Name: Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a analisar espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco hematopoiéticas murinas e leucemia MLL-AF9 por citometria de fluxo. Este método permite avaliar manipulações genéticas e estados redox celulares.

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Este trabalho foi apoiado pelo Fox Chase Cancer Center Conselho de administração (DDM), a sociedade americana de Hematologia Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) e do departamento de defesa (Award #: W81XWH-18-1-0472).

Todos os procedimentos animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) no Fox Chase Cancer Center.
Nota: O fluxo de trabalho do protocolo é dividido em 4 partes conforme apresentado na Figura 1 e os reagentes necessários estão listados na tabela de materiais.
1. isolação da medula óssea (BM)
Nota: Os ratos da leucemia de MLL-AF9 foram gerados como descrito previamente11.
<ol><li>Recupere pilhas mono-nucleares da medula, como descrito previamente12,13,14,15, do tipo selvagem camundongos C57. Bl6 (que expressam o marcador do CD 45,2 congênicos) assim como de C57. Camundongos Bl6-SJL (que expressam o marcador congênico CD-m) que foram transplantados com células de leucemia expressando MLL-AF9 (CD 45,2+). Nota: O BM pode ser recuperado dos ratos ou esmagando12,13 ou nivelando os ossos14,15. Para os experimentos aqui apresentados, a BM foi recuperada de camundongos saudáveis e de leucemia via rubor.</li>
</ol>2. coloração de corante Fluorogênico de ROS mitocondrial
<ol><li>Uma vez que as pilhas mono-nucleares da medula foram recuperadas dos ratos saudáveis e/ou da leucemia, manchar uma alíquota das pilhas com azul de trypan e contar usando um hemocitômetro para determinar o número começar de pilhas totais do BM.</li>
	<li>Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min. aspirar o sobrenadante e ressuscitem o pellet em F-PBS (PBS suplementado com 2% soro fetal bovino e um 1% penicilina/estreptomicina cocktail) para uma concentração de 2 x 106 células/ml.</li>
	<li>Alíquota 200 μL de suspensão celular por tubo em 9 tubos de controlo de cor única rotulados da seguinte forma: Nenhuma mancha, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (para HSPCs saudável somente), CD 45,2-APC (para pilhas da leucemia somente), CD34-FITC, tintura mitochondrial dos ROS e mancha viva/inoperante da pilha. Nota: Opcional Um controle positivo para a indução de ROS mitochondrial pode ser preparado tratando 2 x 105 pilhas em 200 μl com 20 ΜM do bissulfito de sódio do Menadione (MSB) para 1 h em 37 ° c em uma incubadora de 5% co2 . Um segundo controle para inverter a indução mediada por MSB de ROS mitochondrial pode ser preparado tratando 2 x 105 pilhas em 200 μl com 20 ΜM de MSB mais 100 μm N-acetil-L-cisteína (NAC) para 1 h em 37 ° c em uma incubadora de 5% co2 .</li>
	<li>Aliquot as pilhas restantes em um tubo (tubo experimental) e Centrifugue em 300 x g por 5 minutos.</li>
	<li>Resuspend as pilhas em F-PBS com uma mancha viva/inoperante da pilha de acordo com as instruções do fabricante. Incubar no gelo por 30 min. Certifique-se de adicionar a mancha viva/inoperante ao tubo de controle da único-cor.</li>
	<li>Adicionar 1,0 mL de temperatura ambiente (RT) F-PBS para ambos os tubos de cor única e experimental manchado com o corante vivo/morto. Centrifugar 5 min a 300 x g em RT.</li>
