000).

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo discutido neste manuscrito descreve as melhores práticas de amostragem para várias análises moleculares de alta produtividade de morcegos. Todos os estudos de sucesso-Omics exigem tecido de alta qualidade, mas o tecido de morcego de amostragem, bem como outros organismos não-modelo, muitas vezes ocorre em condições de campo que não podem ser definidas para os mesmos padrões que os de um ambiente de laboratório controlado. A amostragem ocorre frequentemente em locais remotos, com recursos mínimos, incluindo ac...

<table><tbody><tr><td>Tubos Eppendorf Safelock de 1,5 mL Fischer</td><td>Scientific</td><td>10509691</td><td>Tubos estéreis de 1,5 mL usados durante o protocolo de cultura de células</td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>Tubos estéreis de 15 mL usados durante o protocolo de cultura de células</td></tr><tr><td>2 mL criogeniais</td><td>Thomas Scientific</td><td>1154P75</td><td>frascos criogênicos para tecidos a serem armazenados em nitrogênio líquido</td></tr><tr><td>punção de biópsia de 3 mm</td><td>Medline</td><td>punção</td> de <td>biópsia de asa MIL3332 para cultura de células</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Greiner</td><td>83.392</td><td>Vaso de cultura</td></tr><tr><td>Allprotect Tissue Reagent</td><td>Qiagen</td><td>76405</td><td>para amostras fecais; solução estabilizadora de tecido</td></tr><tr><td>Lâminas de contagem de células para contador de células TC10/TC20, câmara dupla</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td>Câmaras para as células de contagem usando o contador de células automatizado TC20 da Bio-Rad</td></tr><tr><td>Tecnologias de células-tronco Collagenase IV</td><td></td><td>7909</td><td>Para dissociação de células primárias</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td>Previne a cristalização da água durante o congelamento das células.</td></tr><tr><td>DMEM&ndash; Meio Eagle Modificado Dulbecco</td><td>Thermo Fisher</td><td>12491-015</td><td>Meio de cultura</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>de Dulbecco 14190169</td><td>Solução salina balanceada usada para lavar células</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Fischer Scientific</td><td>10270106</td><td>Suplemento de soro para cultura de células in vitro de células eucarióticas</td></tr><tr><td>Sal de sulfato de gentamicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264-250MG</td><td>Antibiótico para meios de cultura</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0050</td><td>Recipiente de congelamento que fornece 1 &deg; Taxa de resfriamento C/min</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>Sigma</td><td>P7793</td><td>Tubos de embalagem, etc., para vedação</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (caneta-estreptococo), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140130</td><td>Antibiótico para meios de cultura</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 10x, pH 7,4</td> Tampão de sal <td>10010023</td><td>Thermo Fisher</td><td>usado para lavagens e armazenamento de tecido ósseo; diluir para 10x usando água desionizada</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM7021</td><td>Solução estabilizadora</td></tr> de <tr><td>RNA RNAse away Genetech</td><td></td><td>83931-250mL</td><td>decompõe enzimas que levam à degradação do RNA</td></tr><tr><td>Gel de sílica</td><td>Fisher Scientific</td><td>7631-86-9</td><td>agente dessecante</td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Contador de células automatizado</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td>Coloração celular usado para avaliar a viabilidade celular</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>Para dissociação de células durante a divisão</td></tr></tbody></table>

coleção de tecidos de morcegos para análises de omics e cultura de células primárias

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Como as tecnologias de sequenciamento de alta produtividade avançam, métodos padronizados para aquisição e preservação de tecidos de alta qualidade permitem a extensão desses métodos a organismos não-modelo. Uma série de protocolos para otimizar a coleta de tecido de morcegos foi desenvolvida para uma série de abordagens de sequenciamento de alta taxa de transferência. Descritos aqui estão os protocolos para a captura de morcegos, a demografia desejada a ser coletado para cada morcego, e métodos otimizados para minimizar o stress em um morcego durante a coleta de tecido. Especificamente delineados são métodos para coletar e tratar o tecido para obter (i) DNA para análises genômicas de alto peso molecular, (II) RNA para transcriptomas específicos do tecido, e (III) proteínas para análises de nível proteômico. Por fim, também esboçado é um método para evitar a amostragem letal através da criação de culturas de células primárias viáveis de clipes de asa. Uma motivação central destes métodos é maximizar a quantidade de dados moleculars e morfológicos potenciais para cada bastão e sugerir maneiras ideais de preservar tecidos assim que mantêm seu valor enquanto os métodos novos se desenvolvem no futuro. Esta padronização tornou-se particularmente importante à medida que surgiram iniciativas para sequenciar genomas de espécies em nível de cromossomo, livres de erros em todo o mundo, nos quais vários partidos científicos estão liderando o sequenciamento de diferentes taxonômicos Grupos. Os protocolos descritos neste documento definem os métodos ideais de coleta e preservação tecidual para Bat1K, o consórcio que está sequenciando os genomas de todas as espécies de morcegos.

