Name: Fabricação de microgrânulos de alginato de secreção de amiloide-β para uso na modelagem da doença de Alzheimer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprenda a fabricar microgrânulos de alginato para encapsular células 7PA2 e controlar a liberação sustentada de amiloide-β em modelos de doença de Alzheimer. Este método permite estudar mecanismos neurodegenerativos in vitro e in vivo.

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Os autores gostariam de agradecer ao senhor deputado Kajen Suresparan, ao Dr. Jonathan Wubetu, ao senhor deputado Dominik Grudzinski, à senhora Chen Zhao e ao Dr. Thierry Pilot a sua ajuda na optimização da fabricação de microesferas de alginato, da cultura celular e da deteção de aβ, e de Discussões.

1. os preparativos
<ol><li>Prepare 100 mL de ~ 4% (w/v) solução de estoque de alginato.<ol>
<li>Pesar 4,4 g de sal de sódio de alginato e adicionar o pó seco a 100 mL de soro fisiológico tamponado HEPES (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) com 150 mM de NaCl (0,877 g) em água desionizada permitindo a hidratação.</li>
		<li>Use um agitador magnético em ~ 500 rotações por o minuto (rpm) e aqueça a até 50 ° c para permitir a hidratação completa do alginato. Nota: o alginato pode necessitar de uma ou duas horas para ser completamente hidratado. Para economizar tempo, a solução de alginato pode ser feita com um dia de antecedência do protocolo de encapsulamento e armazenada a 4 ° c até o dia seguinte. Quando alginato foi refrigerado, aqueça suavemente a 37 ° c usando um banho de água ou uma placa quente e agite com um agitador magnético imediatamente antes de usar.</li>
		<li>Filtro estéril a solução do alginato usando um filtro do polietersulfona do pore do μm 0,22 (PES) antes de usar. A filtragem é recomendada em 37 ° c para permitir o fluxo fácil de alginato. A viscosidade aumentará se a temperatura for permitida para cair.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 1.000 mL de 0,5 M CaCl2.<ol>
<li>Pesar 55,49 g de CaCl anidro2 e dissolver em 1.000 ml de HBS (20 mm hepes e 150 mm NaCl em 1.000 ml de água desionizada).</li>
		<li>Filtro estéril usando um filtro PES de poros de 0,22 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 100 mL de mistura de dissolução.<ol>
<li>Prepare uma solução de 100 mM de HEPES (23,83 g) e de 500 mM de citrato trisódico (147, 5 g) em soro fisiológico tamponado com fosfato.</li>
		<li>Ajuste ao pH 7,4 usando NaOH ou HCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Configurando o sistema de encapsulamento
<ol><li>Limpe a capa do fluxo laminar.<ol>
<li>Sterilize a capa do fluxo laminar que contem o encapsulator usando a exposição UV seguida pulverizando com solução do ethanol de 70% v/v.</li>
		<li>Lave o sistema encapsulator com 10 mL de solução de etanol 70% v/v seguido de 10 mL de água desionizada estéril.</li>
		<li>Fixe o bocal 300 μm e repita o passo 2.1.2.</li>
		<li>Pulverize o frasco que contem a solução filtrada do alginato, o frasco que contem a solução filtrada do cloreto de cálcio e todas as ferramentas, equipamento e placas vazias da cultura que serão usadas com 70% v/v solução do ethanol e coloc as na capa do fluxo laminar. Antes de usar, ligue uma luz UV novamente por 30 min para esterilizar completamente.</li>
		<li>Prepare um copo waste enchido com uma solução desinfetante da classe biológica e coloc a taça na capa.</li>
		<li>Encha uma taça com 100 mL de solução estéril de CaCl2 (aquosa) e acrescente um agitador magnético. Defina a velocidade de agitação para 100 RPM. Coloque a taça sobre uma plataforma magnética a uma altura de 18 cm da ponta do bocal. Este béquer será usado para coletar grânulos de alginato e permitir a sua gelação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as células para encapsulamento.<ol>
<li>Retire as células da incubadora e retire-a do balão próximo-confluente utilizando 0,25% de solução de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° c durante 5-10 min.</li>
		<li>Isolar uma amostra para estimar a densidade celular e, em seguida, Centrifugar as células restantes em 1.000 rpm por 5 min para obter um pellet celular.</li>
		<li>Ressuscita a pelota em HBS (20 milímetros HEPES e 150 milímetros NaCl) para dobrar a concentração desejada final da pilha (por exemplo, para uma concentração final de 1,5 x 106 Cells/ml, ressuscita as pilhas em HBS para conseguir uma concentração de 3 x 106 Cells/ml).</li>
		<li>Em um tubo de centrífuga de 50 mL, misture a suspensão celular em uma proporção de 1:1 com ~ 4% (w/v) solução de alginato para obter uma suspensão final contendo a concentração de células desejada (por exemplo, 1,5 x 106 células/ml) em uma solução de alginato ~ 2% (w/v).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina os parâmetros de encapsulamento.<ol>
<li>Defina a velocidade da máquina encapsulator para a velocidade máxima de extrusão (8,9 mL/min), a voltagem para 1,0 kV e a frequência para 5.500 Hz. Nota: estes parâmetros foram previamente otimizados para obter microesferas de 550 μm de diâmetro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fabricação
<ol><li>Fabricar os microgrânulos.<ol>
<li>Numa seringa de 20 mL, carregue 5 mL da suspensão de alginato de células e prenda uma seringa ao encapsulator.</li>
		<li>Inicie o encapsulator ativando o fluxo que irá empurrar a suspensão de alginato de células através do alimentador. Um córrego das gotas será expulso através do bocal.</li>
		<li>Colete os primeiros 1 mL na taça de resíduos para anular o fluxo inicial não uniforme.</li>
		<li>Continue a executar os restantes 4 mL, permitindo que as gotas caiam no banho de gelação CaCl2 . Cada mililitro pode ser executado separadamente (mas sucessivamente) e recolhidos em quatro banhos de gelação diferentes, se necessário. Nota: após o contato com o banho de gelação, o alginato nas gotas irá instantaneamente atravessar-ligação com os íons de cálcio no banho de gelação e formar microesferas esféricas.</li>
