Name: Medição das Taxas Potenciais de Redução de Nitrato Dissimlatório para Amônio Com base em 14NH4+/15NH4+ Análises via Conversão Sequencial para N2O (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a medir taxas potenciais de DNRA em amostras ambientais usando isótopos de nitrogênio-15 e cromatografia gasosa-espectrometria de massas. Este método avança a compreensão do ciclo do nitrogênio em ecossistemas costeiros e marinhos.

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Agradecemos a Naoto Tanaka por ajudar na coleta de dados e desenvolver o protocolo. A coleta de amostras foi apoiada pelo JSPS KAKENHI Grant Número 17K15286.

1. Preparação de um envelope PTFE para captura quantitativa de NHgasoso 3
<ol><li>Coloque uma peça de 60 mm de fita politetrafluoroetileno (PTFE) (25 mm de largura) em uma pequena folha de papel alumínio (aproximadamente 300 mm x 450 mm de tamanho, limpa com etanol).</li>
	<li>Ash um filtro de fibra de vidro (10 mm de diâmetro com um tamanho de poros de 2,7 μm) a 450 °C por 4h em um forno de abafa. Coloque o filtro de fibra de vidro um pouco acima do ponto médio do eixo mais longo da fita(Figura 1a).</li>
	<li>Local 20 μL de 0,9-mol/L H2SO4 no centro de um filtro GF/D, e dobre imediatamente a fita PTFE usando duas pinças: pinças de selo de ponta plana e pinças retas. As etapas a seguir, as etapas 1.4-1.7, são mostradas na Figura 1 e devem ser conduzidas rapidamente.</li>
	<li>Gire a fita PTFE sobre o filtro GF/D na linha pontilhada mostrada na Figura 1a para formar a forma mostrada na Figura 1b.</li>
	<li>Sele ambos os lados dobrando e, em seguida, pressionando firmemente a borda com a pinça(Figura 1c). Não pressione muito forte e não arranhe a fita PTFE.</li>
	<li>Dobre a extremidade aberta com a pinça e, em seguida, pressione a borda com a pinça(Figura 1d).</li>
	<li>Sele a extremidade aberta pressionando firmemente a borda com a pinça(Figura 1e). O filtro GF/D não deve ser pressionado durante este procedimento.</li>
</ol>2. Preparando a biomassa de um denitrifier deficiente de óxido nitroso, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, para o método denitrifier
<ol><li>Reúna um estoque de 20% de glicerol de pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 em 1/4 de força triptona caldo de soja (TSB). Incubar as placas a 25 °C durante 2-3 dias.</li>
	<li>Transfira uma colônia de solteiros de P. clororaphis para um pequeno tubo de ensaio contendo 5 mL de meio TSB autoclavado e cultura aerobicamente (sem tremer) por um dia a 25 °C no escuro até obter o crescimento máximo; isso será usado como a précultura.</li>
	<li>Transfira 3 mL da pré-cultura para uma garrafa 1-L com rolha de borracha de silício contendo 1 L de TSB modificado autoclavado recém-preparado complementado com 10 mmol/L KNO323. Incubar a garrafa enquanto agita usando um agitador em condições escuras a 25 °C. Depois de cultivar por 8h, substitua a rolha de borracha de silicone por uma tampa de parafuso e feche firmemente. Continue o cultivo em anoxia durante a noite.</li>
	<li>Centrifugar a cultura a 18.800 x g por 15 min a 4 °C para obter pelotas de biomassa.</li>
	<li>Lave a biomassa embalada três vezes com 30 mL da solução salina tamponada de fosfato de Dulbecco (D-PBS(-), pH 7.5), para eliminar completamente o Nº3−. As condições da centrifugação são as mesmas do passo 2.3.</li>
	<li>Após a lavagem, suspenda a biomassa embalada com 30 mL de D-PBS(-). Use 1 mL da suspensão para determinar a densidade celular medindo OD600. Alíquotas pipetas de 1 mL da suspensão restante em criovials estéreis contendo 0,8 mL de 45% de glicerol. Preservar os estoques de glicerol preparados a −80 °C até usar (ver seção 6).</li>
</ol>3. Eliminação de oxigênio, nitrito e nitrato do sedimento amostral
<ol><li>Pesar 3,0 g (peso molhado) de sedimento em um frasco de vidro de 20 mL e adicionar 9,0 mL de água superficial para suspendê-lo (25% c/w chorume).</li>
	<li>Sele o frasco com uma rolha de borracha butil preta (lavada com água trocada por íons e esterilizada via autoclaving) e uma tampa de alumínio.</li>
	<li>Purgue a suspensão e substitua o ar do headspace por Ar (>99,99%) a 0,6 L/min por 20 min usando um coletor.</li>
