Name: Aspecto técnico da síntese automatizada e avaliação cinética em tempo real de 11C SNAP-7941 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a síntese automatizada de [11C]SNAP-7941 para avaliação cinética em tempo real usando imagens PET. Este método melhora a análise da expressão de receptores em células com e sem P-gp.

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Este trabalho foi apoiado pelo fundo austríaco de ciência (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). Agradecemos o apoio técnico de T. Zenz e A. Krcal. Além disso, agradecemos K. Pallitsch para a preparação do AgOTf e H. Spreitzer para distribuir o precursor.

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<li>Zeilinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+the+reliable+in+vitro+assessment+of+binding+affinity+based+on+high-resolution+real-time+data+acquisition+of+radioligand-receptor+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging+%28Research%29%22%5BJournal%5D)">New approaches for the reliable in vitro assessment of binding affinity based on high-resolution real-time data acquisition of radioligand-receptor binding kinetics.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (Research). 7, 22(2017).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

A radiosíntese de [11C] SNAP-7941 foi estabelecida em um módulo de síntese comercial. Devido à possibilidade de automatizar totalmente o procedimento de preparação, a radiosíntese impermeabilizada para ser confiável, e melhorias em relação à proteção contra radiação do operador foram alcançadas. A preparação do sintetizador tem um enorme impacto na qualidade do radiotracer, especialmente em termos de atividade molar. Assim, é essencial trabalhar constantemente condições inertes (por exemplo, a atmosfera de hélio), e para liberar todas as linhas localizadas antes do vaso de reação (linha alvo, [11C] ch3I ciclo de produção e reator (ver Figura 2)). Além disso, o aquecimento das respectivas armadilhas e fornos antes do início da síntese para remover a umidade e o carbono atmosférico aumenta a atividade molar vantajosamente. Especialmente a coluna de agotf, impregnado com o carbono de grafite, é extremamente sensível à umidade. Mesmo pequenas quantidades de qualquer fonte de umidade perturbar a conversão de [11c] ch3I para [11c] ch3OTF. Antes de iniciar a síntese, a armadilha [11c] co2 e a armadilha de [11c] ch3I têm de ser arrefecido para baixo à temperatura ambiente novamente, a fim de permitir a captura subsequente. Além disso, recomenda-se dissolver o precursor pouco antes de iniciar a síntese e adicionar a base diretamente na solução precursora.
O controle de qualidade para radiofármacos Carbon-11 tem que ser racionalmente projetado para um fluxo de trabalho contínuo e rápido. No entanto, os parâmetros mais importantes para estudos de cultura celular são a pureza radioquímica e a atividade molar para obter resultados válidos. A avaliação correta da atividade molar exige um método analítico robusto da HPLC e a curva da calibração tem que cobrir a escala de concentração do produto final. A parte desafiadora para os radiofármacos é conseguir uma concentração acima do limite de quantificação (LOQ) devido às pequenas quantidades, que são produzidas durante a radiosíntese. Assim, a arte é encontrar o equilíbrio entre as atividades de alto molar para evitar a saturação do receptor e concentrações elevadas o suficiente para ainda ser capaz de quantificar o sinal não radioativo.
