Name: Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda a extrair metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise metabolômica por eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massa. Este método simples e confiável facilita estudos em metabolômica do câncer.

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Agradecemos a todos os membros do centro de promoção da indústria regional de Shonai por sua ajuda. Este trabalho foi apoiado em parte por fundos de pesquisa da prefeitura de Yamagata e da cidade de Tsuruoka, pelo fundo nacional de pesquisa e desenvolvimento do centro de câncer [Grant Number 28-A-9], e pela sociedade japonesa para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI [número de subvenção 17K07189] para HM.

1. cultura de células no dia 1
Nota: cada amostra para extração de metabolito deve ser preparada a partir de um único prato de cultura de tecido de 100 mm que é moderadamente mas não totalmente confluente (contendo aproximadamente 2 – 5 milhões de células). Calcule o número de pratos necessários para o ensaio e prepare-os em conformidade.
<ol><li>Cultura HCC827 e células PC-9 em 5% CO2 a 37 ° c em RPMI-1640 médio suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS).</li>
	<li>Aspirar a mídia de cultura celular dos pratos de cultura de 100 mm.</li>
	<li>Lave as células em cada prato usando 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio. Balanç delicadamente cada prato de modo que a solução de PBS cubra completamente a superfície do prato.</li>
	<li>Aspirar o tampão de lavagem dos pratos de cultura.</li>
	<li>Solução morna do trypsin-EDTA de 0,25% a 37 ° c e adicione 2 ml da solução do trypsin-EDTA com uma pipeta sorológicos de 5 ml. Delicadamente rocha cada prato de modo que o tripsina cubra completamente a superfície do prato.</li>
	<li>Incubar os pratos de cultura a 37 ° c por aproximadamente 5 min.</li>
	<li>Adicione 4 mL de meio de crescimento completo pré-aquecido por prato. Ressuscitar as células em meio por pipetagem suavemente várias vezes.</li>
	<li>Transfira cada suspensão de células para um tubo cônico separado de 15 mL e centrifugue a 800 × g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspend cada pelota da pilha em 2 mL do meio de crescimento completo pre-aquecido.</li>
	<li>Determine o número total e a viabilidade percentual das células usando o contador de células automatizado e a solução 0,4% azul de Tripan.<ol>
<li>Misture 10 μL de suspensão celular e 10 μL de solução de 0,4% de azul de Tripan.</li>
		<li>Carregue 10 μL de amostra na corrediça da câmara de contagem de células através da ação capilar.</li>
		<li>Insira o slide da câmara no contador de células automatizado. A luz transmitida ilumina automaticamente e o auto do instrumento centra-se sobre a pilha.</li>
		<li>Pressione o botão Capture para capturar a imagem e exibir os resultados.</li>
		<li>Se necessário, adicione um meio de crescimento adicional para obter a concentração de células desejada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semente aproximadamente 1 – 2.5 milhão pilhas por o prato da cultura da pilha de 100 milímetros. Nota: as concentrações de metabolito determinadas pela análise CE-MS serão normalizadas com base no número de células viáveis. Para a finalidade da contagem da pilha, é necessário preparar pelo menos um prato de cultura semeado extra para cada grupo.</li>
	<li>Incubar os pratos da cultura em 5% CO2 em 37 ° c por 18 h.</li>
</ol>2. preparação dos reagentes
<ol><li>Diluir uma solução padrão interna comercial, incluindo sulfona de L-metionina e ácido d-cânfora-10-sulfônico 1000-fold em água ultrapura. Nota: para menos de 80 amostras, basta misturar 50 μL da solução padrão interna 1 e 45 mL de água ultrapura num balão volumétrico de 50 mL e, em seguida, levar a solução até 50 mL com água ultrapura.</li>
	<li>Prepare uma solução de manitol de 0, 5 g/mL em água ultrapura como tampão de lavagem. Nota: para menos de 30 amostras, basta Dissolver 25 g de manitol em 500 mL de água ultrapura. Aproximadamente 15 mL de tampão de lavagem são exigidos por prato de cultura de 100 mm, então prepare um volume suficiente de tampão de lavagem de acordo com o número de amostras.</li>
</ol>3. pre-lavagem centrífuga unidades de filtro
<ol><li>Pipetar 250 μL de água ultrapura para o copo filtrante de cada unidade de filtro centrífugo (ver a tabela de materiais). Nota: duas unidades de filtro por amostra são necessárias.</li>
	<li>Tampe firmemente as unidades filtrantes e centrifugue a 9.100 × g a 4 ° c durante 5 min.</li>
	<li>Verifique o volume de cada filtrado — se o filtrado significativo acumulou durante a primeira rotação curta, a unidade de filtro pode estar defeituosa. Nesse caso, descarte a unidade de filtro e use uma nova unidade de filtro.</li>
	<li>Feche firmemente as tampas das unidades filtrantes e centrifugue novamente a 9.100 × g a 4 ° c durante 30 min.</li>
	<li>Assegure-se de que nenhuma água ultrapura permaneça em alguns dos copos do filtro; Remova a água de ultrapura filtrada em cada tubo de coleta com uma pipeta e descarte. Nota: não tente remover a água residual num copo de filtro com uma pipeta, pois pode danificar o filtro.</li>