	<li>Substitua o gás ar headspace por ultra-puro (>99,99995%) Ele aspirando por 90 s e cobrando Ele por 30 s. Repita este procedimento quatro vezes. Coloque a pressão do gás na cabeça para 1,5 atm.</li>
	<li>Incubar os frascos a 20 °C durante a noite com agitação a 150 rpm em condições escuras usando um agitador de temperatura constante para eliminar o restante do oxigênio, nitrato e nitrito na suspensão de sedimentos e gás headspace.</li>
</ol>4. Experiência de curso de tempo para determinar a taxa de DNRA
<ol><li>Substitua o gás do espaço da cabeça por ultra-puro fresco Ele usando o mesmo procedimento que na etapa 3.5, mas sem as quatro repetições.</li>
	<li>Adicione substratos rotulados e não rotulados a cada frasco de acordo com a Tabela 1 através da rolha de borracha butil usando uma seringa gastight. Purigue as soluções de substrato previamente preparadas em frascos de vidro de tamanho adequado usando he ultra-puro com a pressão do headspace definida para 1,5 atm para evitar contaminação do ar. Evite a injeção não intencional de qualquer quantidade de ar durante os procedimentos de injeção.</li>
	<li>Incubar frascos a 20 °C com agitação a 150 rpm. Adicione os substratos a cada frasco de acordo com a Tabela 1 e incubar por 1h, 3 h e 5h. Após a paralisação da incubação, sujeito a suspensão de sedimentos nos frascos aos seguintes procedimentos: etapas 4.4-4.9.</li>
	<li>Remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl de cada frasco. Em seguida, adicione KCl (ashed a 450 °C por 4 h) à suspensão de sedimentos até uma concentração final de aproximadamente 2 mol/L para garantir a recuperação de NH4+ do sedimento. Feche os frascos com uma rolha de borracha butyl e um fechamento de alumínio.</li>
	<li>Agite o sedimento a 150 rpm por 1h a 4 °C em condições escuras para extrair o NH4+.</li>
	<li>Transfira toda a suspensão de sedimentos no frasco para um tubo de centrífuga de plástico de 50 mL e centrífuga a 10.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Enxágüe a parede interna de uma seringa descartável de 10 mL recém-aberta e anexe-a a um filtro de membrana de acetato de celulose descartável recém-aberto (tamanho de poros 0,22 μm, 25 mm de diâmetro). Em seguida, enxágue o filtro de membrana com 1 mL de supernasal. Coloque a unidade de filtro de seringa enxaguada em uma garrafa de polipropileno de boca larga (PP) de 20 mL.</li>
	<li>Filtre o restante sobrenante através de um filtro de membrana de acetato na garrafa PP de 20 mL. Armazene os extratos a −20 °C até uma análise mais aprofundada.</li>
</ol>5. Captura de NH4+ em 2M H2SO4 absorvido ao filtro GF/D no envelope PTFE e a oxidação persulfato de NH4+ a NO3−
<ol><li>Prepare soluções padrão de 14NH4Cl com gradientes de concentração de 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L e 500 μmol/L. Para a análise da razão de 15N, fixar a concentração total de NH4+ a 200 μmol/L e preparar as relações de isótopos de 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50, e 10:90 com soluções padrão puras 14NH4Cl e 15NH4Cl.</li>
	<li>Transfira 30 mg de MgO (cinzas a 450 °C por 4 h) para um frasco de vidro de 20 mL e coloque o envelope PTFE no frasco.</li>
	<li>Transfira 5 mL de uma amostra ou padrão para o frasco contendo o MgO e o envelope PTFE, e feche imediatamente com uma rolha de borracha de butyl cinza. Vedação com uma tampa de alumínio. Se a concentração de NH4+ for esperada para exceder 500 μmol/L, diluir a amostra para abaixo de 500 μmol/L.</li>
	<li>Agite os frascos a 150 rpm por 3h a 4 °C em condições escuras.</li>
	<li>Remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl. Tire o envelope PTFE do frasco usando pinças pontiagudas, enxágue completamente o envelope e a pinça com água trocada por íons, limpe-os com um papel de limpeza e, em seguida, coloque o envelope em um papel de limpeza fresco.</li>
	<li>Abra o envelope PTFE com um par de pinças (o uso da pinça de ponta plana e ponta é recomendado) na ordem exata de ordem inversa do dobrável realizado nas etapas 1.4-1.7.</li>
	<li>Segure a área periférica do filtro GF/D, onde o H2SO4 deve ser desvendado, com a pinça de ponta plana, e transfira-a para um tubo de ensaio de tampa de parafuso de 11 mL com uma tampa forrada com PTFE. Enxágüe as pinças com água trocada por íons e limpe-as com papel de limpeza.</li>
