Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)
20 de junho de 2019
Este protocolo descreve a combinação de cromatografia de exclusão de tamanho com espalhamento de luz multiangulares (SEC-MALS) para caracterização absoluta de proteínas e complexos em solução. SEC-MALS determina o peso molecular e o tamanho de proteínas puras, oligomers nativos, heterocomplexos e proteínas modificadas como glicoproteínas.
SEC-MALS é um método quantitativo para determinar o peso molecular, tamanho e conformação de macromoléculas na solução. Pode identificar oligômeros e complexos, e caracterizar amostras difíceis, como glicoproteínas e proteínas de membrana. SEC-MALS é um método absoluto.
Ela se baseia na física fundamental, e não depende da colaboração contra padrões moleculares, da conformação da molécula ou de como interagimos com o meio de separação. O SEC-MALS pode ser aplicado a muitos sistemas separados por sec. De peptídeos e pequenos polímeros a proteínas, nucleocapsídeos, polissacarídeos, polímeros sintéticos, partículas semelhantes a vírus e pequenos vírus.
É importante verificar se seu sistema e buffers perdem as recomendações do fornecedor para baixo conteúdo de partículas. Consulte o representante de suporte técnico do fornecedor para ter certeza. Inicie este procedimento com a elaboração do sistema SEC-MALS, conforme descrito no protocolo de texto.
Utilizando cada reagente de grau PLC, prepare um litro de soro fisiológico tamponado com cloreto de sódio de 50 a 100 mililitros. Filtre o buffer para 0,1 míclico usando um filtro de espuma de célula poliether engarrafado ou similar. Filtre os primeiros 50 a 100 mililitros de tampão em uma garrafa de resíduos, a fim de eliminar as partículas dos filtros secos.
Em seguida, filtre o restante para uma garrafa limpa e estéril que tenha sido previamente lavada com água filtrada e desionizada e mantida para evitar a entrada de poeira. Lave a coluna durante a noite a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto para equilibrar a coluna no buffer e remover partículas. Use o modo de fluxo contínuo do FPLC e certifique-se de que o fluxo não pare até que todas as corridas SEC-MALS estejam concluídas.
Coloque a célula de fluxo DRI no modo de purga durante a descarga durante a noite. Ao iniciar a descarga, aumente gradualmente a vazão para evitar que a coluna desabafe, causada por uma mudança brusca de pressão na coluna. Desligue o expurgo antes de iniciar a amostra.
Verifique a limpeza do sistema tocando levemente o tubo rio abaixo da coluna para liberar partículas acumuladas. Observe o sinal no detector de 90 graus no visor do painel frontal do instrumento MALS. Verifique se o ruído de pico ao pico não é mais do que 50-100 microvolts.
Verifique também se o índice de refração, ou sinal RI, está estável para menos de 1 vezes dez para as sete unidades de índice refrativo menos. Realize uma injeção em branco para verificar se o injetor está limpo de partículas. Um branco é simplesmente o tampão de corrida preparado em um frasco fresco e estéril.
Se o pico de partículas não for superior a um mililitro em volume, e não mais do que cinco milivolts acima da linha de base, então o sistema está pronto para amostras. Caso contrário, realize injeções adicionais em branco até limpar ou realize a manutenção para limpar o injetor. Agora, prepare pelo menos 200 microliters de BSA a um a dois miligramas por mililitro no buffer SCC.
Filtre a proteína em 02 mícrons, usando um filtro de ponta de seringa. Descarte as primeiras gotas de filtrado, a fim de eliminar partículas dos filtros secos. Alternativamente, centrifugar a amostra a 10.000 vezes G durante quinze minutos para permitir a precipitação de agregados não solúveis e outras partículas grandes.
Em seguida, injete 100 microliters da solução BSA no loop. Abra novo experimento do método no menu de software MALS. Em seguida, selecione o método on-line na pasta de métodos do sistema de dispersão de luz.