		<li>Após um minuto, retire a taça de geladura da plataforma magnética e permita que os microgrânulos se sentem por mais 4 min sem agitação (tempo necessário para permitir a gelação completa através dos microgrânulos à temperatura ambiente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recupere microesferas.<ol>
<li>Remova qualquer grande alginato de detritos ou artefatos usando um par de pinças estéreis, e então use uma pipeta plástica estéril para transferir para um filtro de malha de 74 μm para recuperar os microgrânulos do banho de gelação.</li>
		<li>Transfira os microgrânulos em um tubo de centrifugação usando o meio de cultura apropriado e deixe-o equilibrar por 5 min no meio de cultura celular.</li>
		<li>Transfira para um balão, placa ou prato de Petri para incubação e outras experiências. Nota: o banho de Gelação não deve ser reutilizado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. teste e uso de microesferas
<ol><li>Teste a qualidade do microbead.<ol>
<li>Para avaliar a viabilidade celular (ou outros readouts biológicos) após a encapsulação e cultura, interrompa suavemente os microgrânulos para liberar as células encapsuladas usando a mistura de dissolução. Nota: o volume necessário de mistura de dissolução depende do número de microgrânulos utilizados por teste. Uma ração sugerida é de 4 mL de mistura de dissolução a cada 1 mL de células encapsuladas. Esta etapa precisa somente de ser executada em uma única amostra FRO cada população do microbead.</li>
		<li>Incubar as células em uma incubadora de cultura celular suplementada com 5% CO2 a 37 ° c por 10 min.</li>
		<li>Estimar a viabilidade celular para as células agora em solução como de costume, manchando as células com azul Tripan e usando uma câmara hemocitômetro. Nota: se estiver usando contadores de células automatizadas para estimativas de viabilidade celular, deve-se tomar cuidado para evitar artefatos de alginato interferindo com as contagens. Nesses casos, a contagem de células nauais é aconselhada.</li>
		<li>Para avaliar a estabilidade do microgrânulo, meça o diâmetro médio para uma amostra de cada população do microbead sobre um curso do tempo usando um software do microscópio e da imagem latente. As variações subseqüentes dramáticas no diâmetro podem ser indicativas da degradação do alginato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use microesferas para detecção de aβ secretado.<ol>
<li>Amostra de mídia de cultura celular de células 7PA2 cultivadas em condições padrão (2D) em intervalos de 24 h e armazenar a-20 ° c para posterior análise.</li>
		<li>Amostra de mídia de cultura celular de células 7PA2 encapsuladas cultivadas em condições padrão (3D) em intervalos de 24 h e armazenar a-20 ° c para posterior análise.</li>
		<li>Detecte a secreção de aβ de células 7PA2 em meios condicionados coletados por ensaio imunoenzimático (ELISA) (Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use os microgrânulos para o estudo mais adicional em aplicações relevantes. Nota: as células 7PA2 encapsuladas podem ser usadas para avaliar os efeitos da secreção sustentada de aβ em qualquer ou modelo.<ol>
<li>Para o Engraftment do microbead dentro do hipocampo do rato nos cérebros, gere seções coronais grossas de 1 milímetro do cérebro do rato e use ferramentas cirúrgicas para introduzir microesferas na área desejada (Figura 5).</li>
		<li>Encapsular diferentes tipos de células em microgrânulos de alginato seguindo os protocolos descritos para avaliar a liberação sustentada das biomoléculas de interesse. Sistemas in vitro e in vivo relevantes podem ser modelados mais adiante.</li>
		<li>Detecte a expressão de marcadores ligados à membrana de células encapsuladas usando citometria de fluxo e/ou imunofluorescência. Nota: um exemplo do uso de um método similar para a fabricação de microesferas que modela estágios adiantados do crescimento maciço do tumor e da expressão do biomarcador é descrito por rios 20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito neste artigo é útil para encapsuar células atingindo uma distribuição de tamanho estreito de microesferas de alginato27. Ele também oferece a vantagem de células crescentes em um ambiente imuno-isolado17,18, protegendo-os do stress externo. Adicionalmente, a encapsulação de células em alginato mais estreitamente imita as condições fisiológicas, especificamente no que diz respeito às interações célula-célula e rigidez da matriz20. Estes fatores são todos particularmente cruciais para o uso subseqüente em aplicações relevantes, tais como o Engraftment in vivo, impedindo reações imunes potenciais no tecido circunvizinho17. Além disso, uma grande vantagem deste protocolo é a fácil tuneability de acordo com a aplicação de interesse: é possível modificar o protocolo e otimizar os parâmetros para a fabricação de grânulos maiores ou menores, e mais macios ou mais duros. O método descrito é usado para fabricar grânulos pequenos o suficiente para serem injetados com métodos minimamente invasivos, e suficientemente grandes o suficiente para sediar um número de células e fornecer uma liberação suficiente de aβ para resultar em efeitos comportamentais e patológicos observáveis após a injecção em modelos animais.
O sucesso deste protocolo é dependente de um número de etapas críticas. A manipulação de pilha cuidadosa e as técnicas óptimas da cultura da pilha são importantes manter a viabilidade e a função da pilha20,28. Usar condições padrão da cultura assegura a conservação da função normal de 7PA2 pilhas, como observado. Isso permite que um perfil de liberação semelhante para aβ1-42 de células encapsuladas quando comparado com culturas 2D. Além disso, para que o protocolo funcione de forma otimizada, uma solução de alginato de baixa viscosidade garante melhores resultados em comparação com uma solução de alginato de alta viscosidade. Isto assegura-se de que um jato laminar homogêneo seja expulso através do bocal e de uma distribuição uniforme das pilhas dentro da matriz dos grânulos fabricados27. Os materiais usados para encapsular as células devem ter um mecanismo de gelação muito rápido, permitindo a retenção da forma.