	<li>Repita as etapas 5.5-5.7 para os envelopes restantes.</li>
	<li>Adicione 1 mL de água trocada de íons a cada um dos tubos de ensaio, feche a tampa do parafuso e mantenha-a sem tremer por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente para elutar completamente o NH4+ do filtro GF/D. Durante esta etapa, realize a etapa seguinte (etapa 5.10) em paralelo.</li>
	<li>Prepare o reagente persulfate-oxidante (POR)25,26.<ol>
<li>Como não pode ser armazenado, prepare a quantidade exata de POR necessária para o tratamento de um único dia de amostras.</li>
		<li>Para preparar o POR para tratar 50 amostras, despeje 100 mL de água trocada por íons em uma garrafa de tampa de parafuso de 200 mL e adicione 1,52 g de NaOH (grau de análise composto de nitrogênio), 3 g de ácido bórico e 5 g de K2S2O8 (grau de análise de nitrogênio e fósforo) nessa ordem. Imediatamente após adicionar cada reagente, agite a solução até que ela seja completamente dissolvida.</li>
		<li>Se necessário, mergulhe a garrafa em água morna para ajudar na dissolução dos produtos químicos; no entanto, deve-se prestar atenção em relação à contaminação do Nº3– porque a água da torneira normalmente contém o Nº3−.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a etapa 5.8, abra a tampa do parafuso, adicione 2 mL do reagente POR ao tubo de ensaio e feche o tubo firmemente com uma tampa de parafuso para evitar qualquer perda ou contaminação durante as etapas seguintes.</li>
	<li>Coloque os tubos de ensaio em um rack, enrole-os em papel alumínio de duas camadas e autoclave-os por 1h a 121 °C. Mantenha os tubos em posição vertical durante esta etapa e evite mudanças rápidas de temperatura após o término do autoclaving.</li>
</ol>6. Determinando o NO3− convertido a partir de NH4+ pelo método denitrifier usando quadrupole GC/MS
<ol><li>Misture 100 mL de tampão fosfato estéril de 40 mmol/L (pH 7,2) e 100 mL de glicose estéril de 30 mmol/L asepticamente (fosfato de 20 mmol/L e glicose de 15 mmol/L; final).</li>
	<li>Adicione um volume de 1/7,2 volume de estoque de glicerol de C. clororaphis a 200 mL da solução de glicose tamponada com fosfato em um frasco de Erlenmeyer de 300 mL, e purga com um He ultra-puro (>99,995%) fluxo por 1 h.</li>
	<li>Dispense 2,0 mL da suspensão denitrifier em cada frasco de 5 mL. Tampe os frascos com uma rolha de borracha de butyl cinza e um fechamento de alumínio.</li>
	<li>Substitua o ar da cabeça por he ultra-puro, aspirando por 3 minutos e carregando o He por 1 min. Coloque a pressão positiva do gás do headspace para 1,3 atm para evitar contaminação de ar não intencional.</li>
	<li>Injete 1 mL de uma amostra ou padrão através da rolha de borracha butil usando uma seringa descartável de 1 mL. Note a quantidade exata da amostra injetada.</li>
	<li>Incubar os frascos durante a noite a 25 °C em condições escuras.</li>
	<li>Injete 0,3 mL de 6-mol/LL NaOH para parar a denitrificação e absorver o CO2do headspace, o que de outra forma perturbará seriamente a análise N2O por GC/MS porque o CO2 e o N2O têm o mesmo peso molecular.</li>
	<li>Determine as quantidades de 44N2O, 45N2O e 46N2O no gás headspace usando quadrupole GC/MS com uma porta de injeção modificada25. As condições de funcionamento utilizadas para a análise GC/MS estão mostradas na Tabela 2.</li>
</ol>7. Análise de dados
<ol><li>Derivar a curva de calibração para o NH4+ concentração da relação linear entre a concentração conhecida de 14NH4+ e as intensidades de sinal medidos do total produzido 44N2O + 45N2O + 46N2O. Derivar a curva de calibração para o teor de 15N da relação linear entre o átomo conhecido% (ou seja,. 15N/14N+15N) e o átomo calculado% usando uma equação previamente fornecida27. Calcule a concentração de 15NH4+ multiplicando o total de NH4+ pela razão de 15N de NH4+.</li>
	<li>Calcule a taxa potencial de DNRA usando equações fornecidas em outros lugares28,,29,30.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A razão de concentração e isótopo de NH4+ para a análise DNRA foi quantificada utilizando vários métodos. As concentrações e as relações de isótopos de NH4+ são geralmente medidas separadamente. A concentração NH4+ é tipicamente medida usando métodos colorimétricos, incluindo um autoanalyzer4,10,15,16,<sup class="xref"...