[11C] O SNAP-7941 foi confirmado para ser um substrato potente do transportador de P-GP humano, pois não foi observada acumulação nas células MDCKII-hMDR1 tratadas ou com o veículo, devido ao rápido efluxo. Em contrapartida, ambos os set-ups experimentais (MDCKII-WT ou células MDCKII-hMDR1 pré-bloqueadas) forneceram resultados semelhantes (acumulação de [11C] SNAP-7941), apoiando a versatilidade deste ensaio in vitro. As pilhas de MDCKII-hMDR1 são altamente apropriadas para experimentos de LigandTracer devido a seu transfection estável, crescimento rápido e persistente de encontro ao stress de cisalhamento causado pelo prato de giro da cultura da pilha. A falta da captação snap-7941 de [11C] no cérebro do rato e dos ratos pôde conseqüentemente ocorrer causada pelo efluxo através do transportador da P-GP. Devido ao transfection de pilhas de rim caninas com a proteína humana 1 da resistência da droga multi (hmdr-1, P-GP), o valor preditivo deste método para a ligação do transportador do efluxo nos seres humanos é elevado, que é favorável nos termos de uma aplicação clínica futura. No entanto, até o momento, a seletividade contra outro transportador de efluxo não foi verificada. Portanto, outras linhas celulares podem ser usadas, expressando diferentes transportadores de efluxo proeminentes como a proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP) ou a proteína-1 de resistência múltipla (MRP-1), para estudar interações com esses transportadores. O método é em comparação com a acumulação clássica ou ensaios de transporte muito simples e dá resultados imediatamente qualitativos. Além disso, a maior vantagem é que essa tecnologia possibilita a avaliação da interação direta do traçador PET e do alvo em tempo real, em contraste com o experimento convencional utilizando quantificação indireta (principalmente deslocamento). Adicionalmente, o software do proteica do tempo real fornece a flexibilidade experimental (por exemplo, correção da deterioração do nuclide, tempo e posições de medição, etc.) e conseqüentemente, liberdade elevada para usuários. Do outro lado, as limitações do método incluem uma baixa taxa de transferência da amostra, porque somente um prato da pilha pode ser medido em um momento. Além disso, algumas outras questões técnicas e operacionais devem ser tidas em conta: a tecnologia descrita é muito sensível à radiação de fundo; assim, as fontes de radiação devem ser mantidas à distância e a ênfase deve ser colocada na medida de fundo antes do experimento. Outra questão relativa a experimentos em temperaturas mais elevadas do que a temperatura ambiente, é o aquecimento do suporte inclinado: a evaporação do meio de cultura celular pode afetar o detector. Em vez do aquecimento, o dispositivo inteiro é coloc preferivelmente na incubadora. Além disso, o método é limitado às linhas celulares aderentes. Através da rotação do prato de cultura celular, as células sensíveis à tensão de cisalhamento podem separar-se do prato, o que pode levar a resultados inválidos.
No entanto, se o experimentador presta atenção a esses inconvenientes menores, o método oferece resultados rápidos e confiáveis para a análise do comportamento cinético de PET-Tracers pré-clínicos.

[11C] SNAP-7941 foi evoluído como o primeiro tomography de emissão do positrão (animal de estimação)-Tracer que Segia o receptor da hormona da melanina-concentração 1 (MCHR1)-um receptor envolvido principalmente na regulação central do apetite e da entrada de alimento1. A rotulagem de carbono-11 de snap-7941, um antagonista MCHR1 bem caracterizado, rendeu o animal de estimação-Tracer autêntico2,3,4,5. No entanto, a radiosíntese totalmente automatizada é altamente desafiadora em termos de eficácia de tempo e reprodutibilidade com o radionuclídeos de curta duração Carbon-11 oferecendo uma meia-vida de 20 min6. O tempo de síntese geral deve ser mantido ao mínimo, e como regra de ouro não deve exceder 2-3 meia-vida (ou seja, cerca de 40-60 min para Carbon-11)7. Especialmente, os procedimentos de síntese para radiofármacos visando sistemas receptores com densidades de baixa expressão devem ser extensivamente otimizados para obter rendimentos suficientes e, consequentemente, alta atividade molar8. A estratégia sintética, muitas vezes segue a produção de radionuclídeos dentro de um ciclotron e liberação de [11C] co2 para o sintetizador. Lá, [11c] co2 é reduzido primeiramente a [11c] ch4 e reagido subseqüentemente com o iodo para render [11c] ch3mim através do método da gás-fase9,10. Um tratamento mais adicional com rendimentos triflato de prata [11C] ch3OTF diretamente em linha. Posteriormente, este intermediário com rótulo de carbono-11 reativo é introduzido em uma solução contendo a molécula precursora. Uma radiosíntese automatizada envolve adicionalmente um processo da purificação com o RP-HPLC semipreparative que inclui a formulação subseqüente do produto apropriado para estudos pré-clínicos e clínicos.
Independentemente da semivida do radionuclídeos e do esforço temporal da radiosíntese, a farmacocinética de um Radiofármaco é a parte mais crítica a ser avaliada durante o desenvolvimento do PET-Tracer. Em termos de neuroimagem, a entrada cerebral do PET-Tracer é o principal pré-requisito. No entanto, a barreira hematoencefálica (BBB), uma "borda de segurança" do cérebro, altamente expressa transportadores de efluxo que podem descarregar pequenas moléculas (por exemplo, PET-Tracers) e dificultar eficientemente a sua aplicabilidade.
