Name: Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a editar geneticamente células CAR-T usando CRISPR/Cas9 durante a fabricação celular. Este método integra produção e modificação genética para criar terapias mais eficazes e menos tóxicas contra câncer.

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Este trabalho foi apoiado através de subvenções da K12CA090628 (SSK), da rede nacional de câncer abrangente (SSK), do centro de clínica Mayo para medicina individualizada (SSK), da Fundação Predolin (SSK), do escritório da clínica Mayo de tradução para a prática (SSK), e o programa de treinamento de cientista médico da clínica Mayo Robert L. Howell bolsa de estudos médico-cientista (RMS).

Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de revisão institucional da clínica Mayo (IRB) e do Comitê de biossegurança institucional (IBC).
produção da pilha 1. CART19
<ol><li>Isolamento de células T, estimulação e cultura ex vivo<ol>
<li>Realize todo o trabalho da cultura de pilha em uma capa da cultura de pilha que utiliza o equipamento protetor pessoal apropriado. Colher células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de cones sanguíneos de doadores normais coletados durante a aférese, pois estes são conhecidos por serem uma fonte viável de PBMCs.13
</li>
		<li>Para isolar PBMCs, adicione 15 mL de um meio de gradiente de densidade a um tubo de separação de gradiente de densidade de 50 mL. Diluir o sangue do doador com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) para evitar aprisionamento celular.<ol>
<li>Adicione o sangue do doador diluído do cone no tubo de separação, cuidado para não perturbar a interface entre o sangue e o meio de gradiente de densidade. Centrífuga a 1.200 x g por 10 min em RT.</li>
			<li>Decantar o sobrenadante em um novo 50 mL cônico, lave com PBS + 2% FBS trazendo até 40 mL, centrifugar a 300 x g por 8 min em RT, aspirar sobrenadante, ressuscite em 40 ml de tampão, e contagem de células.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Isole células T de PBMCs através de um kit de talão magnético de seleção negativa usando um separador de células totalmente automatizado de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Para a cultura das células T isoladas, prepare o meio de célula T (TCM) que consiste em 10% de soro de AB humano (v/v), 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (v/v) e meio de células hematopoiéticas sem soro. Esterilize o meio filtrando através de um filtro de vácuo estéril de 0,45 μm e então com um filtro de vácuo estéril de 0,22 μm.</li>
		<li>No dia 0 (o dia da estimulação da célula T), lave os grânulos CD3/CD28 antes da estimulação de pilhas de T. Para lavar, coloc o volume exigido dos grânulos (use bastantes grânulos de CD3/CD28 para uma relação de 3:1 grânulos: pilhas de T; Note que a concentração de grânulos pode ser variável) em um tubo estéril do microcentrifugador de 1,5 mL e em um Ressuspender em 1 mL de TCM.</li>
		<li>Coloque em contato com um ímã.</li>
		<li>Após 1 min, aspirar o TCM e ressuscitem em 1 mL de TCM fresco para lavar as contas.</li>
		<li>Repita este procedimento para um total de três laves.</li>
		<li>Após a terceira lavagem, Ressuspender os grânulos em 1 mL de TCM.</li>
		<li>Conte as células T.</li>