	<li>Substitua os copos de filtro em seus tubos de coleta. Nota: Use as unidades centrífugas do filtro dentro de uma hora desde que os filtros podem se tornar danificados em cima da secagem.</li>
</ol>4. cultura celular no dia 2
<ol><li>
Tire os pratos de cultura de 100 mm da incubadora. Nota: a duração da cultura de célula recomendada é 18 h.</li>
	<li>Aspirar o meio de cultura celular de cada prato de cultura de 100 mm.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de meio de cultura celular que inclui as concentrações apropriadas de compostos ou drogas para cada prato, tendo o cuidado de não perturbar a camada celular. Nota: para fins de demonstração, foram acrescentados 10 μL de 250 mM de diamida dissolvida em PBS (concentração final de 250 μM) neste experimento.</li>
	<li>Incubar os pratos de cultura a 37 ° c por 30 min na presença de diamida ou PBS como controle.</li>
	<li>Aspirar o meio de cultura celular de cada prato de cultura de 100 mm.</li>
	<li>Lave as células adicionando suavemente 2 mL de solução de manitol a 5% à borda de cada prato, tendo o cuidado de não perturbar a camada celular, em seguida, incline levemente o prato. Nota: a PBS ou solução salina interfere com a análise metabolomica baseada em CE-MS e afeta negativamente os resultados da medição e, portanto, não deve ser usada como tampão de lavagem.</li>
	<li>Aspirar o tampão de lavagem de cada prato de cultura, em seguida, lave as células novamente, adicionando suavemente 10 mL de tampão de lavagem por prato e levemente inclinando o prato.</li>
	<li>Aspirar completamente o tampão da lavagem da borda de cada prato da cultura. Nota: aspirar o máximo de tampão de lavagem possível, prestando atenção para não aspirar as células. O manitol residual pode interferir na análise da CE-MS; aspiração de células diminuirá o número de células e, portanto, se tornará uma fonte de erro na normalização de dados.</li>
</ol>5. extração de metabólitos de células cultivadas
<ol><li>Adicionar 800 μL de 99,7% de metanol por prato de cultura. Balanç delicadamente cada prato da cultura para a frente e para trás para cobrir sua superfície inteira. Deixe os pratos à temperatura ambiente por 30 s.</li>
	<li>Adicione lentamente 550 μL da solução padrão interna diluída por prato, imersando a ponta da pipeta no metanol e pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes.</li>
	<li>Balanç delicadamente cada prato da cultura para a frente e para trás para cobrir sua superfície inteira.</li>
	<li>Deixe os pratos à temperatura ambiente por 30 s.</li>
</ol>6. ultrafiltração de extratos celulares
<ol><li>Transfira a solução extraída de cada prato de cultura para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugue os tubos a 2.300 × g a 4 ° c durante 5 min.</li>
	<li>Transferir 350 μL de cada sobrenadante em duas unidades filtrantes centrífugas por amostra. Nota: a partir de cada prato de cultura, um total de 700 μL da solução extraída é transferido para dois tubos de filtro (350 μL/tubo).</li>
	<li>Centrifugue os tubos de filtro a 9.100 × g a 4 ° c durante aproximadamente 2 h até que nenhum líquido permaneça nos copos de filtro.</li>
	<li>Retire os copos de filtro e feche firmemente as tampas dos tubos de recolha.</li>
</ol>7. evaporação da amostra
<ol><li>Prepare um evaporador centrífugo — tipicamente, isto consiste em um evaporador, em uma armadilha fria, e em uma bomba de vácuo.</li>
	<li>Coloque os tubos de coleta no evaporador centrífugo. Nota: Deixe as tampas dos tubos abertos.</li>
	<li>Evate as soluções extraídas da amostra condições do vácuo na temperatura ambiente. Nota: as configurações típicas para o número de rotações e a pressão são 1.500 RPM e 1.000 PA, respectivamente, e toma geralmente aproximadamente 3 h para evaporar completamente as amostras.</li>
	<li>Confirme que nenhum líquido permanece em nenhum dos tubos de coleta e feche as tampas dos tubos firmemente.</li>
	<li>Armazene os tubos da coleção em um congelador profundo da temperatura ultra-baixa (− 80 ° c) até a análise Metabolômica.</li>
</ol>8. análise metabolomic por CE-MS
<ol><li>Ressuscitem o filtrado em 50 μL de água ultrapura imediatamente antes da análise CE-MS.</li>
	<li>Executar a análise CE-MS por métodos descritos anteriormente12,13 usando sistema de eletroforese capilar e tempo de vôo sistema de espectrómetro de massa equipado com uma bomba isocrática, um adaptador CE-MS, e um CE-ESI-MS pulverizador. Nota: ambos os sistemas podem ser controlados pelo software dos vendedores do sistema e são conectados por um capilar fundido de sílica (50 μm de diâmetro interno × 80 cm de comprimento total).<ol>
<li>Configure instrumentos e frascos de amostra, prepare o capilar com uma gaveta capilar, Reabasteça os líquidos da bainha e os buffers de eletroforese apropriados, dependendo do modo de análise de anion ou cation, e depois aplique tensões. Nota: a instrumentação e as condições analíticas são descritas em detalhe em outra parte12,13.</li>
		<li>Abra o software e prepare uma lista de trabalho contendo métodos de aquisição de dados e informações de amostra.</li>