A síntese artificial do fertilizante nitrogênio e sua aplicação generalizada têm perturbado muito o ciclo global de nitrogênio. Estima-se que a transferência de nitrogênio reativo de sistemas terrestres para costeiros dobrou desde o pré-industrial1. Uma porção significativa de fertilizantes aplicados a um determinado campo é levada do solo para rios ou águas subterrâneas, principalmente como nº3− 2. Isso pode causar problemas ambientais, como a poluição da água potável, a eutrofização e a formação de hipóxia. NO3− em ambientes hídricos é removido ou retido no ecossistema através de assimilação biológica e vários processos dissimlatórios microbianos. A denitrificação e a anammox são conhecidas por serem os principais processos de remoção microbiana para o NO3−. A denitrificação é a redução microbiana de produtosN− N gasoso (NO, N2O e N2) juntamente com a oxidação de um doador de elétrons, como substâncias orgânicas, reduzindo assim o risco dos problemas acima mencionados. A Anammox também produz N2 a partir de NO2− e NH4+; portanto, remove n inorgânico de um ecossistema. Por outro lado, a DNRA trabalha para reter n em um ecossistema; é geralmente aceito que o DNRA é realizado principalmente por bactérias fermentativas ou quimiotoautotróficas e que reduzem o dissimlatório NO3– à NH 4+4+ biodisponente e menos móvel.
Estudos sobre DNRA têm sido realizados principalmente em ecossistemas marinhos ou estuarinos, como sedimentos oceânicos ou estuarinos e água, solo salgado ou salgado e solo de manguezal. Ecossistemas costeiros ou marinhos são importantes como reservatórios para a remoção do Nº3– dos ecossistemas terrestres, e em estudos anteriores o DNRA tem se mostrado contribuinte em uma gama muito ampla de NO3− remoção (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Além disso, a existência do DNRA tem sido demonstrada em uma ampla gama de ambientes, incluindo ambientes de água doce19,solos de arroz20e solosflorestais 21. Embora esses estudos tenham demonstrado que o DNRA é potencialmente comparável à denitrificação para o NO3− remoção, os estudos que medem a atividade de DNRA ainda são muito limitados em comparação com aqueles que medem a denitrificação.
A taxa de DNRA foi avaliada utilizando-se 15técnicas de rotulagem N em conjunto com a análise de dados por meio de modelos analíticos ou numéricos. Uma solução analítica para calcular a taxa DNRA baseia-se no aumento do enriquecimento de 15N do pool NH4+ após a adição de 15NO3− como rastreador. 15 N-rotulado NO3− é adicionado a uma amostra e incubado, e a taxa de DNRA pode então ser calculada a partir da concentração e da razão isótopo alterações na NH4+ antes e depois de um determinado período de tempo. Neste artigo, um método para quantificar a concentração NH4+ e a razão isótopos, que são necessários para calcular a taxa de DNRA, é descrito em detalhes. Basicamente, o método aqui relatado é uma combinação de várias técnicas relatadas anteriormente22,23,24,25,26 com modificações adicionadas a alguns procedimentos. O método é composto por uma série de cinco procedimentos componentes: (1) incubação de uma amostra ambiental com a alteração de um rastreador de isótopos estáveis, 15NO3−, (2) extração e recuperação de NH4+ utilizando um "procedimento de difusão" com modificações, (3) oxidação persulfato de NH4+ na amostra, constituído por NH4+ e 15NH4+ derivados de 15NO3− via atividade DNRA, em NO3− e 15NO3−, (4) posterior transformação microbiana de NO3− e 1 5NO3− para N2O isotopomers através do método denitrifier modificado, e (5) quantificação dos isotopolímeros N2O usando cromatografia a gás espectrometria de massa (GC/MS). Na seção seguinte, primeiro, a preparação para procedimentos (2) e (4) é descrita e, posteriormente, todos os cinco procedimentos componentes são descritos detalhadamente.