Uma enorme desvantagem durante a avaliação pré-clínica são interações inesperadas para estes transportadores de efluxo, que muitas vezes não são reconhecidos em experimentos in vitro e levando à falha do PET-Tracer in vivo, como observado para [11C] SNAP-7941. a imagem latente do μPET nos ratos demonstrou a baixa acumulação do cérebro, que aumentou dramàtica após a administração do tariquidar11do inibidor da P-GP. Estes dados sugeriram que [11C] snap-7941 é um substrato deste sistema transportador de efluxo impedindo ligante ligação ao MCHR1. Infelizmente, ainda há falta de modelos in vitro adequados que permitam a predição da penetração do BBB em um estágio inicial de desenvolvimento de traçador.
Aqui, descrevemos a síntese automatizada de [11C] SNAP-7941 usando um sintetizador para metilações de carbono-11. A ênfase deste trabalho é dar uma visão geral sobre como organizar uma abordagem experimental consecutiva, incluindo a síntese automatizada, controle de qualidade, bem como a avaliação in vitro sucessiva com o nuclide de curta duração de carbono-11.
Primeiramente, as etapas chaves para uma radiosíntese bem sucedida com despesa de tempo mínima e rendimento máximo são descritas. Em seguida, é criado um procedimento de controlo de qualidade fiável que disponibilize o radiotraçador para estudos clínicos potenciais e que se encontra com os critérios da Farmacopeia Europeia12. A quantificação da concentração molar e o cálculo da respectiva atividade molar são um requisito essencial para as sucessivas medições cinéticas.
Por fim, apresenta-se um método in vitro novo e direto avaliando as interações do snap-7941com [11C] para o transportador de efluxo, P-GP (hMDR1). O modelo cinético proposto utiliza um dispositivo fácil de manusear que permite uma interpretação imediata dos dados e requer esforço mínimo de cultura celular13.

<table><tbody><tr><td>Tabela 1: Lista de materiais e instrumentação da radiossíntese totalmente automatizada do catalisador [11C]SNAP-7941</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni</td><td>Shimadzu, Kyoto, Japão</td><td></td><td>Shimalilte Ni reduzido, 80/100 mesh</td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td>1.04761.0100</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td>para a síntese de ADN, < 10 ppm H2O</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td> de grau HPLC <td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td>Etanol glacial</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td>96%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>B. Braun, Melsungen, Alemanha</td><td></td><td>0,9% </td></tr><tr><td>Hidróxido de tetrabutilamônio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartucho SPE</td> de grau HPLC <td>Waters, Milford, MA, EUA</td><td></td><td>SepPak C18plus</td></tr><tr><td>Coluna RP-HPLC semipreparativa</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td>Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm Pré-coluna</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td></td><td>Protetor de cromolito RP-18e, precursor de 5-4,6 mm</td></tr><tr><td></td><td>Universidade de Viena, Áustria</td><td></td><td>Composto de referência de ácido SNAP</td></tr><tr><td></td><td>Universidade de Viena, Áustria</td><td></td><td>SNAP-7941</td></tr><tr><td>Trifluorometanossulfonato de prata</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpa GC</td><td>Alltech, Deerfield, IL, EUA</td><td></td><td>Malha 80/100</td></tr><tr><td>Ciclotron PET trace 860</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>[11C]CO2 alvo de alta pressão</td><td>Air Liquide, Viena, Áustria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRACERlabFX2 C</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 + 1% O2</td><td>Air Liquide, Viena, Áustria</td><td></td><td>Alvo gás</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Tabela 2: Lista de materiais e instrumentação do controle de qualidade de [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Hitachi LaChrom, L-7100</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Viena, Áustria)</td><td></td><td>Bomba HPLC</td></tr><tr><td>Merck Hitachi, L7400</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Tóquio, Japão)</td><td></td><td>Detector UV</td></tr><tr><td>NaI-radiodetector</td><td>Raytest (Straubenhardt, Alemanha)</td><td></td><td>Radiodetector NaI</td></tr><tr><td>Chromolith Performance RP-18e, 100-4,6 mm</td><td>Merck (Darmstadt, Alemanha)</td><td></td><td>Coluna HPLC</td></tr><tr><td>430-GC</td><td>Bruker (Bremen, Alemanha)</td><td></td><td>Cromatógrafo gasoso</td></tr><tr><td>Coluna capilar ID-BP20; 12 mx0,22 mmx0,25 mm</td><td>SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Austrália)</td><td></td><td>Capilar gasoso</td></tr><tr><td>Wesco, osmômetro Vapro 5600</td><td>Sanoya Medical Systems (Viena, Áustria)</td><td></td><td>Espectrômetro G