		<li>Inicie uma execução de teste e verifique os dados, como a intensidade do sinal e a forma de pico de padrões internos e a resolução de pico de outros compostos padrão.</li>
		<li>Afinar as condições analíticas, se necessário.</li>
		<li>Injete as soluções de amostra em 50 mbar por 3 s e uma voltagem de 30 kV. Nota: o CE-MS foi conduzido tanto no modo de íon positivo ou negativo. Ajuste o espectrómetro para digitalizar o intervalo de massa m/z 50 – 1000. A tensão capilar foi ajustada em 4 kV; a taxa de fluxo do gás do nitrogênio (temperatura 300 ° c do calefator). Para a modalidade positiva, a tensão do fragmentor, do skimmer e do OCT RFV foi ajustada em 75, em 50 e em 125 V, respectivamente. Para a modalidade negativa do íon, o fragmentor, o skimmer, e a tensão de OCT RFV foram ajustados em 100, em 50, e em 200 V, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise dados de espectro.<ol>
<li>Extraia picos dos dados espectrais de massa usando o software de integração automática para obter informações de pico, incluindo m/z, área de pico e tempo de migração (MT). Observação: o método é descrito em detalhes em outro lugar14.</li>
		<li>Exclua picos de sinal correspondentes a isotopomeros, íons aduto e outros íons de produto de metabólitos conhecidos.</li>
		<li>Anote os picos restantes com informações do banco de dados do metabolito HMT de acordo com valores m/z e mts.</li>
		<li>Normalize áreas dos picos anotados para níveis padrão internos e números de células por amostra.</li>
		<li>Avaliar a concentração de cada metabolito nas células cultivadas (pmol/106 células) utilizando curvas padrão preparadas para cada metabolito.</li>
		<li>Utilizar as concentrações quantificadas de metabolito para análises estatísticas subsequentes e interpretações biológicas14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis%3A+meeting+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism%3A+key+players+in+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming.</a> Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).</li>
<li>Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Cancer.</a> Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).</li>
<li>Fukuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+for+cancer+diagnosis+with+positron-labeled+fluorinated+glucose+analogs%3A+%5B18F%5D-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose%3A+a+new+tracer+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Meddicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection.</a> European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).</li>
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<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Determinants+of+Sensitivity+to+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathway+Inhibitor+in+Small-Cell+Lung+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma.</a> Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Characterization+of+Antifolate+Responsiveness+and+Non-responsiveness+in+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1129(2018).</li>
<li>Ohashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depiction+of+metabolome+changes+in+histidine-starved+Escherichia+coli+by+CE-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS.</a> Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).</li>
<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+mass+spectrometry-based+saliva+metabolomics+identified+oral%2C+breast+and+pancreatic+cancer-specific+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.</a> Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).</li>
<li>Patra, K. C., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pentose+phosphate+pathway+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pentose phosphate pathway and cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, nós descrevemos uma metodologia extensamente acessível para preparar Metabolites das pilhas cancerosas cultivadas para a análise Metabolômica CE-MS-baseada. Um dos pontos mais críticos neste protocolo é a preparação adequada das células cancerosas, porque as concentrações de metabolito medido são normalizadas para o número de células viáveis. Para a estimativa exata do número de células, é necessário preparar pelo menos um prato de cultura adicional por grupo experimental para contar o número de células viáveis em paralelo com a extração de metabólitos para a análise metabolomica. Além disso, o mesmo número de células deve ser semeado em cada prato para as repetições e no prato para a contagem; no futuro, isso seria auxiliado por um protocolo de contagem de células rápido e livre de estresse (por exemplo, tripsina livre) que permite que o mesmo prato seja usado para a contagem de células viáveis e extração de metabólitos. Cuidados devem ser tomados durante as lavas para que as células não se desprendem da superfície dos pratos. Os testes severos da citotoxicidade e os outros experimentos que reduzem a adesão da pilha podem ser inadequados para este protocolo da extração devido à perda potencial de pilhas durante o procedimento de lavagem.