Outro passo crítico neste protocolo é o manuseio de microgrânulos fabricados após a gelação. Aqui, nós mostramos a recuperação de microesferas usando uma pipeta plástica da grande abertura para transferir os grânulos. Alternativamente, derramar a solução do cloreto de cálcio que contem os microesferas em um filtro da malha pode ser usado para a recuperação do grânulo. Uma pipeta sorológicos grande (5, 10 ou 25 ml) pode ser usada para elaborar os microesferas e lavado então através do filtro da malha em vez do derramamento. A vantagem deste é uma confiança mais elevada na esterilidade do procedimento comparado a derramar. No entanto, das limitações é que alguns grânulos podem ser distorcidos se eles são compactados pela pipeta, além de arriscar um rendimento mais baixo se uma grande proporção de microesferas não são resgatados.
Esta abordagem tem sido usada para encapsular diferentes linhagens celulares para modelar e estudar diferentes doenças (por exemplo, liberação de insulina de Illet pancreático encapsulado). A novidade de nossa aproximação é o Engraftment dos microesferas gerados usando este protocolo como um método útil em modelar aspectos importantes da doença de Alzheimer in vivo. Ao comparar o perfil de liberação de aβ de células encapsuladas (Figura 4) aos níveis de aβ gerados por uma injeção de bóus (como o relatado em outros estudos3,26), uma liberação mais crônica e sustentada de aβ pode ser Esperado. A Figura 6 ilustra a tendência prevista que pode ser alcançada. Usar este sistema para a modelagem in vivo é mais relevante para a forma como a doença progride e pode ser mais útil na descoberta e desenvolvimento de fármacos.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg"> Figura 6 : Perfil de libertação previsto de aβ1-42 a partir de células 7pa2 encapsuladas em comparação com uma injecção em bóus. O perfil da liberação de aβ dos microesferas enxertado 7pa2-contendo permite o teste dos efeitos do aβ crônico e sustentado em um modelo animal da relevância a AD. Inversamente, uma injeção do bolus criaria um ponto em níveis de aβ durante um curto período de tempo, seguido por uma liberação rápida de aβ do cérebro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Modelar a doença neurodegenerativa é desafiador devido à natureza complexa e intrincada do cérebro. Na doença de Alzheimer (AD), acredita-se que a perda progressiva da função sináptica e morte dos neurônios seja um efeito a jusante da superprodução sustentada e acúmulo de peptídeos beta amilóide (aβ) após o processamento anormal do precursor amiloide proteína (app) de acordo com a hipótese da cascata do amilóide1.
A fim compreender os mecanismos desta patologia amyloid-induzida e ajudar na identificação de alvos novos do tratamento, os cientistas desenvolveram vários modelos in vivo pré-clínicos. Uma categoria de modelos utiliza uma injeção do bolus de um peptide sintético do aβ no cérebro2,3,4do rato. A principal limitação de tais modelos é que eles dependem de um único ponto ou tratamentos repetidos com peptídeos aβ em altas concentrações depositadas de uma só vez. Isso é incompatível com a natureza crônica e sustentada da liberação de aβ na doença5. Outra categoria de modelos in vivo é modelos animais transgênicos expressando uma ou mais mutações genéticas ligadas às variações familiares dadoença6,7, 8,9, 10. no entanto, uma vez que a AD familiar só responde por menos de 5% de todos os casos de Alzheimer11, a relevância destes modelos na tradução para a AD esporádica em seres humanos é questionável12. Outra desvantagem da abordagem transgênica é a formação acelerada de aβ desde o nascimento, que se traduz em déficits na função cognitiva e alterações patológicas de forma muito rápida e agressiva para se assemelhar à progressão da doença em AD esporádico em pacientes12 . Por exemplo, o modelo 5x FAD produz chapas em tão pouco quanto 1,5 meses13.
Curiosamente, ambas as categorias resultam em mudanças na função cognitiva de relevância para a pesquisa de anúncios2,3,4,5,6, e às vezes eles são acompanhados pelo aparecimento de características patológicas da doença, tais como placas amilóides6,8, fosforilação Tau6,7 e/ou perda sináptica e neuronal7,9, a 14. Mas enquanto esses tipos de modelos podem nos dar uma visão sobre os efeitos de altos níveis de amiloide no cérebro, que são freqüentemente associados com estágios posteriores da AD, eles não refletem as alterações anteriores expostas em resposta à exposição crônica e sustentada ao aβ peptídeo12, como expressão alterada de marcadores sinápticos15 e componentes na matriz extracelular16. Portanto, ainda resta a necessidade de criar um modelo crônico que ilustra com mais precisão os efeitos da secreção sustentada de aβ na cognição in vivo e ilustra as mudanças na patologia.
Para este fim, nós desenvolvemos um sistema que permita a secreção constante, sustentada de aβ em uma maneira controlada imobilizando pilhas amyloid-secreting dentro dos microbeads do hidrogel, que podem subseqüentemente ser implantados dentro do cérebro adulto do rato para modelar aspectos de AD esporádico.
O alginato foi o biomaterial selecionado por ser biocompatível e não induz nenhuma resposta adversa quando implantado in vivo17. A encapsulação de células em hidrogéis de alginato tem sido bem estabelecida nas últimas quatro décadas. O primeiro exemplo de sua tradução para a clínica foi relatado para o tratamento do diabetes mellitus tipo 117. O relatório o mais adiantado do encapsulamento bem sucedido das ilhotas de Langerhans remonta a 1980. A transplantação de microesferas que contem pilhas decontenção revolucionou opções do tratamento para pacientes do diabético como restaurou a função pancreatic, eliminando a necessidade para a terapia da injeção do insulin18. Estes trabalhos relatam em como o encapsulamento da pilha pode protegê-los das tensões externas, se mecânico ou químico. De facto, os grânulos do alginato actuam como uma barreira e isolam pilhas do ambiente circunvizinho que preservam seu phenotype, enquanto permitindo o acesso suficiente aos meios circunvizinhos para nutrientes e afastamento de subprodutos celulares19. Além disso, o uso de alginato permite a correspondência de propriedades mecânicas do tecido mole20. Os hidrogéis de alginato podem ser ajustados para ter uma rigidez de 1-30 kPa, simplesmente variando a concentração de alginato e a densidade de cross-linking20,21. Este é um aspecto essencial, não só para manter a expressão fenotípica de células encapsuladas in vitro, mas também para evitar quaisquer efeitos inflamatórios após o Engraftment in vivo22.