osmômetro</td></tr><tr><td>Espectrômetro</td><td></td><td></td><td></td> G</tr><tr><td>Software de controle de cromatografia gasosa</td><td>VARIAN (Palo Alto, Califórnia, EUA)</td><td></td><td>Galaxie Versão 1.9.302.952</td></tr><tr><td>Software de controle de espectrômetro gama</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, EUA)</td><td></td><td>Maestro para Windows Versão 6.06</td></tr><tr><td>Software de recall de espectro gama</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, EUA)</td><td></td><td>Winplots versão 3.21</td></tr><tr><td>Software de controle de HPLC</td><td>Raytest (Straubenhardt, Alemanha)</td><td></td><td>Gina Star Versão 5.9</td></tr><tr><td>inolab 740</td><td>WTW (Weilheim, Alemanha)</td><td></td><td>Medidor de pH</td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Tabela 3: Lista de materiais e instrumentação para a avaliação do comportamento cinético em tempo real de [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCKII-hMDR1)</td><td>Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdã, Holanda)</td><td></td><td>Expressando a glicoproteína P humana (hMDR1)</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCKII-WT)</td><td>Netherlands Cancer Institute (NKI, Amesterdão, Países Baixos)</td><td></td><td>Wildtype (WT)</td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Viena, Áustria</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>VWR International GmbH, Viena, Áustria</td><td></td><td>Gibco 10270-106</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>VWR International GmbH, Viena, Áustria</td><td></td><td>Gibco 15140</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>In vitro experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Viena, Áustria</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-Cloridrato de verapamil</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA)</td><td></td><td>276855-100 mL</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>Pipetas de plástico descartáveis estéreis</td><td>VWR International GmbH, Viena, Áustria</td><td></td><td>Sterilin, 5 mL &ndash; 25 mL</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta estéreis</td><td>VWR International GmbH, Viena, Áustria</td><td></td><td>Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 &micro; L &ndash; 200 &micro; L</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha</td><td></td><td>Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175</td></tr><tr><td>Controle LigandTracer Versão 2.2.2</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Suécia.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer Yellow</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Suécia.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer White</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Suécia.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado portátil</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Scepter (Cat.No. PHC00000)</td></tr><tr><td>Sensores de Contador de Células</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Sensor Scepter 60 &micro; m (Cat.No. PHCC60050)</td></tr></tbody></table>

aspecto técnico da síntese automatizada e avaliação cinética em tempo real de [11c] snap-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

O tomography de emissão de Positron (animal de estimação) é uma técnica molecular essencial da imagem latente que fornece introspecções em caminhos e usando radioligantes alvejados específicos para investigações in vivo. Dentro deste protocolo, um ajudado remoto-controlado robusto e de confiança de [11C] snap-7941, um antagonista ao receptor da hormona da melanina-concentração 1, é descrito. A radiosíntese começa com ciclotron produzido [11c] co2 que é posteriormente mais reagindo através de uma transição de fase gasosa para [11c] ch3OTF. Então, este intermediário reactivo é introduzido à solução do precursor e dá forma ao radiotracer respectivo. Química, bem como a pureza radioquímica são determinados por meio de RP-HPLC, rotineiramente implementado no processo de controle de qualidade radiofármacos. Adicionalmente, a atividade molar é calculada, pois é uma necessidade para as seguintes investigações cinéticas em tempo real. Além disso, [11C] SNAP-7941 é aplicado às pilhas de MDCKII-WT e de Mdckii-hMDR1 para avaliar o impacto da expressão da p-glicoproteína (p-GP) na acumulação da pilha. Por esta razão, o p-GP expressando a linha celular (mdckii-hMDR1) é usado sem ou com bloqueio antes dos experimentos por meio do substrato p-GP (±)-Verapamil e os resultados são comparados aos observados para as células do tipo tipo selvagem. A abordagem experimental global demonstra a importância de uma gestão de tempo precisa que é essencial para todos os estudos pré-clínicos e clínicos utilizando traçadores Pet radiomarcados com nuclídeos de curta duração, como o Carbon-11 (meia-vida: 20 min).