É importante usar uma solução de manitol de 5% como tampão de lavagem para extrair metabólitos de células cultivadas para análise metablomica baseada em CE-MS, pois os buffers baseados em sal, como o PBS, interferem na análise Metabolômica e afetam negativamente a medição.
Dois ou três pratos podem ser combinados como uma única amostra por extração individual de metabólitos de cada prato e, em seguida, agrupamento de amostras; no entanto, combinando vários pratos, muitas vezes aumenta o manitol residual na solução de metabolito extraído. Isto pode igualmente interferir com a análise Metabolômica por CE-MS. portanto, recomenda-se não usar vários pratos ou poços como uma única amostra.
Este método de análise Metabolômica usando o CE-MS foi desenvolvido para a medida detalhada de moléculas carregadas com pesos moleculars entre 50 e 1000 da; assim, este protocolo é otimizado para extração de compostos aquosos de baixo peso molecular. Portanto, este protocolo não é adequado para extração de metabólitos hidrofóbicos, como lipídios ou macromoléculas, como proteínas e ácidos nucleicos. Uma vez que há uma crescente demanda por análises lipídicas abrangentes ou Shotgun de amostras de células cultivadas, o desenvolvimento de um protocolo fácil e eficaz para a extração simultânea de metabólitos hidrofílicos e hidrofóbicos é necessário.
O primeiro passo da extração do metabolito — meio aspirante e células de lavagem com manitol — deve ser conduzido o mais rápido possível para minimizar as alterações no perfil metabólico das células. O tratamento de células com metanol após a lavagem com manitol é assumido para as proteínas de desnaturar e, assim, impedir que as enzimas catalisar outras reações metabólicas. No entanto, mesmo após o tratamento com metanol, reações químicas não enzimáticas — como reações redox, alguns processos de descarboxilação e ligações de tiol — podem ocorrer. Como tal, todas as concentrações de metabolitos envolvidos nestas reações medidas por este protocolo devem ser interpretadas com precaução. Em contraste com o genoma ou transcriptome, o metabolome consiste em moléculas com uma grande variedade de propriedades químicas; daqui, nenhum único protocolo pode extrair todos os metabolitos sem nenhuma perda ou distúrbio. Para medições mais precisas de tais metabólitos altamente reativos, um protocolo especificamente projetado para extrair certos grupos de metabólitos, que requer fraccionamento e derivatizações, deve ser consultado. O protocolo apresentado aqui, entretanto, descreve uma extração simples e rápida de Metabolites aquoso das amostras cultivadas da pilha para a análise Metabolômica por CE-MS. Neste artigo, não foi possível descrever como configurar o CE-MS em detalhes porque o foco do presente manuscrito é diferente, no entanto, descrever etapas detalhadas para configurar o CE-MS pode exigir um artigo dedicado separado.