Neste protocolo, as células 7pa2-uma linha de células de ovário de hamster chinês que é estavelmente transfected com um humano app V717F mutado gene23 -são usados. Estas células produzem continuamente produtos catalíticos de aplicação, incluindo aβ1-4224,25, e têm sido utilizados para gerar aβ como uma alternativa à produção sintética em estudos pré-clínicos, agudos in vivo26. Nós descrevemos um método da fabricação para imobilizar as pilhas 7PA2 dentro dos microbeads do alginato do ' macio ', projetados permitir a secreção sustentada das biomoléculas. Como uma prova de conceito, nós relatamos na liberação do peptídeo aβ1-42 ao longo do tempo. O alginato que é usado é um alginato de baixa viscosidade com um peso molecular de 120.000-190000 g/mol e uma relação mannuronic a oligo de 1,56 (M/g).
Em uns estudos mais adicionais, estes microesferas podem com segurança ser transplantados dentro das regiões do cérebro do rato da relevância a AD (por exemplo, o Hippocampus) para estudar os efeitos da secreção crônica de aβ no comportamento in vivo e na patologia ex vivo. Além disso, este sistema pode ser usado para estudar os efeitos da liberação crônica de aβ em aplicações in vitro e ex vivo. Por exemplo, os microgrânulos de alginato contendo 7PA2 podem ser cocultivados in vitro com culturas neuronais ou astrocíticas para avaliar os efeitos da exposição crônica aβ em mecanismos celulares associados à AD. Além disso, este método pode ser usado para examinar a relação entre a produção crônica de Aβ e a potenciação a longo prazo na eletrofisiologia ex vivo.
O destaque deste protocolo é a modularidade e flexibilidade do método de fabricação, o que possibilita a fabricação de grânulos de alginato com uma dimensão alvo por parâmetros de fabricação de ajuste fino. Dependendo da aplicação, o protocolo pode ser ajustado para obter alvos medida com relação ao tamanho do microgrânulo, densidade das células encapsuladas e rigidez de microesferas. Este protocolo pode ser usado para o encapsulamento de uma variedade de tipos de células, desenvolvendo modelos tridimensionais (3D) in vitro mais relevantes para estudar patologias diferentes. Nós relatado recentemente em como as pilhas alginato-encapsuladas podem ser usadas para modelar estágios adiantados da progressão20do cancro.
O conceito do processo do encapsulamento é baseado na extrusão de um jato laminar das pilhas suspendidas na solução do alginato através de um bocal. Uma cabeça vibratória interrompe o jato com uma frequência controlada, resultando em gotículas baseadas em alginato de tamanho igual. Um campo elétrico externo permite a separação das gotas formadas com base em alginato, que, ao entrar em contato com uma solução enriquecida em íons divalentes, como íons cálcio, pode rapidamente cruzar a ligação, preservando sua forma esférica. A incubação na solução de gelação permite a formação de microesferas esféricas contendo células dentro de um hidrogel físico homogêneo27. O tamanho do alvo de microesferas e de hidrogéis do alginato permite a troca nutriente do<s>s</s> e do oxigênio com meios da cultura da pilha por longos períodos de tempo (semanas). Figura 1 A mostrar uma representação esquemática do aparelho de encapsulamento utilizado (Figura 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig1.jpg"> Figura 1 : O sistema de encapsulamento. (A) representação esquemática do sistema de encapsulamento. Uma suspensão de célula alginato é carregada em uma seringa (2) e alimentada através de um reservatório em uma velocidade de extrusão definida na bomba da seringa (1). No reservatório, um chapéu de vibração (3) vibra em uma frequência definida por um gerador de forma de onda (4) para interromper o fluxo em intervalos iguais, formando gotículas de tamanho igual. Como a solução é alimentada através de um bocal (5) e as gotas são formadas, um potencial eletrostático é aplicado através de um eletrodo (7) definido por um gerador de tensão (6), que carrega levemente a superfície das gotas, permitindo que o fluxo se espalhe como resultado de repelir forças eletrostáticas. Como as gotas se envolvem com o banho de gelação (8), CA2 +-cross-linking conduzido de alginato resulta na formação de microesferas esféricas. (B) fotografia do encapsulator antes da fabricação de microgrânulos do alginato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O tamanho do microbead pode ser alterado dependendo do uso pretendido. A fim controlar o tamanho do microbead, os vários parâmetros esboçados em Figura 1a e no protocolo são ajustados conformemente. O diâmetro interno do bocal usado tem um impacto substancial no tamanho das gotas; mais parâmetros de encapsulamento de ajuste, ou seja, velocidade de extrusão, freqüência de vibração e tensão, é fundamental para alcançar uma distribuição de tamanho consistente. Tabela 1 esboça como os parâmetros diferentes podem alterar o tamanho dos microesferas conseguidos com este sistema.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Parâmetro</td>
			<td>Tamanho do bocal</td>
			<td>Freqüência da vibração</td>
			<td>Vazão</td>
			<td>Tensão do elétrodo</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tamanho do grânulo</td>
			<td>
<img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg">
</td>
			<td><img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59597/59597img02.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Parâmetros da fabricação e sua influência no tamanho do microbead. A tabela ilustra como cada parâmetro pode influenciar o tamanho resultante de microbeads fabricados, independentemente do bico e da viscosidade da solução utilizada.