A radiosíntese totalmente automatizada de [11c] SNAP-7941 rendeu 5,7 ± 2,5 GBq (4,6 ± 2,0% no EOB, 14,9 ± 5,9% com base em [11c] ch3OTF; n = 10) do produto formulado. A síntese global durou cerca de 40 min, onde 15 min foram necessários para a preparação de [11C] ch3OTF através do método de fase de gás, mais 5 min foram necessários para a radiomarcação do precursor, seguido por 10 min de semi-preparative Purificação de RP-HPLC e 10 min para extração e formulação de fase sólida do cartucho C18. Em seguida, uma pequena alíquota (aprox. 100-200 μL) foi entregue à pessoa responsável pelo controle de qualidade, enquanto o frasco de produto original contendo o rastreador pronto para uso foi passado para o experimentador da análise cinética em tempo real.
O controle da qualidade foi terminado dentro de 10 minutos após o fim da síntese. A atividade molar foi em uma faixa de 72 ± 41 GBq/μmol (n = 10) e a pureza radioquímica foi sempre &gt; 95%. Todos os outros parâmetros (pH, osmolaridade, solventes residuais) preencheram os critérios de liberação. Para o ensaio cinético em tempo real, foram escolhidas três diferentes configurações experimentais: (A) células MDCKII-WT tratadas e não tratadas (veículo), (B) não tratadas ou tratadas com células MDCKII-hMDR1 do veículo e (C) a última linha celular com bloqueio prévio do tempo real ensaio cinético do transportador utilizando (±)-Verapamil. Aplicando [11C] snap-7941 à linha celular do tipo selvagem mdckii-WT (p-GP não-expressando) e mdckii-hMDR1 (p-GP expressando) mostra um comportamento cinética diferente, porque há uma acumulação rápida à linha de pilha do tipo selvagem, visto que nenhum acúmulo foi observado para as células MDCKII-hMDR1. Entretanto, o bloqueio das células do transportador de efluxo P-GP inmdckii-hMDR1 com (±)-Verapamil levou a uma cinética de tempo real comparável como já observada para a linha celular do tipo tipo selvagem (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig1.jpg"> Figura 1: visão geral do fluxo de trabalho. Fluxo de trabalho da radiosíntese, controle de qualidade e desempenho da medida cinética em tempo real de [11C] SNAP-7941. As setas pretas indicam a forma de transporte da radioatividade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig2.jpg"> Figura 2: esquema Radiosintético do sintetizador automatizado. Circuito de comutação do sintetizador automatizado, começando pela unidade de circulação de [11c] ch3I/[11c] ch3OTF Production, reator para introdução da atividade na solução precursora e purificação de SPE (SPE = extração em fase sólida; PCV = frasco de recolha de produtos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig3.jpg"> Figura 3: cromatogramas representativos da radiosíntese totalmente automatizada de [11C] snap-7841. O cromatograma semi-preparative da RP-HPLC é ilustrado na parte superior e no analítico após a purificação na parte inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig4.jpg"> Figura 4: preparação do prato de cultura celular para experimentos em tempo real. A etapa 1 inclui a semeadura de 2,5 x 105 até 1 x 106 , dependendo do tipo de célula e sua taxa de crescimento. Subseqüentemente, o prato da cultura é coloc em um plano oblíquo (aproximadamente 30-45 °). Conseqüentemente, o instrumento fornecido do metal ou a tampa de um prato da cultura da pilha podem ser usados na incubadora para estabilizar a posição inclinada do prato. O dia após (24 h) o prato é ajustado horizontalmente, e o meio de cultura fresco da pilha é adicionado para cobrir completamente a superfície da pilha. No dia da experimentação, a viabilidade e a confluência da pilha são examinadas. De acordo com o protocolo experimental, as células são lavadas com DPBS, o meio é substituído por meio livre de soro (2 mL), e o prato de cultura é reposicionado para uma posição oblíqua até o início dos experimentos. Doravante, as células podem ser tratadas com o inibidor ou veículo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig5.jpg"> Figura 5: medições cinéticas em tempo real de [11C] SNAP-7941. A cinética em tempo real representativa de [11C] snap-7941 é mostrada em três diferentes set-ups: usando células mdckii-WT; Células MDCKII-hMDR1 pré-bloqueadas com (±)-Verapamil como inibidor da P-GP e células MDCKII-hMDR1 sem bloqueio. O eixo y ilustra a taxa de aumento das células MDCKII-hMDR1 e WT pré-bloqueadas em comparação com os resultados das células MDCKII-MDR1 tratadas ou com tratamento de veículos, respectivamente (sem captação, 0%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, nós representamos um protocolo para o radioolabelling totalmente automatizado de [11C] SNAP-7941 e a análise da cinética em tempo real deste Pet-Tracer em P-GP expressando e não-expressando pilhas.