		<li>Transfira grânulos às pilhas de T em uma relação de 3:1 grânulos: pilhas.</li>
		<li>Diluir as células para uma concentração final de 1 x 106 células/ml.</li>
		<li>Incubar a 37 ° c, 5% CO2 por 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfecção de células T<ol>
<li>Realize o trabalho lentivirais usando as precauções BSL-2 +, incluindo capas de cultura celular, equipamentos de proteção individual e desinfecção de materiais usados com lixívia antes da eliminação.</li>
		<li>Adquira uma construção CART19 em um vetor lentivirais. Nota: a construção CART19 utilizada aqui foi projetada e sintetizada de novo usando um fornecedor de síntese de proteínas comercialmente disponível. O constructo CAR foi posteriormente clonado em um Lentivirus de terceira geração controle de um promotor EF-1 α. O fragmento de região de variável de cadeia única é derivado do clone FMC63 e reconhece a CD19 humana. O constructo CAR19 possui um domínio costimulatório de segunda geração 4-1BB e estimulação CD3ζ (FMC63-41BBz). 12 anos de
</li>
		<li>Executar a produção de Lentivirus como descrito anteriormente. 12 anos de<ol>
<li>Em resumo, para produzir Lentivirus, utilizar 293T células que atingiram 70-90% confluência.</li>
			<li>Permitir incubação por 30 min à temperatura ambiente de reagentes de transfecção, incluindo 15 μg do plasmídeo lentivirais de juros, 18 μg de um vetor de embalagem de GAG/pol/tat/Rev, 7 μg de um vetor de envelope VSV-G, 111 μl do reagente pré-complexante, 129 μl do Reagente de transfecção e 9,0 mL do meio de transfecção antes de adicionar às células 293T. Em seguida, a cultura das células transfected em 37 ° c, 5% CO2.</li>
			<li>Colheita, centrifugador (900 x g por 10 min), filtro (filtro de nylon de 0,45 μm), e sobrenadante concentrado em 24 e 48 h por ultracentilgação em 13.028 x g para 18 h ou 112.700 x g para 2 h.</li>
			<li>Congelar em-80 ° c para uso futuro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>No dia 1, reressuscite suavemente as células T para romper as rosetas das células T que foram estimuladas a 1 x 106/ml no dia 0.</li>
		<li>apropriado BSL-2 + precauções para todo o trabalho lentivirais, adicionam o vírus colhido fresco ou congelado às pilhas de T estimuladas em um multiplicidade da infecção (moi) de 3,0.</li>
	</ol></li>
	<li>Expansão celular CAR-T<ol>
<li>Durante a fase de expansão, continue a incubar as células T transinadas a 37 ° c, 5% CO2. Conte as células CAR-T nos dias 3 e 5 e adicione TCM fresco e pré-aquecido à cultura para manter uma concentração de células CAR-T de 1 x 106/ml.</li>
		<li>Retire os grânulos das células T transmóadas 6 dias após a estimulação (dia 6) com um íman. Colheita, ressuscitar e colocar células T em 50 mL de tubos cônicos em um ímã por 1 min. Em seguida, recolher o sobrenadante (contém as células CAR-T), e descartar as contas.</li>
		<li>Coloque as células CAR-T coletadas de volta na cultura em uma concentração de 1 x 106 células/ml para retomar a expansão.</li>