<table><tbody><tr><td>&micro; Software de gerenciamento</td><td>Vale Lab, UCSF, EUA</td><td>v.1.46</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um filtro PES</td><td>Merck, Reino Unido</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>15mm Netwell inserir filtro de malha de 74 um</td><td>Constar, eua</td><td>#3477</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio de ácido algínico de algas marrons</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter96&nbsp; Ensaio de proliferação celular AQueous One Solution</td><td>Promega, EUA</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>Encapsulador</td><td>Inotech</td><td>IE-50</td><td>nº de série 05.002.01-2005</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, uk</td><td>H4024</td><td></td></tr><tr><td>Hu A&beta; 1-42 ELISA</td><td>ThermoFisher, UK</td><td>KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>ImageJ</td><td>v1.49p</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz invertida</td><td>Microscópio Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems, Reino Unido</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS Camera</td><td>Ander, Reino Unido</td><td>5.5</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>433209</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de trispídio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>W302600-K</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA solução</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de microgrânulos de alginato de secreção de amiloide-β para uso na modelagem da doença de alzheimer

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

De acordo com a hipótese da cascata do amilóide, o disparador o mais adiantado no desenvolvimento da doença de Alzheimer (AD) é a acumulação de fragmentos tóxicos do amilóide-β (aβ), conduzindo eventualmente às características clássicas da doença: chapas do amilóide, emaranhados neurofibrilary e perda sináptica e neuronal. A falta de modelos pré-clínicos não transgênicos relevantes refletivos da progressão da doença é um dos principais fatores que dificultam a descoberta de tratamentos medicamentoso efetivos. Para este fim, nós desenvolvemos um protocolo para a fabricação de microesferas do alginato que contem pilhas amyloid-secreting úteis para o estudo dos efeitos da produção crônica de aβ.
Células de ovário de hamster chinês previamente transfectadas com um gene APP humano, secretando aβ (i.e., células 7PA2), foram utilizadas neste estudo. Um modelo in vitro tridimensional (3D) para a liberação sustentada de aβ foi fabricado por encapsulamento de células 7PA2 em alginato. O processo foi otimizado para atingir um diâmetro de grânulo de 500-600 μm para estudos in vivo mais adicionais. A otimização do encapsulamento de células 7PA2 em alginato foi realizada alterando parâmetros de fabricação, por exemplo, concentração de alginato, vazão de gel, potencial eletrostático, frequência de vibração da cabeça, solução de gelivamento. Os níveis de aβ secretado foram analisados ao longo do tempo e comparados entre os grânulos de alginato e os métodos de cultura celular padrão (até 96 h).
Uma concentração de 1,5 x 106 7pa2 Cells/ml e uma concentração do alginato de 2% (w/v) tamponado com HEPES e a gelação subseqüente no cloreto de cálcio de 0,5 M por 5 minutos foram encontrados para fabricar os microbeads os mais estáveis. Os microgrânulos fabricados foram 1) de tamanho uniforme, 2) com um diâmetro médio de 550 μm, 3) contendo cerca de 100-150 células por microgrânulo e 4) capazes de secretar aβ.
Em conclusão, nosso método otimizado para a produção de microesferas estáveis de alginato contendo células 7PA2 produtoras de amiloides pode possibilitar a modelagem de aspectos importantes da AD, tanto in vitro como in vivo.