Aspecto técnico da síntese automatizada e avaliação cinética em tempo real de [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

A radiolabeling carbon-11 permite que pequenos compostos sejam usados para tomografia de emissão de pósitrons ou PET sem alterar a molécula. Isso é essencial para investigar os níveis de expressão do receptor. A vantagem da rotulagem de radiolateração de carbono-11 é que podemos usar o PET para avaliar diretamente a cinética de vinculações do SNAP em relação ao receptor hormonal concentrado de melanina em tempo real.O SNAP como antagonista do receptor hormonal concentrado de melanina contribuirá para uma melhor compreensão deste receptor e sua associação com condições metabólicas como obesidade e diabetes. Transportadores de Efflux expressos na barreira hematoencefálica podem dificultar significativamente o uso de radiofarmacêuticos para imagens de expressão de receptor central. Por isso, é importante avaliar traços in vitro.A radiosíntese automatizada do SNAP é amplamente aplicável a compostos de baixo peso molecular radiolabeled com um grupo de metila facilmente avaliável. Uma vez estabelecido este procedimento pode ser adaptado para outros compostos. Auxiliando na demonstração estarão as alunas sêniores de doutorado Sarah Pfaff e Theresa Balber.Para iniciar a síntese SNAP de carbono-11, configure um módulo de síntese automatizada de carbono-11 limpo com os reagentes e materiais apropriados. Inicie o processo de síntese SNAP no computador do módulo que começará com verificações e condicionamento do sistema. Cerca de 30 a 40 minutos antes do módulo estar pronto para a entrega do C-11, selecione o alvo de dióxido de carbono C-11 no ciclotron e inicie o feixe a 65 microamperes.Uma vez que o módulo esteja pronto para entrega, feche a janela interna e a porta externa. Confirme que a armadilha de CO2 esfriou a pelo menos 40 graus Celsius e que a armadilha de metano começou a esfriar. Uma vez que o ciclotron tenha produzido cerca de 120 gigabecquerels de C-11 CO2 clique OK no software do módulo para abrir o caminho do alvo através da armadilha de CO2.No computador ciclotron comece a entregar C-11 CO2 para o módulo. Monitore a transferência de atividade no computador do módulo e certifique-se de que ele prossiga para a redução do CO2 para o metano após três minutos. Monitore o processo à medida que o metano resultante é lavado na armadilha do metano e convertido em iodeto de metila por circulação através do forno de iodo.No final da sequência de conversão, aguarde que os subprodutos sejam liberados da armadilha de iodeto de metila para o escape e, em seguida, confirme que o reator está pronto para receber atividade clicando em OK. Monitore o sistema à medida que o iodeto de metila é liberado da armadilha, lavado através do forno de trifola de metila e preso no reator. Quando a atividade nos platôs do reator confirmar que a captura está completa. Espere enquanto a mistura de reação reage a 75 graus Celsius por três minutos.Em seguida, monitore o sistema à medida que a mistura de reação é resfriada a menos de 35 graus Celsius e saciada com 1,5 mililitros de água. Monitore o sistema à medida que a mistura de reação é carregada no laço de injeção HPLC e é injetada na coluna HPLC semi-preparatória. Observe os traços do detector UV e gama enquanto a cromatografia prossegue.Quando o pico do produto começar a aparecer manualmente comece a coletar o produto no frasco de coleta de fundo redondo no módulo. A coleta manualmente termina quando o sinal gama fica abaixo de cerca de 400 contagens por segundo. Observe o nível de fluido no frasco inferior redondo enquanto o produto é carregado em um cartucho de extração de fase sólida sob pressão de hélio.Uma vez que o frasco esteja vazio e o líquido tenha passado pelo cartucho SPE, clique em OK para começar a lavar os produtos presos no cartucho. Em seguida, monitore a atividade no frasco de coleta de produtos, pois o produto é primeiro elucido do cartucho para o frasco e depois diluído com solução salina de 0,9%. Observe como a solução do produto é transferida para o frasco do produto através de filtro estéril sob pressão de hélio.Quando a transferência estiver completa, feche a válvula de saída do produto. Quando o radiotracer chega no frasco do produto meça o rendimento radioativo absoluto. Em seguida, use uma seringa blindada de chumbo para transferir 100 microliters