Se um detector DLS estiver presente, selecione o método on-line da dispersão de luz com a pasta QELS. Defina parâmetros da amostra e da fase móvel na seção de configuração. Na visão genérica da bomba, defina a taxa de fluxo para a usada no FPLC.
Em seguida, navegue até a visualização genérica da bomba, ramo solvente, campo de nome e selecione PBS. Na visão do injetor, ramo amostral, digite o nome como BSA. Defina dn/dc para 0,185, defina A2 para 0 e defina o Coeficiente de Extinção UV para 0,667 mililitros por centímetro miligrama.
Na seção procedimentos, visualização básica da coleta, selecione o gatilho da caixa de seleção na injeção automática. Defina a duração da execução para 70 minutos, para que os dados sejam coletados durante toda a alusão, até que o volume total de permeação da coluna SEC seja atingido. Inicie o experimento no software MALS clicando no botão executar.
Ele começará a ler os dados após receber o sinal de pulso do instrumento FPLC através do detector MALS. Zero o sinal DRI clicando no botão auto-zero no painel frontal do instrumento. Trabalhando no software FPLC, navegue até manualmente, execute instruções manuais, marque e insira o nome da proteína e a execução.
Troque a válvula de injeção da carga manual para injetar, sob o caminho de fluxo, válvula de injeção. Inclua um sinal de pulso inserindo um pulso de 0,5 segundo sob o pulso digital da caixa IO. Isso desencadeará a coleta de dados no software MALS.
Agora, injete a amostra no loop. Clique em executar no software FPLC para iniciar a execução do experimento. Realize a análise passo a passo, sob a seção de procedimentos no software MALS.
Verifique se os picos aparecem aproximadamente no mesmo volume de alusão em UV, MALS e RI verificando a visualização básica da coleção. Na visão da linha de base, defina a linha de base para todos os sinais. Na visualização dos picos, defina os picos a serem analisados clicando e arrastando o mouse.
Selecione os 50% centrais de cada pico. Primeiro selecione o pico do monômero, e depois o pico mais escuro. Sob cada pico, verifique os valores corretos do dn/dc e do coeficiente de extinção em 280 nanômetros para BSA.
Nos procedimentos, veja a região central dos picos clicando e arrastando o mouse. Clique em alinhar sinais e, em seguida, ok. Nos procedimentos, a ampliação da faixa, escolha os 50% centrais do pico do monômero.
Certifique-se de que o detector de índices de refração está especificado como o instrumento de referência. Em seguida, clique em executar ajuste e aplicar para combinar os sinais de dispersão UV e luz ao sinal de índice de refração. Amplie os picos para verificar se eles se sobrepõem muito de perto dentro da central de 50 a 70% e, em seguida, clique bem.
Nos procedimentos, visualização de normalização, selecione o pico um. Digite 3.0 nanômetros como o valor do RG, clique em normalizar e clique em ok. Veja o gráfico dos resultados na exibição do gráfico EASI.
Selecione massa molar do display na parte superior da janela. Use controle, clique e arraste para ampliar a região de pico. Para ver os resultados finais de massa molar médio de peso tabulado para os picos mais monômeros e mais escuros, navegue até os picos de pico, momentos de massa molar, MW e selecione os resultados, resumo do relatório.
A pureza é relatada sob os resultados de pico, fração de massa. No menu de arquivos, selecione salvar como método e salve os dados BSA analisados como um método padrão para medições futuras de todos os tipos de proteínas. Os parâmetros de normalização e ampliação da banda determinados para a BSA serão realizados na análise.
Aqui são mostradas análises SEC-MALS da BSA, usando uma coluna de exclusão de tamanho de poros Angstrom de 200. Os traços de cromatograma são normalizados até o pico do monômero, e compensados para clareza. Artefatos comuns que podem ser ignorados são apontados, incluindo um pico de partículas perto do início do sinal de dispersão de luz, bem como picos de ar salgado e dissolvido perto do volume total de permeação no sinal de índice de refração.