as células 7PA2 são encapsuladas com sucesso em microesferas de alginato Após a preparação, os microgrânulos uniformes e esféricos do alginato são gerados com sucesso usando este protocolo. As imagens na Figura 2a abaixo mostram um exemplo de como alterar um dos parâmetros (ou seja, tensão) altera o fluxo e a dispersão do fluxo de gotas de alginato. Figura 2 B mostra um exemplo de grânulos de alginato obtidos imediatamente após o processo de gelação.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig2.jpg"> Figura 2 : Otimização do método de fabricação. (A) fotografias que mostrem alterações na dispersão do fluxo. (B) imagem de campo brilhante mostrando microesferas esféricas de alginato imediatamente após a fabricação. (C) exemplo de etapa de otimização: ajustando os parâmetros de fabricação selecionados para atingir o tamanho do microgrânulo alvo. Gráficos selecionados para ilustrar a relação entre cada parâmetro e o tamanho dos microgrânulos resultantes (distribuição de tamanho de pelo menos n = 100 microesferas). Note que o diâmetro interno do bocal, a viscosidade da solução ejetada e as condições de gelificação também podem influenciar o tamanho dos grânulos fabricados. Barras de erro representam S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O protocolo descrito é flexível e permite a fabricação de diferentes tamanhos de microesferas à base de alginato, variando na composição de acordo com a aplicação. Na Figura 2C, nós relatamos a influência da taxa de fluxo, da tensão e da freqüência do alginato no tamanho do microbead usando uma solução do alginato de 2% (w/v) em HEPES (pH 7,2) expulsado através de um bocal de 300 μm.
Como o escopo deste estudo foi produzir microesferas que podem ser encaixadas dentro do cérebro do rato, ajustamos os parâmetros de fabricação para obter um diâmetro médio do microgrânulo na faixa de 500-600 μm. Para fins de controle de qualidade, o método foi otimizado para ter uma variabilidade mínima em toda a população de grânulos fabricados (ou seja, distribuição de tamanho estreito). Por favor, note que (1) os grânulos produzidos podem ser injetados no cérebro de rato usando uma seringa de Hamilton equipada com uma agulha 20G; e (2) um hemisfério do cérebro do rato pode hospedar até dois ou três grânulos deste tamanho.
Após a otimização, encapsulando células 7PA2 em uma concentração de 1,5 x 106 células/ml suspenso em uma solução de alginato de 2% (w/v) tamponada com HEPES e caiu em um banho de geladura de cloreto de cálcio de 0,5 M rendeu os microgrânulos desejados. Figura 3 A abaixo mostra encapsulado células 7PA2 uniformemente distribuídas em microesferas após um dia em condições de cultura de células padrão. a proliferação da pilha 7PA2 foi testada usando um ensaio de MTS como por o protocolo do fabricante. Não houve diferença significativa entre o comportamento das células 7PA2 cultivadas com ou sem alginato ao longo de um período de sete dias (Figura 3B). Quando incubando células encapsuladas em condições de cultura padrão, as células devem continuar a proliferar durante a duração do experimento, e pequenos graus de escape de células podem ser esperados como resultado, conforme relatado em outros trabalhos28. Os efeitos deste podem ser atenuados encapsulando em uma densidade menor da pilha ou reduzindo a concentração do soro em que os microesferas são incubados.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig3.jpg"> Figura 3 : Células 7PA2 encapsuladas. (A) imagem de campo brilhante de células 7PA2 encapsuladas mostrando até mesmo a distribuição celular em todo o microgrânulo de alginato. Os parâmetros da fabricação foram ajustados para obter ~ 150 7PA2 pilhas por o grânulo. Nenhuma variação significativa nos grânulos do alginato foi observada sobre 7 dias da cultura. (B) não houve diferença observada entre a proliferação global de células 7PA2 incubadas com alginato versus células incubadas sem alginato. as células 7PA2 crescem e migram através do volume dos grânulos de alginato; a redução da concentração do soro pode ser considerada retardar o crescimento da pilha. Barras de erro representam S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Alginato microesferas encapsulando 7pa2 células são estáveis ao longo do tempo Para investigar o tamanho e a forma dos microgrânulos obtidos do alginato, a análise do microscópio foi executada após a fabricação e a gelação. O diâmetro médio dos microgrânulos obtidos com o protocolo selecionado é de 550 ± 2 μm.
Teoricamente, o número de células esperadas em um microgrânulo de diâmetro de 550 μm pode ser calculado da seguinte forma:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597eq1.jpg">
onde V = volume e r = RADIUS. O volume de um único microbead é V = 8,8 x 10-5 ml; Conseqüentemente, o número de pilhas por o microbead na altura do encapsulamento = (1,5 × 106) x (8,8 x 10-5) ≈ 130 pilhas.