Dna Para as análises padrão de baixo peso molecular (LMW), o DNA foi extraído de três espécies de morcegos neotropicais. Amostras de tecido foram coletadas no campo da República Dominicana e da Costa Rica, seguindo os protocolos descritos neste artigo. Após a dissecção, as partes pequenas (&lt; 0.5 cm na seção a mais fina) de tecidos misturados (cérebro, fígado, e intestine) foram coloc na solução de estabilização do RNA, Flash congelado, a seguir armazenado em-80 ° c....

Este é um protocolo para a preparação óptima do tecido para análises genomic, transcriptomic, e proteômica dos bastões capturados no selvagem. Inclui protocolos para captura e dissecção de morcegos, preservação tecidual e cultivo celular de tecido morcego.

Coleção de tecidos de morcegos para análises de Omics e cultura de células primárias

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Neste vídeo, fornecemos um guia passo a passo para coletar morcegos de forma humana, com o objetivo de minimizar o impacto sobre as populações e maximizar o valor científico. As vantagens de nossa abordagem são que maximizamos a quantidade de dados moleculares e morfológicos potenciais para cada morcego, preservamos tecidos para reter seu valor futuro e minimizamos a colheita de indivíduos selvagens. Os protocolos de dissecção são difíceis de demonstrar verbalmente.Muitas das técnicas de preparação tecidual que apresentamos aqui são melhor comunicadas através da visualização de como diferentes órgãos são identificados e, em seguida, devidamente dissecados e armazenados. Prepare todos os frascos antes de iniciar qualquer dissecção para evitar atrasos. Para o RNA, reserve o número de frascos necessários para cada espécime.Rotule cada tubo com o tipo de tecido que será coletado, bem como informações padrão de identificação da amostra. Encha os frascos 50% cheios de solução estabilizadora de RNA e esfrie até quatro graus celsius. Tome cuidado para não encher os frascos completamente com a solução estabilizadora do RNA, pois o tubo pode explodir ao colocá-lo em nitrogênio líquido.Imedia

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

Nós fornecemos um protocolo detalhado para preparar células primárias...

Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula

Tegumento dos mamíferos contém lipídios solventes extraível que podem fornecer composições química característica de espécies individuais. Este trabalho apresenta um método de rotina para separar classes de lipídios amplas isoladas de tecidos tegumentar utilizando cromatografia em camada delgada e determinar o perfil triacilglicerídeos pelo laser de dessorção / espectrometria de massa por ionização assistida por matriz de tempo de vôo.

Perfil dos Conteúdos triacilglicerídeos em Bat Tegumentar Lipídeos por cromatografia em camada delgada preparativa e MALDI-TOF Espectrometria de Massa

Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Este protocolo descreve os processos gerais e controle de qualidade verifica necessário para a preparação de células simples mamíferos adultas saudáveis para preparações de RNA-Seq de célula única baseada em gotículas, alta taxa de transferência. Parâmetros de sequenciamento, alinhamento de leitura e análise de bioinformatic a jusante de célula única também são fornecidos.

Transcriptomics de célula única baseada em código de barras da gota de tecidos de mamíferos adultos

Este protocolo introduz um procedimento de funcionamento padrão do laboratório para o teste diagnóstico de antígenos do lyssavirus nos bastões em Formosa.

Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Aqui, apresentamos um protocolo para medir metabólitos de forma precisa e confiável em tipos celulares raros. Melhorias técnicas, incluindo um fluido de bainha modificado para a triagem celular e a geração de amostras em branco relevantes, permitem uma quantificação abrangente de metabolitos com uma entrada de apenas 5000 células por amostra.

Metabolômica direcionada em células primárias raras

Aprenda a coletar tecidos de morcegos de forma humanitária para análises de genômica, transcriptômica e proteômica. Este protocolo não letal preserva amostras de alta qualidade para estudos moleculares e cultura de células primárias.

Coleção de tecidos de morcegos para análises de Omics e cultura de células primárias

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