	<li>Resuspend 50 μg do corante mitocondrial de ROS em 13 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) para obter uma solução de estoque de 5 mM.</li>
	<li>Diluir a tintura mitocondrial de ROS para uma concentração final de 5 μM em RT F-PBS com ou sem verapamil (50 μM).</li>
	<li>Aspirar fora da lavagem da mancha viva/inoperante da pilha. Adicionar 200 μL de coloração de corante de ROS mitocondrial contendo Verapamil a cada tubo experimental, bem como o tubo de controlo de cor única de corante ROS mitocondrial.</li>
	<li>Vortex para misturar e incubar por 10 min a 37 ° c no escuro.</li>
	<li>Adicione 1,0 mL de RT F-PBS ao controle de cor única e tubos experimentais com coloração de ROS mitocondrial. Centrifugar 5 min a 300 x g em RT.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e lavar as células com um adicional de 1,0 mL de RT F-PBS. Centrifugar 5 min a 300 x g em RT.</li>
</ol>3. coloração do anticorpo da linhagem
<ol><li>Prepare os coquetéis de anticorpos listados na tabela 1. Nota: Estescocktails de anticorposforam otimizados anteriormente14,15,16.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante da lavagem final de corante ROS mitocondrial dos tubos experimentais contendo BM saudável e adicionar 200 μL de cocktail de anticorpos #1 a cada tubo. Vortex para misturar. Também prepare os tubos de controle de cor única. Incubar por 60 min no gelo no escuro.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante da lavagem final de corante ROS mitocondrial dos tubos experimentais contendo leucemia BM e adicionar 200 μL do coquetel de anticorpos #2 para cada tubo. Vortex para misturar. Incubar por 60 min no gelo no escuro.</li>
	<li>Lave com 1,0 mL de F-PBS frio e Centrifugue 5 min a 300 x g em RT.</li>
	<li>Reressuscita as células em 500 μL de F-PBS a frio e filtre as células em um tubo de citometro de fluxo usando um filtro de 40 μm para excluir agregados.</li>
</ol>4. aquisição e análise de citometria de fluxo
Nota: Diversos subconjuntos hematopoietic da haste e do progenitor são raros, tais como pilhas de haste hematopoietic a longo prazo. Assim, idealmente 3-5 milhões de eventos devem ser coletados para cada tubo experimental durante a aquisição de citometria de fluxo para análise suficiente de ROS mitocondriais nos vários subconjuntos de HSPC.
<ol><li>Use o tubo de controle sem mancha para definir as parcelas de dispersão para frente (FSC-A) e lateral (SSC-A) com base no tamanho e na complexidade da população de células analisada.</li>
	<li>Use os tubos de controle da nenhum-mancha e da único-cor para compensar o cytometer do fluxo.</li>
	<li>Portão fora detritos estranhos do gráfico de dispersão para a frente e lateral (Figura 2a, B, primeiro painel da esquerda).</li>
	<li>Porta para fora doublets usando um discriminador duplo, como o discriminador para a frente (Figura 2a, B, segundo painel da esquerda).</li>
	<li>Siga a estratégia de gating proposta na Figura 2a,B para selecionar células ao vivo, linhagem células baixas e os vários subconjuntos hspc e leucemia.</li>
	<li>Para cada população de interesse, analisar a intensidade de fluorescência mediana (MFI) do canal TRPE (eixo x) em um gráfico de histograma para avaliar as diferenças no sinal de ROS mitocondrial (Figura 3a-C, painéis esquerdos). Os níveis de ROS mitochondrial podem ser avaliados a nível da único-pilha comparando ROS mitochondrial que mancham contra marcadores específicos da linhagem em um gráfico de dispersão.</li>
</ol>