Experimentalmente, contamos o número de células encapsuladas imediatamente após a fabricação. Os grânulos do alginato foram interrompidos delicadamente usando a mistura da dissolução e as pilhas foram manchadas com solução azul do Tripan. A estimativa de viabilidade e a contagem de células foram realizadas por meio de um hemociômetro; os resultados obtidos mostraram uma média de 116 ± 17 células ao vivo por microgrânulo (n = 5, dados não relatados). Como esperado, observou-se menor diferença entre contagem de células teóricas e experimentais imediatamente após a encapsulação. Para algumas aplicações, e em particular para determinar a quantidade de aβ liberado ao longo do tempo, é importante prever o número de células encapsuladas em cada talão de alginato.
Curiosamente, o processo de encapsulamento não tem um impacto significativo na viabilidade celular. Os resultados são relatados em um trabalho prévio, no qual as células cancerosas Colorretais (i.e., HCT-116) foram encapsuladas por meio de um método semelhante, sem diferenças na viabilidade celular em microgrânulos de alginato comparados aos controles 2D20.
Para mensurar a estabilidade do alginato utilizado no processo de encapsulamento, foram mensurados os diâmetros de microesferas ao longo de um período de 14 dias (n = 100). Não houve alterações observadas no diâmetro médio 14 dias após a encapsulação em comparação com imediatamente após o encapsulamento (dados não relatados).
Células de 7PA2 encapsuladas liberam aβ ao longo do tempo Os meios condicionados analisados a partir de culturas 2D e 3D de células 7PA2 revelam um aumento constante nos níveis de aβ1-42 . O meio de cultura celular foi amostrado a cada 24 h, e até quatro dias, e analisado com ELISA. Nossos dados mostram que a taxa de liberação de aβ1-42 de microesferas (3D) é semelhante em perfil ao liberado da cultura 2D (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig4.jpg"> Figura 4 : Taxa de aβ1-42 secreção de células 7pa2. (A) a liberação de aβ (% normalizada após 4 dias) dos modelos 2D e 3D in vitro tem um perfil similar. Ambos os modelos mostram um aumento constante nos níveis de aβ durante o período de quatro dias e, como esperado, uma concentração constante não é alcançada. (B) concentração de aβ1-42 normalizado ao número de células iniciais, mostrando secreção semelhante de aβ1-42 ao longo do tempo, independentemente dos métodos de cultivo. Nem a presença de alginato nem o processo de encapsulamento (modelo in vitro 3D) alteram a secreção de aβ1-42. Barras de erro representam S.D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig4large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Aplicação potencial de células 7PA2 encapsuladas Nós relatamos que as pilhas 7pa2 encapsuladas em microesferas do alginato podem eficazmente ser usadas para a liberação sustentada de aβ1-42, e daqui usado para testar o efeito da secreção crônica de aβ em todo o modelo pré-clínico. Na Figura 5 abaixo, mostramos as vantagens do uso de microesferas de alginato que podem ser facilmente injetadas e localizadas dentro do cérebro de um rato. As seções ex vivo são aqui usadas para finalidades da ilustração, comparando um grânulo do alginato do milímetro contra microbeads fabricados do alginato.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig5.jpg"> Figura 5 : Utilização de microesferas para aplicações pré-clínicas relevantes. Microbeads para o Engraftment no cérebro do rato deve ser pequeno bastante ser incorporado sem criar uma lesão demasiado grande para evitar dano ao parênquima do cérebro e para afetar adversamente a função normal do cérebro. A imagem (a) mostra uma comparação do tamanho entre um grânulo milímetro-escalado e um grânulo micrometer-escalados lado a lado. (B) implantar um talão milímetro-escalado dentro do cérebro para fins in vivo não iria funcionar. A imagem (C) mostra um microbead fabricado usando este protocolo. O tamanho é apropriado para a inserção dentro do hipocampo do rato sem ter um efeito prejudicial na fisiologia normal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As imagens acima destacam a importância de controlar o tamanho do microgrânulo para tais estudos. Aqui, demonstramos a vantagem de usar microesferas de diâmetros abaixo de 600 μm. Isso permite o uso de injeção minimamente invasiva (por exemplo, a seringa de Hamilton) para melhor controlar a localização de grânulos injetados dentro do cérebro.
Em resumo, encapsulado células 7PA2 dá controle sobre o tamanho de microesferas, número de células encapsuladas e a predição de aβ secretado dos microgrânulos (por exemplo, concentração, perfil de liberação). Controlar o tamanho dos microesferas é essencial por duas razões: 1) para permitir o controle fino-ajustado sobre a concentração de aβ liberado, e 2) para permitir a implantação em uma região controlada do cérebro do rato. Os resultados obtidos aqui descrevem o ajuste facile de microesferas do alginato e destacam aplicações potenciais para uns estudos mais adicionais.