		<li>No dia 6, avalie a expressão superficial do CAR por citometria de fluxo. Nota: diversos métodos podem ser usados para detectar a expressão de superfície do carro, tal como a mancha com um anticorpo secundário adsorto da IgG do anti-rato da cabra (H + L) ou manchando com um peptide específico CD19, conjugado a um fluorochrome. Tome uma alíquota (cerca de 100.000 células T) da cultura e lave com tampão de fluxo preparado com soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco, soro bovino fetal a 2% e azida sódica a 1%. Manchar as células com o anticorpo anti-CAR e lave duas vezes. Manchar as células com mancha viva/morta e anticorpo monoclonal CD3 (OKT3). Lave as células e ressuscitem no tampão de fluxo. Adquira em um citômetro para determinar a eficiência da transdução.</li>
	</ol></li>
	<li>Criopreservação de células CAR-T<ol>
<li>Para colher e cripreservar células CAR-T 8 dias após a estimulação (dia 8 de expansão da célula T), colher as células da cultura.</li>
		<li>Gire para baixo por 5 min em 300 x g.</li>
		<li>Ressuscitava em meio de congelação em 10 milhões células por mL por frasco em meio de congelação consistindo de 10% de sulfóxido de dimetil e 90% de soro bovino fetal.</li>
		<li>Congelar em um recipiente de congelamento para atingir uma taxa de resfriamento de-1 ° c/min em um-80 ° c freezer e depois transferir para nitrogênio líquido após 48 h.</li>
		<li>Antes do seu uso para experimentos in vitro ou in vivo, descongele as células CAR-T em TCM quente.</li>
		<li>Lave as células para diluir e remover o dimetil sulfóxido e ressuscitar para uma concentração de 2 x 106 células/ml em TCM quente. Descanse durante a noite a 37 ° c, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. GM-CSF k/o CART19 produção
<ol><li>Para interromper o GM-CSF, utilize um guia RNA (grna) visando exon 3 do GM-CSF humano (CSF2) selecionado através da seleção grnas relatado previamente para ter a eficiência elevada para o gene CSF2 que codifica para o GM-CSF humano do citocinas. 14 anos de Nota: utilizou-se um construto de pesquisa comercialmente sintetizado de grau Cas9 de terceira geração contendo este gRNA (sob um promotor U6). O construto contém um gene de resistência à puromicina. A sequência do gRNA é GACCTGCCTACAGACCCGCC. 12 anos de
</li>
	<li>Para produzir Lentivirus, utilize células de 293T que atingiram 70-90% de confluência.</li>
	<li>Permitir 15 μg do plasmídeo lentivirais de juros, 18 μg de um vetor de embalagem de GAG/pol/tat/Rev, 7 μg de um vetor de envelope VSV-G, 111 μl do reagente pré-complexante, 129 μl do reagente de transfecção e 9,0 ml do meio de transfecção para incubar por 30 min no quarto te rmal.</li>
	<li>Adicionar reagentes de transfecção às células 293T. Então cultura em 37 ° c, 5% CO2.</li>
	<li>Colheita, centrifugação (900 x g por 10 min), filtro (filtro de nylon de 0,45 μM) e sobrenadante concentrado a 24 e 48 h por ultracentilgação a 13.028 x g durante 18 h ou 112.700 x g durante 2 h e congelar a-80 ° c para uso futuro.</li>
	<li>No dia 1, resuspender suavemente as células T para quebrar Rosettes.</li>
	<li>Em um laboratório aprovado BSL-2 +, adicione o vírus congelado ou recentemente colhido às pilhas de T estimuladas para gerar pilhas de CAR-T. Transduce células T com Lentivirus CAR19 e GM-CSF visando Lentivirus CRISPR. Adicionar CAR19 Lentivirus em um MOI de 3. Como a titulação do Lentivirus CRISPR não foi viável, o uso de partículas de vírus geradas a partir de uma preparação de 15 UG plasmídeo para transduce 10 x 106 células T.</li>
	<li>Veja as etapas restantes da estimulação, da expansão, e da criopreservação da célula T como discutido em etapa 1.