<table><tbody><tr><td>15N-KNO3</td><td>SHOKO SCIENCE</td><td>N15-0197</td><td></td></tr><tr><td>15N-NH4Cl</td><td>SHOKO SCIENCE</td><td>N15-0034</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de PP de 20 mL</td><td>SANPLATEC</td><td>61-3210-18</td> Tampa de alumínio <td>de boca larga</td></tr><tr><td></td><td>Maruemu</td><td>1307-13</td><td>No. 20, com orifício</td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>bóricoWako</td><td>021-02195</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>HITACHI</td><td>Himac CR21G II</td><td></td></tr><tr><td>Pressão de Gás Desoxigenado & Substitua o injetor</td><td>SANSIN INDUSTRIAL</td><td>IP-12</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de membrana de acetato de celulose descartável</td><td>ADVANTEC</td><td>25CS020AS</td><td>Tamanho do poro 0,22 &micro; m, 25 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Seringa descartável</td><td>Termo</td><td>SS-10SZ</td> Seringa descartável <td>de 10 mL</td></tr><tr><td></td><td>Termo</td><td>SS-01T</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato Tampolado com Solução Salina (-)</td><td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td><td>5913</td><td></td></tr><tr><td>Seringa à prova de gás</td><td>VICI Valco Instruments</td><td>4075-15010</td><td>Série A-2, 100 &micro; L</td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>shimadzu</td><td>GCMS-QP2010ultra</td><td></td></tr><tr><td>GF/D</td><td>Whatman</td><td>1823-010</td><td>10 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Frasco de vidro</td><td>Maruemu</td><td>0501-06</td><td>20 mL</td></tr><tr><td>Rolha de borracha butílica cinza</td><td>Maruemu</td><td>1306-03</td><td>No.20-S</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Wako</td><td>192-04696</td><td>Reagente Garantido</td></tr><tr><td>K2S2O8</td><td>Wako</td><td>169-11891 Grau de</td><td>análise de nitrogênio e fósforo</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td>Reagente garantido</td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Wako</td><td>160-04035</td><td>Reagente garantido</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>191-08625 Grau de</td><td>análise de compostos de nitrogênio</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>017-02995</td><td>Reagente Garantido</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de plástico</td><td>ASONE</td><td>1-3500-22</td><td>50 mL, VIO-50BN</td></tr><tr><td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>ATCC 13985</td><td>Liofilizado, a cepa tipo de Pseudomonas aureofaciens</td></tr><tr><td>Fita de vedação PTFE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z221880</td><td>25 mm de largura</td></tr><tr><td>Agitador alternativo</td><td>TAITEC</td><td>0000207-000</td><td>NR-10</td></tr><tr><td>Tubo de ensaio com tampa de rosca</td><td>IWAKI</td><td>84-0252</td><td>11 mL</td></tr><tr><td>Tampa revestida com PTFE para tubo de ensaio</td><td>IWAKI</td><td>84-0262</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico</td><td>Difco Laboratories</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