<ol><li>Dröse, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li>
<li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li>
<li>Höhn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Happily+%28n%29ever+after%3A+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress%2C+proteostasis+loss+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li>
<li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+inflammation%2C+and+cancer%3A+how+are+they+linked%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li>
<li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+cell+state+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899(2018).</li>
<li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li>
<li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li>
<li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li>
<li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li>
<li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li>
<li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT%2FFOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li>
<li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776(2008).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li>
<li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li>
<li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li>
<li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Corantes fluorogênicos que foram desenvolvidos para a detecção de Eros são freqüentemente avaliados em células fixas por microscopia ou em células ao vivo por citometria de fluxo22. A avaliação citométrica do fluxo de Ros mitochondrial em pilhas de BM usando tinturas cromogênicos fluorogênicos mitocondrial dos Ros tem duas vantagens principais: 1) é uma técnica rápida e simples que seja apropriada para a análise viva da pilha e 2) permite distinguir e analisar raro populações no nível de célula ún...

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas altamente reativas derivadas de oxigênio molecular. A localização celular mais bem definida da produção de Eros é a mitocôndria, onde elétrons que passam pela cadeia de transporte de elétrons (ETC) durante a fosforilação oxidativa (OXPHOS) são absorvidos por oxigênio molecular, levando à formação de um específico tipo de ROS denominados superóxidos1. Através das ações de uma série de enzimas, chamadas superóxido superóxido ou Sods, os superóxidos são convertidos em peróxidos de hidrogênio, que são posteriormente neutralizados em água por enzimas como catalase ou glutationa peroxidases (GPX). Perturbações nos mecanismos de regulamentação de ROS podem levar ao excesso de produção de Eros, muitas vezes referido como estresse oxidativo, que têm conseqüências celulares prejudiciais e potencialmente letais, como danos de macromoléculas (ou seja, DNA, proteínas, lipídios). Além disso, o estresse oxidativo está relacionado a diversas patologias, como diabetes, doenças inflamatórias, envelhecimento e tumores2,3,4. Para manter a homeostase redox e prevenir o estresse oxidativo, as células possuem uma variedade de mecanismos de regulação de ROS5.
Os níveis fisiológicos de certas Eros são necessários para a hematopoiese embrionária e adulta adequada6. No entanto, o excesso de Eros está associado a danos no DNA, diferenciação celular e exaustão da haste hematopoiética e do grupo progenitor. Há também evidências de que alterações na biologia redox podem diferir entre leucemia e células saudáveis. Por exemplo, os níveis de Ros tendem a ser mais elevados em células de leucemia mielóide aguda (AML) em relação aos seus homólogos saudáveis e outros estudos sugeriram que as células-tronco de leucemia mantêm um baixo nível de estado estacionário de Ros para a sobrevivência7,8. É importante ressaltar que as estratégias para capitalizar terapeuticamente nessas diferenças redox mostraram-se promissora em váriasconfigurações de câncerhumano9,10. Portanto, os ensaios que permitem a avaliação dos níveis de Eros em modelos de camundongo podem melhorar nossa compreensão de como essas espécies contribuem para a fisiologia celular e a patogênese da doença, bem como potencialmente fornecem uma plataforma para avaliar a eficácia da novo redox-visando terapias anti-câncer.

<table><tbody><tr><td>FBS VWR Seradigm inativado por calor</td><td>LIFE SCIENCE</td><td>97068-085</td><td>Mídia</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>Mídia</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>Tampão</td></tr><tr><td>15 mL tubo cônico</td><td>BD falcon</td><td>352096</td><td>Suprimentos para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>BD falcon</td><td>352098</td><td>Tissue Suprimentos de Cultura</td></tr><tr><td>40 &mu; filtros de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Suprimentos para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-9751</td><td>Suprimentos para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Menadiona bissulfito de sódio</td><td>Sigma aldrich</td><td>M5750</td><td>Pro-oxidante</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma aldrich</td><td>A7250</td><td>Anti-oxidante</td></tr><tr><td>CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td><td>Biolegend</td><td>100310</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td><td>eBioscience</td><td>15-0041-81</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td><td>eBioscience</td><td>15-0081-81</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td><td>Biolegend</td><td>115510</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103210</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108410</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td><td>Biolegend</td><td>116210</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td><td>Biolegend</td><td>103420</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>CD117&nbsp; Clone APC-Cy7 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105825</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Sca1 peacific Clone azul D7</td><td>Biolegend</td><td>108120</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>CD150 Clone APC TC15-12F12.2</td><td>Biolegend</td><td>115909</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>CD34 FITC clone RAM34</td><td>BD Bioscience</td><td>553733</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>CD45.2 APC clone 104</td><td>Biolegend</td><td>1098313</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M36008</td><td>Dye</td></tr><tr><td>Mitotracker Verde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Dye Vivo/Morto Amarelo Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34967</td><td>Dye</td></tr></tbody></table>

análise citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas murinas e leucemia acionada por mll-af9

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Nós apresentamos uma aproximação cytometric do do fluxo para analisar ROS mitochondrial na vária medula viva (BM)-populações derivadas da pilha da haste e do progenitor dos ratos saudáveis assim como ratos com AML conduzido por MLL-AF9. Especificamente, nós descrevemos um processo de coloração da pilha de duas etapas, por meio de que as pilhas saudáveis ou da leucemia BM são manchadas primeiramente com um corante cromogênicos fluorogênicos que detecte superóxidos mitochondrial, seguidos manchando com os anticorpos monoclonais fluorochrome-lig que são usados para distinguir várias populações hematopoiéticas saudáveis e malignas do progenitor. Também fornecemos uma estratégia para a aquisição e análise das amostras por citometria de fluxo. Todo o protocolo pode ser realizado em um prazo tão curto quanto 3-4 h. Destacamos, também, as principais variáveis a serem consideradas, bem como as vantagens e limitações do monitoramento da produção de Eros no compartimento mitocondrial de subpopulações hematopoiéticas e de leucemia de tronco e progenitoras ao vivo, utilizando corantes fluorogênicos por citometria de fluxo . Além disso, nós apresentamos dados que a abundância mitochondrial dos Ros varia entre subpopulações saudáveis distintas do hspc e progenitores da leucemia e discutimos as aplicações possíveis desta técnica na pesquisa hematológicas.