Otto Warburg observou que as células cancerosas adquirem a capacidade incomum de tomar glicose e fermentar-lo para produzir lactato na presença de oxigênio adequado — um fenômeno denominado como efeito de Warburg ou glicolólise aeróbia1,2. Os defeitos mitochondrial da respiração são especulados como a base subjacente para o glicólise aeróbio em pilhas de cancro3. De fato, o efeito de Warburg é a base para a imagem tumoral por fluorodeoxyglucose (FDG)-tomografia por emissão de pósitrons (PET), que é amplamente utilizada na prática clínica4,5. Uma alta taxa de glicólise aeróbia é considerada uma característica fundamental do câncer e foi recentemente adotada como uma das conhecidas "marcas de câncer", como descrito por D. Hanahan e B. Weinberg6. Mutações somáticas em oncogenes e genes supressores de tumor — comoH Ras/Kras/nras, EGFR, BRAF, Myc, TP53, isocitrato desidrogenase (IDH) e fumarato hidrase (FH ) — foram ligadas a alterações metabólicas específicas nas células cancerosas, que se acredita ser resultado do efeito de Warburg7.
A análise metabolomic é uma aproximação prometedora não somente compreender a regulação metabólica em pilhas de cancro mas igualmente identificar biomarcadores do cancro do cedo-estágio e predição da resposta da quimioterapia. Após o tratamento de células cancerosas sensíveis ou resistentes com compostos anticâncer, o rastreamento de suas respostas metabólicas facilita a identificação de biomarcadores metabólicos para prever a eficácia de terapias anticâncer específicas em pacientes oncológicos8 ,9,10,11. Neste artigo, as linhagens de células cancerosas derivadas de um adenocarcinoma de pulmão com uma mutação EGFR tratada com diamida — que causa estresse oxidativo — foram utilizadas como modelos para análise metablomica. A vantagem deste método analítico usando a eletroforese capilar-espectrometria maciça (CE-MS) é sua medida detalhada de Metabolites carregado com a escala maciça m/z 50-100012,13. O objetivo deste artigo é fornecer aos noviços um protocolo Visual detalhado Stepwise para a preparação de Metabolites aquoso das pilhas cancerosas cultivadas e da análise Metabolômica subseqüente, particularmente por CE-MS.

<table><tbody><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Contador de células automatizado Countess II</td></tr><tr><td>Software de integração automática</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>versão B.02.00</td></tr><tr><td>Sistema CE</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 7100 CE</td> sistema <td></td></tr><tr><td>CE/MS kit</td><td>adaptador Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de pulverizador CE-ESI-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A</td><td></td></tr><tr><td>Corrediça da câmara de contagem de células</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>Corrediças da câmara de contagem de células Countess</td></tr><tr><td>Dispositivo de filtro centrífugo, 5 kDa</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno estéril, 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico estéril de polipropileno, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Manitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500 g</td></tr><tr><td>de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de eletroforese</td><td>Tecnologias de metaboloma humano</td><td>H3301-1001</td><td>para análise catiônica</td></tr><tr><td>Tampão de eletroforese</td><td>Tecnologias de metaboloma humano</td><td>H3302-1021</td><td>para análise de ânions</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de filtro, 1000 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Ponta do filtro, 20 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-20S</td><td></td></tr><tr><td>Ponta do filtro, 200 &mu; l</td><td>Watson</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de sílica fundida</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>50 &mu; m i.d. &times; 80 cm de comprimento total</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>Solução de padrão interno</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>Bomba isocrática</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 1100 Series Bomba</td><td></td>isocrática</tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1 L, microtubo de grau LC/MS</td></tr><tr><td>, 1,5 ml</td><td>Watson</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>Software Operacional</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation G2201AA</td><td>versão B.03.01 para CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos estéreis, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa por tempo de voo</td><td>Agilent Tecnologias</td><td>Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano, 0,4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Água Merck</td><td>Milli-Q</td><td>18,2 M&Omega; &#183; cm de água pura</td></tr><tr><td>Balão volumétrico, 50 ml</td><td>Iwaki</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

A análise metabolomic é uma aproximação Ômicas prometedora para compreender não somente a regulação metabólica específica em pilhas de cancro comparadas às pilhas normais mas igualmente identificar biomarcadores para a deteção do cancro da fase inicial e a predição da resposta da quimioterapia na doentes com cancro. A preparação de amostras uniformes para a análise Metabolômica é uma edição crítica que permaneça ser endereçada. Aqui, nós apresentamos um protocolo fácil e de confiança para extrair Metabolites aquoso das pilhas aderentes cultivadas para a análise Metabolômica usando a electroforese capilar-espectrometria maciça (CE-MS). Os metabólitos aquosos de células cultivadas são analisados por culturas e células de lavagem, tratando células com metanol, extraindo metabólitos e removendo proteínas e macromoléculas com colunas de spin para a análise CE-MS. Os resultados representativos usando linhagens celulares de câncer de pulmão tratados com diamida, um reagente oxidativo, ilustram o deslocamento metabólico claramente observável das células estresse oxidativo. Este artigo seria especialmente valioso para estudantes e pesquisadores envolvidos na pesquisa de Metabolômica, que são novos para a colheita de metabólitos de linhas celulares para análise por CE-MS.