</li>
	<li>Para células T editadas por lentiCRISPR que transportam resistência à puromicina, trate as células com dicloridrato de puromicina numa concentração de 1 μg de puromicina por 1 mL no dia 3 e no dia 5.</li>
</ol>eficiência do rompimento 3. GM-CSF e avaliação funcional do GM-CSF k/o CART19
<ol><li>Eficiência de ruptura GM-CSF: rastreamento de indels por sequenciamento e análise de decomposição (TIDE)<ol>
<li>Para sequenciar o exão de interesse no gene GM-CSF, use os seguintes primers. Use uma seqüência de primer para a frente para GM-CSF (CSF2) de TGACTACAGAGAGGCACAGA, e uma seqüência de primer reverso de TCACCTCTGACCTCATTAACC.</li>
		<li>Extraia o DNA de até 5 milhões células CAR-T com um kit de extração genômica. Para a reação do PCR, use 25 μL de um MasterMix de Taq por a reação com uma concentração final de cada primeira demão na reação do PCR do μM, 0.1-0.5 μg do ADN do molde, e um volume total da reação do PCR trazido até 50 μL com água livre do nuclease.</li>
		<li>Veja as condições de ciclagem da PCR descritas na tabela 1.</li>
		<li>Execute amostras de PCR em um gel de agarose de 1-2% a 100 V por 30 min e extraia usando um kit de extração de gel.</li>
		<li>Amplicons da PCR da seqüência. Calcule a frequência de modificação do alelo carregando dados brutos em um software TIDE apropriado. 15 anos de
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Produção de GM-CSF e avaliação funcional do GM-CSFk/o CART19<ol>
<li>Para determinar a produção de citocinas de células CAR-T, incubar células selvagens do tipo CART19 e GM-CSFk/o CART19 com o CD19 expressando linha celular de leucemia linfoblástica aguda NALM6 em uma proporção de 1:5 para 4 h a 37 ° c, 5% co2 na presença de monensina solução, CD49d, anti-Human CD28, e CD107a anti-Human.</li>
		<li>Colha células da cultura para citometria de fluxo. Lave as células com tampão de citometria de fluxo. Manchar as células com um kit de coloração vivo/morto. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 15 min. fixar as células com um meio de fixação e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.</li>
		<li>Após a lavagem, manchar as células intracelularmente com meio de permeabilização em combinação com anti-humanos IFNγ anticorpo monoclonal, anti-humano GM-CSF, anti-humano MIP-1 β, anti-humano Il-2, e anti-humano CD3 e incubar no escuro em temperatura ambiente para 30 min. Lave e ressuspender as amostras. Adquira amostras em um citômetro do fluxo e analisado para a porcentagem da expressão intracelular do GM-CSF.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
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<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
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<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
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<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK é um inventor em patentes no campo da terapia de célula T do carro que são licenciadas a Novartis (sob um acordo entre a clínica de Mayo, a Universidade de Pensilvânia, e o Novartis). Estes estudos foram financiados em parte por uma subvenção do Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS e SSK são inventores de patentes relacionadas a este trabalho. O laboratório (SSK) recebe financiamento de tolero, Humanigen, kite, Lentigen, Morphosys e actínio.

Neste relatório, nós descrevemos uma metodologia para utilizar a tecnologia de CRISPR/Cas9 para induzir modificações secundárias em pilhas de CAR-T. Especificamente, isso é demonstrado usando transdução lentivirais com um vetor viral que contém grna visando o gene de interesse e Cas9 para gerar células GM-CSFk/o CART19. Nós tínhamos mostrado previamente que a neutralização de GM-CSF melhora CRS e NT em um modelo do xenograft. 12 como descrito previamente, as pilhas do carro-t do GM-CSF<...

O receptor quimérico T do antígeno (carro-T) a terapia da pilha exibe a grande promessa no tratamento do cancro. 1. º , 2 duas terapias da pilha do carro-T que alvejaram CD19 (CART19) foram aprovadas recentemente nos Estados Unidos indicados e em Europa para o uso em malignidades da pilha de B após ter provado resultados impressionantes em ensaios clínicos multicêntrico. 3. º , 4. º , 5 as barreiras ao uso mais difundido de pilhas de Car-T são atividade limitada em tumores contínuos e em toxicidades associadas que incluem a síndrome da liberação do citocinas (CRS) e o neurotoxicidade (NT). 3. º , 5. º , 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9 para realçar o índice terapêutico da terapia da pilha de Car-t, as ferramentas da engenharia do genoma tais como nucleases do dedo do zinco, Talens, e crispr são empregadas para modificar mais pilhas de Car-t em uma tentativa de gerar umas pilhas menos tóxicas ou mais eficazes de Car-t. 10 de , 11 anos de