O cromatógrama exibe excelente separação monômero-mais fino, e o sinal de dispersão de luz exibe alto sinal de ruído. Os valores médios de massa molar de peso mais fino e mais fraco apresentam alta homogeneidade. Aqui estão exemplos de análises SEC-MALS de baixa qualidade.
Neste exemplo, a separação inadequada em uma coluna de exclusão de tamanho de poros de 75 Angstrom resulta em um pico de partículas entre oito a nove minutos, que não é bem separado das proteínas. Aqui, há uma relação sinal-ruído inadequado, e partículas extensas adjacentes às proteínas são aparentes no sinal de dispersão de luz. As chaves para bons resultados DO SEC-MALS estão selecionando uma coluna apropriada, garantindo que o sistema seja calibrado com ruído de dispersão de pouca luz e pré-filtrando ou centrifugando as amostras para remover partículas.
Seguindo a SEC-MALS, as amostras de proteínas podem ser analisadas para afinidade de ligação, bioliza, ressonância plasmon superficial, calorimetria de titulação isoterina, phorometria bioleride, termoforese de microescala ou gradiente de composição, dispersão de luz multi-ângulo. A estrutura proteica pode ser determinada por cristalografia de raios-X, miscroscopia crio-elétron, ou RN.
Visão Geral
Este protocolo descreve a combinação da cromatografia de exclusão por tamanho com espalhamento de luz em múltiplos ângulos (SEC-MALS) para a caracterização absoluta de proteínas e complexos em solução. A SEC-MALS determina o peso molecular e o tamanho de proteínas puras, oligômeros nativos, heterocomplexos e proteínas modificadas, como glicoproteínas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Bioquímica
- Caracterização de proteínas
- Química analítica
Antecedentes
- A SEC-MALS é um método quantitativo para determinar peso molecular e tamanho.
- Pode identificar oligômeros e complexos, incluindo glicoproteínas.
- Este método não depende de padrões moleculares.
- Aplicável a uma ampla variedade de macromoléculas.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para caracterizar proteínas em solução.
- Facilitar a análise de amostras biológicas complexas.
- Aprimorar a compreensão das interações e estruturas proteicas.
Métodos Utilizados
- Preparação do sistema SEC-MALS e dos tampões.
- Filtração e lavagem do sistema para garantir limpeza.
- Preparação da amostra e injeção no sistema SEC-MALS.
- Coleta e análise de dados utilizando o software MALS.
Resultados Principais
- Caracterização bem-sucedida de proteínas e complexos.
- Verificação da limpeza do sistema e da integridade da amostra.
- Determinação precisa dos pesos e tamanhos moleculares.
- Identificação de oligômeros e complexos nas amostras.
Conclusões
- A SEC-MALS é um método eficaz para caracterização de proteínas.
- Fornece medições absolutas sem depender de padrões.
- Essa técnica pode ser aplicada a uma variedade de macromoléculas biológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A SEC-MALS fornece caracterização absoluta do peso molecular e do tamanho de proteínas e complexos em solução, eliminando a dependência de padrões moleculares e reduzindo a incerteza analítica na fase inicial de descoberta. Essa capacidade apoia a validação de alvos ao confirmar o estado biofísico de candidatos terapêuticos, incluindo oligômeros, agregados e espécies modificadas, como glicoproteínas. Ao fornecer dados quantitativos e independentes de conformação, a SEC-MALS aumenta a confiança preditiva no comportamento das proteínas, orientando decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento e reduzindo riscos biológicos em estágios avançados nas etapas de P&D de biofármacos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Confirma a homogeneidade e o peso molecular de monômeros, oligômeros e complexos proteicos, permitindo a avaliação precisa da integridade do alvo terapêutico.
- Valor Operacional: Distingue entre equilíbrios proteicos estáticos e dinâmicos, esclarecendo se as espécies observadas representam montagens estáveis ou interações transitórias.