Como as concentrações de metabolito nas células cancerosas (pmol/106 células) são normalizadas para o número de células viáveis, as condições experimentais devem ser estabelecidas com cuidado, de modo a minimizar a variação no número de células viáveis entre as condições. Por exemplo, o tratamento com diamida estava em uma concentração relativamente alta (250 μm), mas por um curto período de tempo para permitir que todas as células cresçam tão igualmente quanto possível, igualando assim o número de células viáveis analisadas. Nessas condições experimentais, as células HCC827 e PC-9 cresceram igualmente por 3 h (Figura 1). A análise de CE-MS de pilhas diamide-tratadas comparou com as pilhas (do controle) PBS-tratadas revelou 175 e 150 Metabolites diferencial em pilhas de HCC827 e de PC-9, respectivamente. Entre estes, vários intermediários na via de fosfato de pentose (PPP) e na glicólise superior foram significativamente mais elevados nas condições tratadas com diamida em ambas as linhas celulares, enquanto que alguns intermediários de ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) foram inferiores no Tratado condições (Figura 2 e Figura 3).
O PPP gera equivalentes redutores na forma de fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina reduzida (NADPH), que é utilizado para manutenção da homeostase redox e biossíntese de ácidos graxos15. Após o tratamento com diamida, o nível de ácido glucónico — uma glicose oxidada — aumentou 12 vezes em células HCC827 e 10 vezes em células PC-9; da mesma forma, após o tratamento com diamida, o nível de glicose 6-fosfato (G6P) — uma glicose fosforilada e o primeiro produto de glicolólise catalisada por hexokinase — também aumentou 6,3-e 3,5 vezes em células HCC827 e PC-9, respectivamente (Figura 4). Além disso, após o tratamento com diamida, os níveis de 6-fosfogluconato (6PG) — o primeiro intermediário em PPP — aumentaram drasticamente 89 vezes em células HCC827 e 231 vezes em células PC-9 em comparação com os níveis observados nos controles de PBS (Figura 4). Em contrapartida, os níveis de outros intermediários glicíticos, como frutose 6-fosfato (F6P) e frutose 1,6-bisfosfato (F1, 6P), não se modificavam na condição experimental de diamida (Figura 4). Os níveis totais de fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADP+) foram quase equivalentes entre o tratamento com diamida e as condições de controle da PBS (Figura 4), sugerindo que a glicose foi principalmente catabolizada via PPP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg"> Figura 1. Números de células inalterados após o tratamento com diamida. As respostas do crescimento da pilha a 250 μm do diamidamagnésio foram medidas usando a mancha do azul do Tripan. São mostrados números celulares de (A) HCC827 e (B) células PC-9 tratadas com PBS (azul) ou diamida (vermelho; 250 μm) para 1 ou 3 h. Os dados são mostrados como a média ± DP (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg"> Figura 2. Picos de MS representativos de metabolitos. Eletroferogramas anotados como (A) ácido glucónico, (B) glicose 6-fosfato (G6P), (C) 6-fosfogluconato (6pg), e (D) nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+) obtido pela análise CE-MS. Cada linha indica a linha celular (sólido, HCC827; pontilhado, PC-9) e tratamento (azul, PBS; vermelho, diamida) usado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg"> Figura 3. Perfis do metabolome de metabolitos intracelular. As alterações da dobra de metabolitos em (A) HCC827 e (B) as pilhas PC-9 tratadas com o diamidamagnésio são mostradas como o registro2(diamidamagnésio/PBS). No total, 175 e 150 metabólitos foram anotados nas células HCC827 e PC-9, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg"> Figura 4. Acima-regulamento do PPP em cima do tratamento do diamidamagnésio. As concentrações intracellular (pmol/106 pilhas) de metabolitos chaves envolvidos no glicólise e na via do fosfato do pentose (PPP) após o tratamento com diamidamagnésio são mostradas. Os metabólitos foram extraídos de células HCC827 e PC-9 tratadas com PBS (azul) ou diamida (vermelho, 250 μm) por 30 min. metabólitos representativos, como ácido glucónico, glicose 6-fosfato (G6P), frutose 6-fosfato (F6P), 6 -fosfogluconato (6Pg), e nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+) são mostrados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A finalidade deste artigo é descrever um protocolo para a extração de Metabolites aquoso das pilhas aderentes cultivadas para a análise Metabolômica, particular, a electroforese capilar-espectrometria maciça.

Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo visual detalhado e passo a passo para extrair metabólitos aquosos de células cancerígenas cultivadas para análise metabolome subsequente. A principal vantagem dessa técnica é sua simplicidade e confiabilidade para extrair metabólitos de células aderentes. Mas, acima de tudo, é bem otimizado para análise metabolome usando espectrometria de massa de eletroforese capilar ou CEMS.Metabolômica é uma técnica poderosa para identificar biomarcadores ou detectar câncer em estágio inicial e prever a resposta quimioterapia a pacientes com câncer. Usamos células cancerígenas nesta demonstração. No entanto, essa técnica também pode ser aplicada para colher metabólitos de outras células aderentes, como fibroblastos em células iPS.As concentrações metabólitos são normalizadas com base no número de células viáveis. Então, cuidadosa preparação da cultura, esta é a chave para a obtenção de bons dados reprodutíveis. Demonstrando o procedimento estará Ami Maruyama, um técnico do meu laboratório.Para começar, as células placa HCC827 e PC-9 em pratos de 100 milímetros contendo 10 mililitros de RPMI-1640 médio suplementado com soro bovino 10%. Coloque os pratos em uma incubadora a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas para a cultura. Após a incubação, incline suavemente os pratos de cultura de 100 milímetros para aspirar a mídia de cultura celular.Lave células em cada prato usando dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio. Balance suavemente cada prato para que a solução PBS cubra completamente a superfície do prato, em seguida, incline os pratos para aspirar o tampão de lavagem. Solução quente de 0,25% trypsin-EDTA a 37 graus Celsius.Com uma pipeta sorológica de cinco mililitros, adicione dois mililitros da solução de trypsin-EDTA aquecida a cada prato. Balance suavemente cada prato para que o trypsin cubra completamente a superfície do prato. Incubar os pratos de cultura a 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos.Em seguida, adicione quatro mililitros do meio de crescimento completo pré-aquecido para cada prato. E gentilmente pipeta várias vezes para re-suspender as células em média. Transfira cada suspensão celular para um tubo cônico separado de 15 mililitros.Centrifugar a 800 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernasce e suspenda de re-suspensão cada pelota de célula em dois mililitros do meio de crescimento completo pré-aquecido. Misture 10 microliters da suspensão celular com 10 microliters de solução azul de 0,4% trypan, em um microtubo de 1,5 mililitro.Carregue 10 microliters da mistura em uma câmara de contagem de células deslize através da ação capilar. Insira o slide da câmara no contador automático da célula e pressione o botão de captura para capturar a imagem e exibir os resultados do número total e a viabilidade por cento das células. Se o número total de células estiver acima de 0,5 milhões de células por mililitro, adicione mais meio de crescimento ao tubo cônico de 15 mililitros para obter a concentração celular desejada.Agora, adicione dois a cinco mililitros da cultura a cada prato de cultura celular de 100 milímetros para semear aproximadamente um a 2 1/2 milhões de células por prato. Incubar os pratos da cultura em 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 18 horas. Primeiro, em um frasco volumoso de 15 mililitros, diluir uma solução padrão interna comercial contendo sulfone L-Metionine e ácido D-Cânfora-10-sulfônico 1.000 vezes em água ultrapura.Dissolver mannitol em água ultrauso para preparar uma solução de manitol de 0,05 gramas por mililitro em água ultrapura como tampão de lavagem. Em seguida, no copo de filtro de cada unidade de filtro centrífugo, pipeta 250 microliters de água ultrapura. Tampe as unidades do filtro firmemente, e centrífuga a 9.100 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos.Verifique o volume de cada filtrado. Se o filtrado significativo tiver se acumulado durante o primeiro giro curto, a unidade do filtro pode estar defeituosa. Descarte a unidade do filtro e use uma nova unidade de filtro.Feche as tampas das unidades do filtro firmemente e centrífuga novamente a 9, 100 vezes g a quatro graus Celsius por 30 minutos. Certifique-se de que nenhuma água ultrauso permaneça em nenhum dos copos do filtro e remova a água ultrapura filtrada em cada tubo de coleta com uma pipeta. Coloque os copos do filtro de volta em seus tubos de coleta e use as unidades de filtro centrífugo dentro de uma hora para evitar danos ao secar.Retire os pratos de cultura de 100 milímetros da incubadora e aspire o meio de cultura celular de cada prato. Adicione 