Este protocolo ilustra um método de encapsulamento da pilha pela gelação física rápida do alginato para imobilizar pilhas. Os microgrânulos obtidos permitem a secreção controlada e sustentada de amiloide-β ao longo do tempo e podem ser usados para estudar os efeitos do amilóide-β secretado em modelos in vitro e in vivo.

Fabricação de microgrânulos de alginato de secreção de amiloide-β para uso na modelagem da doença de Alzheimer

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Este protocolo explica a fabricação de microesferas, que serão usadas para ajudar a controlar a taxa de liberação e a quantidade de amiloide que é uma proteína de interesse. As microesferas imobilizarão as células em um biomamaterial adequado e as abrigarão de seu ambiente circundante, além de permitir que elas troquem subprodutos e nutrientes com seu ambiente circundante. Encapsular células usando essa técnica garante um controle rigoroso do tamanho das microesferas, bem como do número de células, e fazemos isso ajustando vários parâmetros de fabricação.Assim, encapsular as células descritas neste protocolo nos dará mais de uma liberação crônica de amiloide para usar em sistemas in vitro e in vivo, e a ideia seria que isso nos daria uma melhor compreensão dos mecanismos da doença e também nos permitiria testar novos tratamentos. Este método pode ser usado para formular sistema controlado e estudar a liberação de quaisquer biomoléculas para muitos tipos de células, seja sozinha ou em combinação. Para começar, remova um frasco quase confluente da incubadora.Trate as células com solução 0,25% trypsin-EDTA e incubar a 37 C por cinco a 10 minutos para desprender as células. Depois de adicionar o meio DMEM/F12, colete as células em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar as células a 1000 RPM por cinco minutos.Remova o supernatante e suspenda novamente a pelota no soro fisiológico tamponado hepes para dobrar a concentração celular final desejada. Em um tubo de centrífuga de 50 mililitros, misture esta suspensão celular em uma relação de um para um com solução de alginato de peso e volume de 4% para obter uma suspensão final contendo a concentração celular desejada em uma solução de alginato de peso e volume de 2%. Para definir os parâmetros de encapsulamento, defina a velocidade da máquina do encapsulador à velocidade máxima de extrusão e, em seguida, defina a tensão e a frequência.Para fabricar as microesferas, em uma seringa de 20 mililitros, carregue cinco mililitros da suspensão de alginato celular e conecte uma seringa ao encapsulador. Para iniciar o encapsulador, ative o fluxo que empurrará a suspensão de alginato celular através do alimentador, e um fluxo de gotículas será extrudado através do bocal. Colete o primeiro mililitro no béquer de resíduos para evitar o fluxo inicial não uniforme.Em seguida, continue a executar os quatro mililitros restantes permitindo que as gotículas caiam no banho de gelação de cloreto de cálcio. Após o contato com o banho de gelação, o alginato nas gotículas cruza instantaneamente com os íons de cálcio no banho de gelação, formando microesferas. Após um minuto, remova o béquer de gelação da plataforma magnética e deixe que as microesferas descansem por mais quatro minutos sem agitação para completar sua gelação em temperatura ambiente.Para recuperar as microesferas, primeiro use um par de pinças estéreis para remover quaisquer detritos ou artefatos grandes alginatos. Depois de cortar a ponta de uma pipeta plástica, use-a para transferir as microesferas do banho de gelação para um filtro de malha de 74 micrômetros mantido sobre um béquer de resíduo. Para garantir o sucesso, sempre cortamos a ponta de uma pipeta de plástico para evitar danificar as microesferas e fazemos isso toda vez que transferimos contas de um vaso para outro após o encapsulamento.Inverta o filtro de malha sobre um tubo de centrífuga. Pipeta o meio de cultura apropriado sobre ele para lavar as contas pelo tubo e permitir que elas se equilibrem nesse meio por cinco minutos. Em seguida, transfira-os para um frasco previamente preenchido com o meio apropriado para incubação e outros experimentos.Para avaliar a viabilidade celular após o encapsulamento e cultura, adicione a mistura de dissolução para interromper suavemente as microesferas e liberar as células encapsuladas. Incubar as células em uma incubadora de cultura celular suplementada com 5% de dióxido de carbono a 37 C por 10 minutos com agitação suave. Estimar a viabilidade celular dessas células colorindo-as com azul tripano e usando uma câmara hemócica.Para avaliar a estabilidade das microesferas, meça o diâmetro médio de uma amostra de cada população de microesferas ao longo de um curso de tempo usando um microscópio e um software de imagem. Após a preparação, microesferas uniformes e esféricas foram geradas com sucesso usando este protocolo. Após um dia em condições padrão de cultura celular, células encapsuladas 7PA2 foram distribuídas uniformemente em microesferas.Quando a proliferação de células 7PA2 foi testada por meio de um ensaio MTS, não houve diferença significativa entre o comportamento das células 7PA2 cultivadas com ou sem alginato durante um período de sete dias. As mídias condicionadas analisadas a partir de culturas 2D e 3D de células 7PA2 revelaram um aumento constante nos níveis amilóide-beta 1-42 em ambas as culturas. A taxa de liberação de amilóide-beta 1-42 de microesferas, ou cultura 3D, é semelhante no perfil ao liberado da cultura 2D.As células 7PA2 encapsuladas em microesferas alginatos podem ser efetivamente usadas para a liberação sustentada de amilóide-beta. Microesferas para enxerto no cérebro de rato devem ser pequenas o suficiente para serem incorporadas sem criar uma lesão grande. Implantar uma conta de escala milimétrica dentro do cérebro para fins in vivo não funcionaria, enquanto uma microesfera fabricada usando este protocolo tem um tamanho adequado para inserção dentro do hipocampo do rato.Para ter certeza de que temos uma distribuição uniforme de células no produto final, é importante misturar completamente as células na suspensão de alginato celular, e isso garante a liberação uniforme de amiloide de cada microesfera.

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JoVE Journal

Biology

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Nas seções seguintes, que definirá procedimentos para a preparação de microesferas de alginato para uso em aplicações biomédicas. Nós especificamente ilustram uma técnica para a criação de várias camadas de alginato microesferas para a dupla finalidade de célula e de encapsulamento proteína como um tratamento potencial para a diabetes tipo 1.

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Fabricação de microesferas de polímero liberador de beta-amilóide para modelagem da doença de Alzheimer

Aqui, apresentamos um protocolo para infusão cerebral estereotáxica direta de beta-amilóide. Esta metodologia fornece um modelo alternativo de camundongo in vivo para abordar os efeitos de curto prazo da beta-amilóide nos neurônios cerebrais.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Para estudar os efeitos de Aβo in vivo, desenvolvemos um modelo baseado em infusões repetidas de Aβo solúvel no hipocampo juntamente com infusão contínua de anticorpo Aβo (6E10) no hipocampo usando bombas osmóticas para neutralizar o efeito neurotóxico de Aβo.

Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas

Desenvolvemos uma metodologia para 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) de amilóide cerebral-β (Aâ) fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método pode ser generalizado para a quantificação de praticamente qualquer evento fagocítica in vivo.

3D quantitativa In Silico Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer

Este é um protocolo para imitar a doença de Alzheimer em ratos por uma avaliação de imparidade de memória espacial, alterações patológicas neuronais, fardo de proteína (Aβ) beta amyloid neuronal, e agregação neurofibrilares, induzida pela injeção de Aβ25-35 combinado com tricloreto de alumínio e recombinante humano transformando β1-fator de crescimento.

Estabelecimento de um mímico valioso de doença de Alzheimer em modelo Animal de rato por injeção Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compostos

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

Aqui, descrevemos um sistema de levedura reconstituindo a γ-secretase humana. Este sistema permite a identificação e o estudo de mutações que afetam a atividade e a triagem de inibidores da γ-secretase (GSIs). Utilizando as propriedades de perda de função dos mutantes familiares da doença de Alzheimer, é possível rastrear moduladores de γ-secretase (GSMs).

Saccharomyces cerevisiae Modelos da doença de Alzheimer para rastrear genes, mutações e produtos químicos que afetam a produção de beta-amilóide pela γ-secretase

Aprenda a fabricar microgrânulos de alginato para encapsular células 7PA2 e controlar a liberação sustentada de amiloide-β em modelos de doença de Alzheimer. Este método permite estudar mecanismos neurodegenerativos in vitro e in vivo.

Fabricação de microgrânulos de alginato de secreção de amiloide-β para uso na modelagem da doença de Alzheimer

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