do rastreador para um pequeno frasco para controle de qualidade.Leve a amostra de controle de qualidade para uma área de trabalho de controle de qualidade protegida. Desenhe 40 microlitadores da amostra QC em uma seringa apertada a gás, carregue-a em um instrumento HPLC preparado equipado com uma coluna analítica e injete o produto. Realize outras medidas de controle de qualidade durante a execução do HPLC.Uma vez terminado a execução do HPLC, integre todos os picos do cromatograma do detector de radioatividade para determinar se a pureza química do rádio SNAP é maior que 95% Integre os picos do cromatograma UV para determinar a pureza química do produto. Use a área sob o pico do produto UV para calcular a atividade específica. Uma vez confirmado o produto para atender aos requisitos de uso, libere o rastreador de rádio para o laboratório de experimentos cinéticos em tempo real.Pelo menos 30 minutos antes do experimento lavar o tipo selvagem preparado ou células transfectadas com DPBS e adicionar dois mililitros de meio de crescimento livre de soro. Para bloquear as células transfeinadas adicione 0,98 microlitres de uma solução de 20,4 milimonas de cloridrato de verapamil racial em sulfóxido de dimetil. Incubar as células em um avião oblíquo por 30 minutos.Em seguida, ligue o instrumento de ensaio em tempo real e o computador associado. Abra o software de controle e escolha um alvo. Defina o número de posições para duas, o tempo de detecção para três segundos, o tempo de atraso de detecção para dois segundos e o nome da primeira fase para a linha de base.Insira o prato de cultura celular no suporte inclinado do dispositivo com o poste de célula na parte inferior. Certifique-se de que o polo celular está coberto em meio de cultura celular. Inicie uma medição de fundo de 10 minutos e defina o nome do arquivo e o caminho.Defina a escala de tempo para minutos e a coleção de nuclídeos para carbono-11. Configure o gráfico para mostrar os dados de destino subtraídos de fundo, alvo e fundo. Uma vez que o rastreador de rádio tenha sido entregue e aprovado para uso, leve uma pequena amostra para o ensaio.Calcule o volume necessário da solução de rastreador de rádio e prepare uma pipeta. No software de instrumento pausa a corrida e espere a rotação do prato parar. Abra a tampa do dispositivo, gire o suporte 90 graus para a esquerda, adicione o rastreador de rádio com a pipeta preparada e devolva o dispositivo à sua posição inicial.Feche a tampa do dispositivo e retome imediatamente o experimento. Deixe o experimento funcionar por 20 minutos antes de acabar com ele. Processe e analise os dados para avaliar a absorção de SNAP nas células.Agora, o procedimento pode ser repetido para o prato de cultura celular de controle tratado com DMSO e linha de células do tipo selvagem. Os ensaios cinéticos em tempo real foram realizados com células de tipo selvagem não-PGP expressando células do tipo selvagem, células expressas por PGP pré-bloqueadas com verapamil como inibidor de PGP e células PGP desbloqueadas. Não foi observada diferença significativa entre células não tratadas e células tratadas com veículos.O SNAP de carbono-11 rapidamente se acumulou em células do tipo selvagem, enquanto nenhum acúmulo foi observado em células expressas em PGP. O pré-bloqueio do transporte efflux PGP com verapamil resultou em acúmulo de SNAP nas células PGP comparáveis à das células do tipo selvagem. Em combinação com as medidas cinéticas em tempo real, esta configuração permite uma ampla compreensão da farmacocinética de compostos de baixo peso molecular e, portanto, é altamente importante para o desenvolvimento pré-clínico de radiofarmacêuticos.O tempo e a organização são os principais ingredientes para uma radiossíntese de carbono-11 bem sucedida com experimentos cinéticos subsequentes em tempo real, já que a meia-vida do carbono-11 é de apenas 20 minutos. Devido a uma curta meia-vida de carbono-11 muitas partes deste procedimento são realizadas simultaneamente. É importante que todos os envolvidos entendam o escopo e o tempo de seu papel.Tanto a segurança do produto quanto a proteção contra radiação são fundamentais para a preparação de radiofarmacêuticos. Todos os experimentos devem seguir o tão baixo quanto razoavelmente alcançável ou princípio ALARA para limitar a exposição à radiação do operador.

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