Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético
23 de agosto de 2019
Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo. os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.
Isolar as células progenitoras musculares humanas que regulam a regeneração muscular esquelética nos permite investigar processos que fundamentam o processo regenerativo, mantendo a variabilidade do doador. Esta técnica permite que grandes rendimentos de células progenitoras musculares humanas sejam obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido e sua análise fenotípica usando um pequeno número de células. Este método foi especificamente projetado para isolar as células progenitoras musculares humanas para rastrear suas capacidades de proliferação e diferenciação e relacionar esses dados ao processo regenerativo do músculo esquelético.
O aspecto mais difícil desta técnica bastante simples é garantir que cada passo seja realizado de forma reprodutível para otimizar o rendimento e a pureza das células. Existem várias etapas que precisam ser completadas para o isolamento bem sucedido das células. Vários passos são mais fáceis de entender se forem observados visualmente.
Para isolar as células progenitoras musculares humanas do tecido da biópsia, coloque o tecido muscular em uma placa de Petri estéril em condições estéreis, e use um bisturi estéril para picar o tecido em pedaços cubos de um milímetro. Quando todo o tecido tiver sido picado, transfira os pedaços para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de PBS, e permita que os tecidos se assentem pela gravidade antes de aspirar cuidadosamente o supernante sem perturbar o tecido. Depois de lavar os fragmentos uma segunda vez como apenas demonstrado, substitua o PBS por 10 mililitros de baixa glicose dulbecco médio águia modificado.
Remova o supernasciente depois que os tecidos foram instalados, e resuspense os pedaços em três mililitros de meio de digestão. Coloque os tecidos a 37 graus Celsius por 30 minutos, com trituração dos fragmentos musculares a cada 10 minutos com uma pipeta sorológica de um mililitro. Ao final da incubação, adicione 83 microliters de meio de digestão adicional e 24 microliters de solução dispase às amostras, e triturar os tecidos a cada cinco a 10 minutos com uma ponta de pipeta larga até que um chorume uniforme seja alcançado.
Um chorume uniforme é importante para a recuperação máxima das células progenitoras musculares humanas. Continue a digestão se o chorume não passar por uma ponta de pipeta padrão de 1.000 microliter. Para isolar as células Pax7 positivas, colorindo e gate as células de acordo com o protocolo.
Classifique as células progenitoras musculares humanas CD56, CD29 duplamente positivas em um cítmetro de fluxo com um bocal de 100 micrômetros a uma pressão de 20 libras por polegada quadrada em tubos de coleta contendo uma almofada de 300 microliter de tampão de classificação celular ativado pela fluorescência. Em seguida, semeou as células progenitoras musculares humanas classificadas em placas revestidas de colágeno com 24 poços contendo meio de crescimento pré-aquecido a uma concentração quadrada de 3,5 vezes 10 vezes às quatro células por centímetro. Para realizar varreduras de confluência, carregue a placa em um cítmetro de imagem e selecione Criar nova varredura e a categoria da placa, perfil da placa e ID da placa.Sob aplicação, selecione Confluência e Confluência 1 e selecione um poço para visualizar.
Localize um plano de foco no qual as células pareçam brancas em comparação com o plano de fundo e selecione Registrar Manual. Use o mouse para destacar todos os poços que precisam ser digitalizados e selecione Iniciar Varredura. Toda a área do poço será digitalizada automaticamente.
Selecione as configurações de análise ideais para o tipo de placa e célula e selecione Análise inicial. Use o cítmetro de imagem para medir a confluência inicialmente. Em seguida, para contar as células no citômetro de imagem, substitua o meio em cada poço por 200 microliters de solução de coloração.
Após 15 minutos a 37 graus Celsius, substitua a solução de coloração por 100 microliters de F12 fresco de Ham. Retorne a placa ao cítmetro de imagem e, em Aplicação, selecione Viabilidade celular e Total morto vivo. O canal Live será uma imagem de campo brilhante, o canal Dead mostrará a mancha de iodeto de propídio, e o canal Total será a mancha hoechst 33342.
Em Configuração de foco, clique em Registrar auto. Sob o canal Total, defina o canal para azul. Use o Find Focus para colocar os núcleos em foco e clique em Definir Deslocamento para selecionar o foco.
Sob o canal Dead, defina o canal como vermelho, e use Find Focus para colocar as células mortas em foco. Clique em Definir Deslocamento para selecionar o foco e selecione Iniciar varredura para iniciar a varredura. Em seguida, selecione os parâmetros de análise apropriados para o tipo de placa e célula e selecione Iniciar Análise para iniciar a análise.
Quando a análise estiver completa, verifique visualmente se a análise contabilizou adequadamente as células. Se a varredura e a análise forem satisfatórias, devolva a placa à incubadora, caso contrário, rescane ou modifique os parâmetros de análise. As células progenitoras musculares humanas podem ser identificadas por eventos de primeira gating baseados na área de dispersão lateral e para a frente para eliminar células mortas ou detritos, seguidos pela seleção apenas das células que são negativas para 7-AAD e, portanto, são viáveis.
As células positivas para os marcadores de superfície celular CD56 e CD29 representam então a população celular progenitora muscular humana. As células progenitoras musculares humanas também podem ser identificadas por sua expressão Pax7. De fato, pax7 é enriquecido na população total após FACS e é mantido através de múltiplas passagens.
Aqui, uma varredura de confluência representativa é mostrada. Os contornos verdes foram gerados pelo citômetro de imagem e mostram como o cítmetro de imagem determinou a confluência com base nas configurações de análise selecionadas. Uma heterogeneidade e contagem de núcleos é comum entre doadores.