Apresentado é um método para análise de ROS nas mitocôndrias de múltiplas populações de progenitoras de leucemia, saudáveis e MLL-AF9. A Figura 1 exibe uma visão esquemática do fluxo de trabalho do protocolo, que consiste em 4 etapas principais: 1) isolamento BM de camundongos; 2) coloração das células BM com corante fluorogênico que reconhece ROS mitocondrial, particularmente superóxidos; 3) mancha do anticorpo do marcador de superfície para delinear várias populações hematopoiéticas saudáv...

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Espécies reativas de oxigênio ou ROS, são espécies de oxigênio altamente reativas que são produzidas por células, e influencia seu comportamento. Embora o excesso de ROS também possa causar estragos celulares generalizados, e em casos graves, morte celular. Assim, a manutenção da homeostase ROS é de fundamental importância para a função celular e a sobrevivência.O protocolo aqui apresentado, foca na medição de um tipo específico de ROS, que é gerado por mitocôndrias, principalmente como subproduto metabólico em populações de células hematopoiéticas vivas, normais ou saudáveis, bem como em células de leucemia do modelo de camundongos de câncer de sangue, Leucemia Mielóide Aguda ou LMA. Este protocolo também pode ser usado para avaliar como a manipulação genética, como a exclusão genética ou a superexpressão, impacta a ROS mitocondrial em várias populações hematopoiéticas saudáveis e malignas. E como resultado, potencialmente fornecer informações perspicazes sobre o estado redux e possivelmente o metabolismo das células.Esta técnica autoriza a análise métrica de liquidação de fluxo de uma sonda protogênica para monitorar a produção de ROS mitocondrial em hastes hematopoiéticas vivas e malignas e sub-populações progenitoras. Este protocolo é simples e pode ser concluído em poucas horas. Além disso, é adequado para análise de células vivas e permite distinguir e analisar ros mitocondrial na população de células-tronco na medula óssea, utilizando marca superficial de coloração.Depois de coletar células mononucleares de medula óssea de camundongos selvagens e camundongos MLL-AF9 leucômicos, de acordo com o manuscrito, aliquot 200 microliters da suspensão celular em cada um dos nove tubos de controle de cor única. Alíquotar as células restantes em outros tubos experimentais, 200 microliters cada. Em seguida, coloque em uma centrífuga dois tubos experimentais contendo células de medula óssea e células leucêmicas, respectivamente, e um tubo de controle.Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos. Em seguida, decante o supernasce, e suspenda as células em temperatura ambiente F-PBS com uma mancha de célula viva/morta, de acordo com as instruções do fabricante. Incubar no gelo por 30 minutos.Depois, adicione 1 mililitro de F-PBS de temperatura ambiente aos três tubos manchados vivos/mortos, e um único tubo de controle de cor para coloração mitocondrial ros. Coloque os tubos na centrífuga a 300 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, obtenha uma solução de estoque de corante ROS mitocondrial de 5 milimolar suspensa, suspendendo novamente 50 microgramas de corante ROS mitocondrial em 13 microliters de DMSO.Em seguida, adicione 13 mililitros de temperatura ambiente F-PBS ao corante ROS mitocondrial de 13 microliteres para diluir a uma concentração final de cinco micromolares. Se necessário, adicione 13 microlitadores de 50 milimães Verapamil à solução para inibir bombas efflux mitocondrial. Obtenha os tubos da centrífuga e aspire a lavagem da mancha de célula viva/morta.Adicione 200 microliters de F-PBS no controle de coloração ao vivo/morto e mantenha-o no gelo até que esteja pronto para iniciar a análise. Adicione 200 microliters da mancha de corante ROS mitocondrial contendo Verapamil, a cada tubo experimental, bem como o tubo de controle de manchas ROS mitocondrial. Vórtice para misturar e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius no escuro.Em seguida, adicione 1 mililitro de F-PBS de temperatura ambiente ao controle e tubos experimentais. Centrífuga cinco minutos a 300 vezes G à temperatura ambiente. Aspire fora do supernamento e lave as células com um mililitro adicional de temperatura ambiente F-PBS.Centrifugar novamente por cinco minutos a 300 vezes G, em temperatura ambiente. Primeiro, prepare dois coquetéis de anticorpos para células saudáveis e leucemias de medula óssea. Aspire o supernaente do tubo experimental contendo células saudáveis da medula óssea, e adicione 200 microliters do coquetel de anticorpos número um ao tubo.Vórtice para misturar. Prepare também os tubos de controle de cor única adicionando 200 microliters de F-PBS e um microliter do anticorpo correspondente. Incubar por 60 minutos no gelo no escuro.Aspire o supernaente do tubo experimental contendo leucemia medula óssea, e adicione 200 microliters do coquetel de