medição das taxas potenciais de redução de nitrato dissimlatório para amônio com base em 14nh4+/15nh4+ análises via conversão sequencial para n2o

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

A importância de entender o destino do nitrato (NO3−), que é a espécie N dominante transferida de ecossistemas terrestres para aquáticos, tem aumentado porque as cargas globais de nitrogênio aumentaram drasticamente após a industrialização. A redução do nitrato dissimlatório para o amônio (DNRA) e a denitrificação são processos microbianos que usam o NO3– para respiração. Em comparação com a denitrificação, as determinações quantitativas da atividade DNRA têm sido realizadas apenas em uma medida limitada. Isso levou a uma compreensão insuficiente da importância do DNRA no Nº3– transformações e os fatores reguladores desse processo. O objetivo deste artigo é fornecer um procedimento detalhado para a medição da taxa potencial de DNRA em amostras ambientais. Em suma, a taxa potencial de DNRA pode ser calculada a partir da taxa de acumulação de amônio com rótulo N 15NH (15NH4+) em 15NO3− incubação adicionada. A determinação das concentrações 14NH4+ e 15NH4+ descritas neste artigo é composta pelas etapas a seguir. Primeiro, o NH4+ na amostra é extraído e preso em um filtro de vidro acidificado como sal de amônio. Em segundo lugar, o amônio preso é elucido e oxidado para o Nº3- via oxidação persulfeto. Em terceiro lugar, o NO3− é convertido para N2O através de um N2O reductase denitrifier deficiente. Finalmente, o N2O convertido é analisado usando um sistema de espectrometria de gás quadrúpole previamente desenvolvido. Aplicamos este método aos sedimentos de pântanos salgados e calculamos suas potenciais taxas de DNRA, demonstrando que os procedimentos propostos permitem uma determinação simples e mais rápida em comparação com os métodos descritos anteriormente.

Os resultados representativos apresentados neste artigo foram derivados de 15experimentos de rastreamento n de sedimentos de pântanos salgados. O pântano de sal amostrado foi recentemente criado após o Grande Terremoto do Japão Oriental de 2011 na área de Moune da cidade de Kesen-numa, na província de Miyagi, japão. Em setembro de 2017, sedimentos superficiais (0-3 cm) foram coletados em dois locais nas zonas subtidal e intertidais. Primeiro, logo após a coleta, o sedimento foi...

Uma série de métodos para determinar a taxa potencial de DNRA com base em 14NH4+/15NH4+ análises é fornecida em detalhes. NH4+ é convertido em N2O através de várias etapas e analisado usando cromatografia de gás quadrupole-espectrometria de massa.