Descobrir e caracterizar com precisão essa heterogeneidade é uma aplicação fundamental do citômetro de imagem. As medidas de confluência e a contagem de núcleos de doadores únicos, no entanto, estão altamente correlacionados. Células progenitoras musculares humanas diferenciadas para formar miotubes podem ser distinguidas por sua expressão embrionária de cadeia pesada de miosina.
É importante ser consistente ao selecionar os parâmetros de gating no citômetro de fluxo, a fim de isolar a mesma população de células de cada doador. Uma vez isoladas, as células progenitoras musculares humanas podem ser usadas para múltiplos propósitos, incluindo a identificação dos requisitos metabólicos únicos de proliferação e diferenciação das células progenitoras musculares humanas. O isolamento das células progenitoras musculares humanas permitiu a discriminação das diferenças na expressão do marcador de superfície celular nas células progenitoras musculares humanas e do camundongo.
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Visão Geral
Este artigo apresenta técnicas para o isolamento e caracterização de células progenitoras musculares primárias humanas (hMPCs) a partir de tecido de biópsia muscular esquelética. Esses métodos permitem aos pesquisadores investigar a miogênese humana e a regeneração do músculo esquelético.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Medicina Regenerativa
Antecedentes
- As células progenitoras musculares humanas desempenham um papel crucial na regeneração do músculo esquelético.
- O isolamento dessas células permite o estudo dos processos regenerativos levando em consideração a variabilidade entre doadores.
- As técnicas de isolamento celular devem ser reprodutíveis para garantir rendimento e pureza ideais.
- A observação visual das etapas de isolamento pode aprimorar a compreensão.
Objetivo do Estudo
- Isolar células progenitoras musculares humanas para pesquisas sobre regeneração muscular.
- Analisar as capacidades de proliferação e diferenciação dessas células.
- Relacionar os achados ao processo global de regeneração do músculo esquelético.
Métodos Utilizados
- Isolamento de hMPCs a partir de tecido de biópsia muscular esquelética.
- Caracterização das células isoladas.
- Análise fenotípica utilizando pequenas quantidades de células.
- Acompanhamento da proliferação e das capacidades de diferenciação.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de hMPCs a partir de amostras mínimas de tecido.
- A caracterização das células demonstra seu potencial para aplicações em pesquisa.
- A reprodutibilidade do método garante resultados confiáveis.
- São obtidos insights sobre o processo regenerativo do músculo esquelético.
Conclusões
- As técnicas apresentadas são eficazes para o isolamento e estudo de hMPCs.
- Esses métodos podem aprofundar o entendimento sobre a regeneração muscular.
- Pesquisas futuras podem se basear nesses achados para explorar aplicações terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e a caracterização de células progenitoras musculares humanas (hMPCs) a partir de biópsias de músculo esquelético permitem a redução mecanicista de riscos na validação de alvos de regeneração muscular. Essa abordagem apoia a triagem fenotípica e o desenvolvimento de ensaios ao fornecer um sistema relevante para a doença com heterogeneidade de doadores que reflete a variabilidade clínica. O método aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao associar a capacidade de expansão celular aos resultados regenerativos do músculo esquelético.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas a vias de regeneração do músculo esquelético.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da validação funcional da proliferação e diferenciação de hMPCs.
- Valor Científico: Facilita a confiança no alvo ao relacionar fenótipos celulares aos processos regenerativos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor científico: Fornece um sistema padronizado e reprodutível para o preparo de amostras biológicas validadas para triagem subsequente.
- Valor operacional: Permite medições quantitativas de confluência e contagem de núcleos utilizando citometria de imagem para padronização de ensaios.
- Valor científico: Apoia a escalabilidade do ensaio e a reutilização da plataforma por meio de protocolos consistentes de isolamento e semeadura.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece um sistema relevante para a doença para estudar a variabilidade na capacidade de expansão entre doadores, informando o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Valor Operacional: Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, mantendo a expressão de Pax7 e o potencial de diferenciação em miotubos.
- Valor Científico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao identificar os mecanismos subjacentes à heterogeneidade no potencial regenerativo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se à continuidade do descobrimento, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e a avaliação pré-clínica, fornecendo fenótipos celulares quantificáveis e estratificados por doador.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir o rastreamento da proliferação e diferenciação de hMPCs isoladas.
- Triagem: Garante prontidão e reprodutibilidade do ensaio por meio da digestão padronizada de tecidos, separação por FACS e plaqueamento em placas revestidas com colágeno.
- Análises: Gera escaneamentos quantitativos de confluência e contagens de núcleos que permitem comparação entre doadores e avaliação de condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da manutenção da capacidade de diferenciação miogênica e da expressão da cadeia pesada da miosina embrionária nos miótubos formados.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho de isolamento e caracterização reutilizável, aplicável a múltiplas amostras de doadores e condições experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da associação entre expansão celular e capacidade regenerativa.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade no rendimento e pureza celulares por meio de etapas otimizadas de digestão e separação.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de prosseguir/interromper projetos ao permitir a avaliação estratificada por doador da funcionalidade de células progenitoras musculares.
- Impacto no Portfólio: Priorização baseada em risco de alvos regenerativos utilizando métricas de capacidade de expansão informadas pela heterogeneidade.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de tecidos primários, citometria de fluxo e citometria por imagem para o isolamento e análise de células viáveis.
- Depende de infraestrutura estéril de cultura de tecidos, equipamentos de separação celular ativada por fluorescência e plataformas automatizadas de imagem.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de seleção por portas (gating) para CD56/CD29 e Pax7 para garantir identificação consistente de hMPCs entre diferentes doadores.
- Requer considerações de adaptação para variações na qualidade do tecido doador e no tamanho da biópsia, a fim de manter a eficiência do isolamento.
- As limitações práticas incluem a variabilidade dependente do doador na produção celular e na cinética de expansão, exigindo tamanhos maiores de amostra para obter poder estatístico.