10 mililitros de meio de cultura PBS com ou sem 250 diamidas micromolar a cada prato, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Incubar os pratos de cultura a 37 graus Celsius por 30 minutos.Após a incubação, aspire o meio de cultura celular de cada prato de cultura de 100 milímetros. Incline ligeiramente o prato, e adicione suavemente dois mililitros de 5% de manitol lavar tampão na borda de cada prato para lavar as células, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Aspire o tampão de lavagem de cada prato de cultura, e lave as células novamente inclinando ligeiramente o prato e adicionando suavemente 10 mililitros de tampão de lavagem por prato.Em seguida, aspirar completamente o tampão de lavagem da borda de cada prato de cultura. Agora, adicione 800 microliters de 99,7% de metanol por prato de cultura, e gentilmente balançar cada prato de cultura para frente e para trás, para cobrir toda a sua superfície. Deixe os pratos em temperatura ambiente por 30 segundos.Adicione lentamente 550 microliters da solução padrão interna diluída por prato, imergindo a ponta da pipeta no metanol e gentilmente tubos para cima e para baixo, várias vezes. Balance suavemente cada prato de cultura para frente e para trás para cobrir toda a sua superfície, e deixe os pratos em temperatura ambiente por 30 segundos. Em seguida, transfira a solução extraída de cada prato de cultura para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro.Centrifugar os tubos a 2.300 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Transfira 700 microlitadores de cada supernaente para duas unidades de filtro centrífugas, com 350 microliters por unidade. Centrifugar os tubos do filtro a 9,100 vezes g a quatro graus Celsius por aproximadamente duas horas, até que nenhum líquido permaneça nos copos do filtro.Remova os copos do filtro e feche bem as tampas dos tubos de coleta. Neste estudo, as células HCC827 e PC-9 cresceram igualmente por três horas. A análise do CEMS indica diferença entre células tratadas com diamida e células tratadas com PBS para ambas as linhas celulares.Entre estes, vários intermediários na via fosfato pentose e na glicólise superior foram significativamente maiores nas condições tratadas com diamida, enquanto alguns intermediários do ciclo tricarboxílico foram menores nas condições tratadas. Perfis metabolomes de metabólitos intracelulares revelaram 175 e 150 metabólitos diferenciais nas células HCC827 e PC-9, respectivamente. Após o tratamento de diamida, o nível de ácido glucônico e glicose oxidada aumentou 12 vezes nas células HCC827 e 10 vezes nas células PC-9.Da mesma forma, o nível de glicose 6-fosfato, uma glicose fosforilada no primeiro produto de glicólise catalisada por hexokinase, também aumentou 6,3 e 3,5 vezes nas células HCC827 e PC-9, respectivamente. Além disso, os níveis de 6-fosfogluconato, o primeiro intermediário na via fosfato pentose, aumentaram drasticamente 89 vezes em células HCC827 e 231 vezes em células PC-9. Em contraste, os níveis de outros intermediários glicógliticos, como a frutose 6-fosfato, não mudaram na condição experimental de diamida.Os níveis totais de dinucleotídeos de nicotinamida dinucleotídeo foram quase equivalentes entre o tratamento de diamida e as condições de controle da PBS. Usar 5% de solução de mannil, além da PBS, como tampão de lavagem para células de lavagem é muito importante para a análise do CEMS, pois os buffers à base de sal interferem na análise e afetam negativamente a medição. Este protocolo é inadequado para extrair metabólitos hidrofóbicos como lipídios, por isso precisamos desenvolver um protocolo para extrair convenientemente metabólitos hidrofílicos e hidrofóbicos para análise metabolômica mais abrangente.Esta técnica realiza uma fácil extração de metabólitos de quase todas as células aderentes e, portanto, é aplicável para uma variedade de pesquisas como câncer, células-tronco, farmacologia, nutrição e ciência cosmética.

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Research

JoVE Journal

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Preparação de amostras para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única: lavagem, têmpera, secagem e armazenamento de células combinadas

Aprenda a extrair metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise metabolômica por eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massa. Este método simples e confiável facilita estudos em metabolômica do câncer.

Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar (Vídeo) | JoVE Journal

Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar

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