Medição das Taxas Potenciais de Redução de Nitrato Dissimlatório para Amônio Com base em 14NH4+/15NH4+ Análises via Conversão Sequencial para N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Os ecossistemas costeiros e marinhos são importantes como reservatórios, para a remoção de nitrato de ecossistemas terrestres. O nitrato no ambiente aquático pode ser consumido por vários processos simultaneamente. Como denitrificação, anammox e DNRA.Embora estudos anteriores tenham demonstrado que o DNRA é potencialmente culpado pela denitrificação, estudos que medem a atividade do DNRA ainda são muito limitados em comparação com aqueles que medem a denitrificação. Em nosso protocolo, fornecemos um procedimento detalhado para a medição da taxa potencial de DNRA em amostras ambientais. Acreditamos que a taxa potencial de DNRA pode ser calculada a partir do acúmulo de amônio rotulado N15 com adição de nitrato rotulado N15.A vantagem do nosso método em comparação com outros métodos, é que o amônio é finalmente convertido em óxido nitroso, que tem um baixo fundo atmosférico. Também não é sábio que medimos óxido nitroso através de espectrômetro de massa de gás quadrupole. O que é menos caro e fácil de gerenciar do que um espectrômetro de massa de razão de isótopos.Primeiro, coloque um pedaço de fita PTFE de 60 milímetros em uma pequena folha de papel alumínio. Ash um filtro de fibra de vidro a 450 graus Celsius por quatro horas em um forno de abafa. Em seguida, coloque o filtro de fibra de vidro um pouco acima do ponto médio do eixo mais longo da fita.Em seguida, local 20 microliters de 0,9 mols por litro de ácido sulfúrico no centro do filtro de fibra de vidro, e imediatamente dobre a fita PTFE usando selo de final plano e pinças retas. Vire a fita PTFE sobre o filtro de fibra de vidro e, em seguida, sele ambos os lados da fita PTFE dobrando e, em seguida, pressionando firmemente a borda com a pinça. Usando a pinça, dobre a extremidade aberta da fita PTFE e pressione a borda.Sele a extremidade aberta da fita PTFE pressionando firmemente a borda com a pinça, tomando cuidado para não pressionar o filtro de fibra de vidro. Transfira 30 miligramas de óxido de magnésio cinzas para um frasco de vidro de 20 mililitros, e coloque o envelope PTFE no frasco. Transfira cinco mililitros de uma amostra ou padrão previamente preparado para o frasco contendo o óxido de magnésio e o envelope PTFE.E imediatamente feche o frasco com uma rolha de borracha de butyl cinza. Em seguida, sele o frasco com uma tampa de alumínio. Agite os frascos a 150 RPM por três horas a quatro graus Celsius em condições escuras.Na sequência, remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl de cada frasco. Remova o envelope PTFE de cada frasco usando pinças de ponta e enxágue completamente o envelope e a pinça com água trocada por íons. Em seguida, limpe o envelope e as pinças com papel limpo, e coloque o envelope em papel de limpeza fresco.Abra o envelope PTFE com pinças pontiagudas e pontas em ordem inversa das etapas dobráveis. Usando pinças de ponta plana, segure a área periférica do filtro de fibra de vidro, onde o ácido sulfúrico deve ser não absorvido. E transfira para um tubo de teste de tampa de parafuso de 11 milímetros.Enxágüe as pinças com íons trocadas de água e limpe-as com papel de limpeza. Adicione um mililitro de íon trocado água a cada tubo de ensaio. Feche os tubos de ensaio com tampas de parafuso forradas ptfe e deixe-os ficar em pé por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente, para iludir completamente a cáção de amônio do filtro de fibra de vidro.Na sequência, abra a tampa do parafuso, adicione dois mililitros de um reagente de solução oxidante persulfeto previamente preparado ao tubo de ensaio e feche o tubo firmemente com uma tampa de parafuso, para evitar qualquer perda ou contaminação durante as etapas seguintes. Coloque os tubos de ensaio em um rack, enrole-os em papel alumínio em camada dupla e autoclave-os em uma posição vertical por uma hora a 121 graus Celsius. Misture 100 mililitros de 40 mililitros por litro tampão fosfato, e 100 mililitros de 30 mililitros por litro de glicose asepticamente.Adicione um estoque de glicerol de P.chlororaphis a 200 mililitros da solução de glicose tamponada fosfato, em um frasco de 300 mililitros Erlenmeyer. E purgar com um fluxo de hélio ultra puro por uma hora. Em seguida, dispense dois mililitros de uma suspensão denitrifier previamente preparada em frascos de cinco mililitros.Tampe cada frasco com uma rolha de borracha de butyl cinza, e um fechamento de alumínio. Substitua o ar do Headspace por hélio ultra puro, aspirando por três minutos e carregando o hélio por um minuto. Coloque a pressão positiva do gás Headspace em 1,3 atmosferas, para evitar contaminação de ar não intencional.Injete um mililitro de uma amostra ou padrão através da rolha de borracha butil, usando uma seringa descartável de um mililitro. Em seguida, incubar os frascos durante a noite a 25 graus Celsius, em condições escuras. No dia seguinte, injete 0,3 mililitros de seis mols por litro de hidróxido de sódio para parar a denitrificação e absorver o dióxido de carbono do Headspace, que de outra forma perturbará a análise de óxido nitroso.Porque dióxido de carbono e óxido nitroso têm o mesmo peso molecular. Determine as quantidades de óxido nitroso com um peso molecular de 44, 45 e 46, no gás Headspace usando quadrupole GC/MS com uma porta de injeção modificada. Os resultados representativos foram derivados de 15 experimentos de rastreamento de nitrogênio de sedimentos de pântanos de sal criados a partir do Grande Terremoto do Japão Oriental de 2011 na área lunar da cidade de Kesennuma e da província de Miyagi, no Japão.Observou-se aumento da concentração de amônio rotulado ao longo do período de incubação para todos os sedimentos coletados nas zonas subtidal e intertidacidade. As taxas de DNRA estavam dentro da faixa de 24,8 a 177. E são comparáveis aos valores relatados em estudos anteriores, mas superiores aos valores derivados de ambientes semelhantes.A alta taxa de DNRA pode ser explicada pelo pântano de sal sendo usado como um campo de cultivo antes do terremoto. Consistente com a especulação, a taxa de DNRA na zona intertidal, que é rica e orgânica em comparação com a zona subtidal, foi maior. Nosso protocolo é amplamente aplicável à análise de vias metabólicas, que envolve formação de amônio e adições de traços N15.

measurement-potential-rates-dissimilatory-nitrate-reduction-to

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Demonstramos a extração de amônio de um fluxo rico em amônio usando um sistema eletroquímico e um bioeletroquímico. A configuração, operação e análise de dados do reator são discutidas.