anticorpos número dois, ao tubo. Vórtice para misturar. Incubar por 60 minutos no gelo no escuro.Depois disso, lave todos os tubos com 1 mililitro de F-PBS frio e centrífuga por cinco minutos a 300 vezes G em temperatura ambiente. Suspenda as células em 500 microliters de F-PBS frios. Transfira a suspensão celular para cada tubo de citômetro de fluxo com um filtro de 40 micrômetros para excluir agregados.Primeiro, insira um tubo de controle de manchas na máquina de citometria de fluxo e inicie a aquisição para compensar a máquina de citometria de fluxo. Repita para outros tubos de controle. Depois, leia os tubos experimentais para montar os portões.Para analisar o tamanho e a complexidade da população celular, primeiro para o HSPC saudável, defina a área de dispersão para a frente e as populações de áreas de dispersão lateral. Pressione o botão Square Gate, para retirar detritos ímpares do gráfico de dispersão para a frente e para o lado. Em seguida, em uma área de dispersão para a frente e parcela de altura, use um discriminador duplo para gate out doublets.Selecione células vivas, células baixas de linhagem e os vários HSPC saudáveis. Para cada população de interesse, analise a intensidade mediana da fluorescência do canal TRPE em um lote de histagram, para avaliar diferenças no sinal ROS mitocondrial. Repita o mesmo procedimento de análise de tamanho, gating e histograma traçando para populações de leucemia.As células de medula óssea isoladas de camundongos saudáveis foram manchadas com um corante ros vivo/morto e um corante ROS mitocondrial, e posteriormente manchadas com anticorpos reconhecendo marcadores de linhagem:plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 e CD150. Além disso, as células de medula óssea de camundongos com leucemia também foram manchadas com CD45.2 para discriminar entre células de leucemia MLL-AF9 de células de medula óssea saudáveis manchadas com CD45.1. Uma comparação da coloração ros mitocondrial, entre LSK negativo CD48 saudável e progenitores mieloides, mostra que os progenitores mieloides apresentam níveis significativamente mais elevados de coloração ros mitocondrial.Além disso, os progenitores de leucemia c-Kit apresentam níveis significativamente mais elevados de coloração ros mitocondrial, em comparação com células de baixa leucemia intermediárias c-Kit, LSK negativo CD48 saudável e progenitores mieloides. C-Kit células intermediárias de baixa leucemia, também apresentaram um valor significativamente maior em comparação com as células LSK negativas CD48, mas não para progenitores mieloides. Os corantes ROS mitocondrial são altamente reativos e são necessários passos de lavagem apropriados para garantir que qualquer excesso do corante tenha sido removido antes de iniciar as etapas seguintes.Existem vários corantes fluorogênicos ROS quimicamente distintos que podem ser usados neste protocolo, para obter um pouco de conhecimento do status redux em células hematopoiéticas vivas. Esta técnica tem sido amplamente utilizada na literatura, podendo fornecer insights úteis sobre as vias metabólicas e de sinalização que são reguladas diferencialmente em células de leucemia, se comparadas com suas contrapartes normais.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Este manuscrito fornece um processo técnico que pode ser utilizado para caracterizar culturas de células C1498 in vitro e a leucemia aguda induzida em ratos após a sua injecção. análises fenotípicas e funcionais são realizadas utilizando citometria de fluxo, microscopia de imunofluorescência, citoquímica e coloração May-Grünwald Giemsa.

Um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina C1498 e seu Modelo Associated leucemia mouse

Detecção de doença residual mínima ou mensurável (MRD) é um biomarcador prognóstico importante para avaliação do risco de refinação e predizer a recaída em leucemia mieloide aguda (LMA). Estas orientações abrangentes e recomendações com as melhores práticas para consistente e exata identificação e detecção de MRD, pode ajudar na tomada de decisões de tratamento eficazes AML.

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) transitam de um estado quiescente para um estado de diferenciação devido à sua plasticidade metabólica durante a formação sanguínea. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a respiração mitocondrial e a glicolíse dos HSPCs.

Análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste

Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

Aprenda a analisar espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco hematopoiéticas murinas e leucemia MLL-AF9 por citometria de fluxo. Este método permite avaliar manipulações genéticas e estados redox celulares.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9 (Vídeo) | JoVE Journal

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

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