Neste artigo, descrevemos um método para gerar células CAR-T editadas CRISPR/Cas9. O objetivo específico deste método é modificar geneticamente as células CAR-T durante a fabricação de células Car-T via CRISPR/Cas9 para gerar células CAR-T menos tóxicas ou mais efetivas. A fundamentação para o desenvolvimento desta metodologia é construída sobre as lições aprendidas com a experiência clínica da terapia celular CAR-T, o que indica uma necessidade urgente de novas estratégias para aumentar a janela terapêutica da terapia celular CAR-T e estender a aplicação em outros tumores e é apoiado pelos recentes avanços na biologia sintética permitindo múltiplas modificações das células CAR-T que começaram a entrar na clínica. Enquanto várias ferramentas de engenharia do genoma estão sendo desenvolvidas e aplicadas em diferentes configurações, como nucleases de dedo de zinco, TALENs e CRISPR, nossa metodologia descreve a modificação de CRISPR/Cas9 de células CAR-T. 10 de , 11 crispr/Cas9 é um mecanismo de defesa bacteriano baseado em RNA que é projetado para eliminar o DNA externo. O CRISPR baseia-se em endonucleases para Cleave uma sequência alvo identificada através de um RNA guia (gRNA). A edição CRISPR das células CAR-T oferece várias vantagens sobre outras ferramentas de engenharia do genoma. Estes incluem a precisão da sequência gRNA, simplicidade para projetar um gRNA visando o gene de interesse, alta eficiência de edição de genes, e a capacidade de segmentar vários genética, uma vez que vários gRNAs podem ser usados ao mesmo tempo.
Especificamente nos métodos descritos aqui, foi utilizado um Lentivirus codificação CRISPR guia RNA e Cas9 para interromper um gene durante a transdução do carro de células T. Ao selecionar uma técnica apropriada para editar células CAR-T, sugerimos que a técnica descrita aqui seja um mecanismo eficiente para gerar células CAR-T de grau de pesquisa, mas porque o efeito a longo prazo da integração permanente de Cas9 no genoma é desconhecido, nós propor esta metodologia para desenvolver a prova de conceito de pesquisa de grau de células CAR-T, mas não para a produção de boas práticas de fabrico grau CAR-T células.
Em particular, aqui nós descrevemos a geração de granulocyte macrófago colônia fator estimulante (GM-CSF) Knockout CAR-T células visando a CD19. Essas células CAR-T foram geradas por transdução com partículas lentivirais codificando um RNA guia específico para GM-CSF (Gene Name CSF2) e Cas9. Nós encontramos previamente que a neutralização do GM-CSF melhora CRS e NT em um modelo do xenograft. 12 pilhas do GM-CSFk/o Car-t permitem a inibição do GM-CSF durante o processo de manufactura, reduzindo eficazmente a produção de GM-CSF ao realçar a atividade do anti-tumor da pilha de Car-t e a sobrevivência in vivo comparado às pilhas do tipo selvagem Car-t. 12 assim, aqui nós fornecemos uma metodologia para gerar crispr/Cas9 editado células Car-T.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo Monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Escolha Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Sistemas de Terapia Celular) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>Citômetro de fluxo</td> <td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato Dulbecco</td><td></td><td>Gibco 14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (Concentrador de Partículas Magnéticas)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de Isolamento de Células T Humanas&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>esferas magnéticas de seleção negativa; 17951RF inclui pontas e tampão</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD107a&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Fixação (Meio A)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA Construct: Nome: CSF2 RNA guia CRISPR 1; Espécies: Humano, Vetor: pLentiCRISPR v2; Resistência: Ampicilina; Número da cópia: Alto; Preparação de plasmídeo: Entrega padrão: 4 &mu; g (Gratuito de custo)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>pedido personalizado</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H+L) de cabra anti-rato, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td><td>Soro AB Humano da Desktop Genetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>; Doadores do sexo masculino; tipo AB; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN gama Monoclonal Anticorpo (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Transfecção Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas Aqua fixáveis, para excitação de 