- Valor Preditivo: Detecta agregados e populações heterogêneas precocemente, apoiando a priorização ajustada ao risco de candidatos antes do investimento em etapas posteriores.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Permite a análise de proteínas modificadas, como glicoproteínas e proteínas de membrana solubilizadas com detergentes, ampliando o leque de alvos viáveis para campanhas de triagem.
- Valor Operacional: Fornece medidas quantitativas e absolutas de massa molecular em cada volume de eluição, facilitando a padronização dos ensaios e a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Utilidade da Plataforma: Gera dados de referência para BSA e outros padrões que podem ser salvos como métodos para execuções futuras de SEC-MALS, promovendo reutilização e consistência em toda a instituição.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite a caracterização de complexos proteicos e formas modificadas relevantes para mecanismos de doenças, conectando descoberta e validação pré-clínica.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Determina se as espécies observadas resultam de modificação covalente, agregação inespecífica ou oligomerização específica, esclarecendo o mecanismo de ação e riscos de formulação.
- Alinhamento Pré-clínico: Fornece dados de tamanho e conformação em solução que complementam técnicas estruturais como criomicroscopia eletrônica ou RMN, permitindo um perfilhamento integrado do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A SEC-MALS atua como uma etapa analítica fundamental no processo de descoberta, posicionada após a expressão e purificação da proteína, mas antes dos ensaios funcionais ou da determinação estrutural, garantindo que apenas moléculas adequadamente caracterizadas prossigam na sequência.
- Biologia da Descoberta: Valida o estado oligomérico e a monodispersidade de proteínas purificadas, reduzindo falsos positivos em ensaios de ligação ao alvo e de sinalização.
- Triagem: Assegura que ligantes proteicos ou analitos utilizados em ensaios de triagem sejam bem definidos e homogêneos, melhorando a qualidade dos dados e as taxas de confirmação de hits.
- Análises: Fornece massas molares médias ponderais, tamanhos e frações de massa que permitem a comparação direta de variantes proteicas, mutantes ou condições de formulação.
- Pesquisa Translacional: Caracteriza glicoproteínas e complexos de proteínas de membrana em condições próximas às nativas, apoiando estudos de relevância de biomarcadores e de mecanismo de ação.
- Reutilização Empresarial: Permite que laboratórios salvem métodos validados (por exemplo, baseados em BSA) para aplicação ampla em diversos projetos, reduzindo o tempo de desenvolvimento de métodos e aumentando a produtividade analítica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece a determinação absoluta e independente de conformação do peso molecular, aumentando a confiança na identidade do alvo e reduzindo ambiguidades mecanísticas.
- Valor Operacional: Permite verificações de adequação do sistema por meio de injecções em branco e monitoramento de partículas, garantindo corridas reprodutíveis e minimizando experimentos falhos devido à contaminação.
- Valor Estratégico: Apoia a detecção precoce de agregação e heterogeneidade, orientando o desenvolvimento de formulações e reduzindo o risco de falhas em estágios avançados devido à instabilidade.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões baseadas em dados sobre avançar ou não com um candidato, com base na qualidade biofísica, melhorando a eficiência do capital e promovendo apenas candidatos bem caracterizados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em purificação de proteínas, preparação de tampão e operação de sistema SEC-MALS, incluindo procedimentos de alinhamento e normalização do detector MALS.
- Depende do acesso a um sistema SEC-MALS calibrado, com detectores de espalhamento de luz e índice de refração de baixo ruído e colunas apropriadas (por exemplo, tamanho de poro de 200 Å para BSA).
- Necessita filtração rigorosa de amostras e tampões (0,1–0,2 μm) e lavagem do sistema para eliminar partículas que possam espalhar a luz e comprometer a qualidade dos dados.
- Exige a inserção precisa de parâmetros específicos da proteína, como dn/dc e coeficiente de extinção na faixa de UV, no software MALS para cálculos válidos de massa molecular.
- Limitado pela necessidade de amostras monodispersas e solúveis; precipitados ou grandes agregados devem ser removidos por centrifugação ou filtração antes da injeção, para evitar entupimento da coluna e artefatos de sinal.