Recuperação de Amónio Eletroquimicamente e Bioelectrochemically Induzida

as emissões de amoníaco são uma grande ameaça para o meio ambiente, a eutrofização, a acidificação dos solos ea formação de partículas finas e derivam principalmente de origem agrícola. Este método permite medições de perda de amoníaco em ensaios de campo replicados permitindo análise estatística de emissões e de relações entre o desenvolvimento das culturas e das emissões.

Calibrado amostragem passiva - Multi-enredo medições de campo de NH<sub&gt; 3</sub&gt; Emissões com uma combinação de método do tubo Dinâmico e amostradores passivos

Aqui, apresentamos pequenas incubações de núcleo para a medição da troca sedimento-água, gás e soluto. Eles fornecerão medições confiáveis da troca sedimento-água que avaliam o papel do sedimento em influenciar processos biológicos e biogeoquímicos em ecossistemas aquáticos.

A Bolsa Benthic de O<sub&gt; 2</sub&gt;, N<sub&gt; 2</sub&gt; e nutrientes dissolvidos Usando pequeno núcleo incubações

O óxido nítrico (NO) é uma importante molécula de sinalização na homeostase vascular. A produção de NO in vivo é muito baixa para medição direta. A quimioluminescência fornece informações úteis sobre o ciclo de NO por meio da medição de seus precursores e produtos de oxidação, nitrito e nitrato. A determinação de nitrito / nitrato nos tecidos e fluidos do corpo é explicada.

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Trabalhos anteriores sugerem que a composição isotópica de nitrogênio dos óxidos de nitrogênio atmosféricos pode distinguir a influência de diferentes fontes no ambiente. Relatamos um método automatizado, móvel e baseado em campo para a alta eficiência de coleta de NOx atmosférico para análise isotópica de N em uma resolução de tempo horário.

Automatizado, de alta resolução Sistema de Coleta Móvel para a análise de azoto isotópica de NO<sub&gt; x</sub

Amônia pode ser sintetizada na baixa pressão usando um catalisador convencional e um absorvente seletivo de amônia.

Síntese de amônia a baixa pressão

Α-hidroxilação de nitrosaminas cancerígenas pelo citocromo P450s é a aceita via metabólica que produz o DNA de danos intermediários, que causam mutações. No entanto, novos dados indicam mais pode ocorrer oxidação para nitrosamides. Descrevemos um general método para a detecção de nitrosamides produzidos a partir de em vitro citocromo P450-catalisada metabolismo de nitrosaminas.

Um método geral para detectar a formação de Nitrosamide no metabolismo In Vitro de nitrosaminas por citocromo P450s

Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.

Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Este método estima taxas de desnitrificação do sedimento em núcleos de sedimentos usando os acetileno inibição técnica e microsensor medições de acumulada N2O. O protocolo descreve procedimentos para a recolha dos núcleos, calibrando os sensores, realizando a inibição de acetileno, medindo o acúmulo de N2O e cálculo da taxa de desnitrificação.

Estimando taxas de desnitrificação do sedimento usando núcleos e N2O Microssensores

Um projeto de microtrama para pesquisa de rastreador de 15N é descrito para acomodar múltiplos eventos de amostragem de plantas e solos na estação. São apresentados procedimentos de coleta e processamento de amostras de solo e plantas, incluindo protocolos de moagem e pesagem, para análise de 15N.

Projeto de microtrat e preparação de amostras de plantas e solo para 15análises de nitrogênio

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Aprenda a medir taxas potenciais de DNRA em amostras ambientais usando isótopos de nitrogênio-15 e cromatografia gasosa-espectrometria de massas. Este método avança a compreensão do ciclo do nitrogênio em ecossistemas costeiros e marinhos.

Medição das Taxas Potenciais de Redução de Nitrato Dissimlatório para Amônio Com base em 14NH4+/15NH4+ Análises via Conversão Sequencial para N2O (Vídeo) | JoVE Journal

Medição das Taxas Potenciais de Redução de Nitrato Dissimlatório para Amônio Com base em ¹⁴NH₄⁺/¹⁵NH₄⁺ Análises via Conversão Sequencial para N₂O

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