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Monensin Solution, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>Clone anti-humano CD28 do rato CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>Clone anti-humano do rato CD49d 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>MIP-1&beta do rato anti-humano; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Recipiente de Congelamento</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, clone G5&nbsp;</td>Linha <td>celular de leucemia linfoblástica aguda</td> <td>ATCC</td><td>CRL-3273</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de filtro a vácuo Olympus, 500 mL, membrana PES, 0,22 uM, estéril</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro descartáveis estéreis de fluxo rápido Nalgene com membrana CN 0,45 uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced-Serum Médio (1X), Líquido</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100X), Líquido</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Permeabilização (Meio B)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de puromicina</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td>Kit de extração de</td></tr><tr><td>gel 0210055210 QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Rato Anti-Humano GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Separador de Células Totalmente Automatizado</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio, 5% (p/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Meio de Células Hematopoiéticas Sem Soro</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

usando crispr/cas9 para knock out gm-csf em células car-t

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

A terapia de célula T (CAR-T) do receptor de antígeno quimérico é uma aresta de corte e uma nova opção de tratamento potencialmente revolucionária para câncer. No entanto, existem limitações significativas para o seu uso generalizado no tratamento do cancro. Estas limitações incluem o desenvolvimento de toxicidades originais tais como a síndrome da liberação do citocinas (CRS) e a neurotoxicidade (NT) e a expansão limitada, as funções efetoras, e a atividade antitumoral em tumores contínuos. Uma estratégia para melhorar a eficácia do CAR-T e/ou as toxicidades de controle das células CAR-t é editar o genoma das próprias células CAR-t durante a fabricação de células CAR-T. Aqui, nós descrevemos o uso da edição do gene de crispr/Cas9 em pilhas de Car-T através da transdução com uma construção lentivirais que contem um RNA do guia ao fator deestimulação da colônia do macrófago do granulocyte (GM-CSF) e Cas9. Como um exemplo, nós descrevemos o nocaute negociado CRISPR/Cas9 de GM-CSF. Nós mostramos que estas pilhas do carro-T do GM-CSFk/o produzem eficazmente menos GM-CSF ao manter a função crítica da pilha de t e resultam na atividade antitumoral aumentada in vivo comparada às pilhas selvagens do tipo Car-t.

A Figura 1 mostra a redução do GM-CSF nas células GM-CSFk/o CART19. Para verificar se o genoma das células T foi alterado para nocaute GM-CSF, o sequenciamento de TIDE foi utilizado nas células GM-CSFk/o CART19 (Figura 1a). A mancha da superfície da pilha de CAR-T verifica que as pilhas de T expressam com sucesso o receptor de superfície do carro in vitro gating em pilhas CD3 + vivos (Fi...

Aqui, apresentamos um protocolo para editar geneticamente as células CAR-T através de um sistema CRISPR/Cas9.

Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Nosso protocolo descreve a modificação genética da célula CAR-T durante sua fabricação através da tecnologia CRISPR para gerar produtos mais eficazes e menos tóxicos. Uma vantagem dessa técnica é que a produção celular CAR-T e a manipulação genética podem ocorrer tanto em uma célula com boa eficiência. Demonstrando o procedimento estarão Rosalie Sterner, uma estudante de doutorado em Doutorado, Michelle Cox, tecnóloga e estudante de pós-graduação, e Reona Sakemura, bolsista de pós-doutorado, do meu laboratório.Depois de isolar as células T das células mononucleares de sangue periféricas colhidas, comece a esculpá-las primeiro preparando o meio de células T e, em seguida, esterilizá-lo filtrando-o através de um filtro de vácuo estéril de 0,45 micrômetro e, em seguida, com um filtro de vácuo estéril de 0,22 micrômetros. No dia da estimulação de células T ou dia zero, antes da estimulação, lave as contas CD3/CD28 colocando o volume necessário de contas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e resusus em um mililitro de TCM. Coloque o tubo em contato com um ímã por um minuto.Em seguida, aspire o TCM e resuspend em um mililitro de TCM fresco para lavar as contas novamente e repetir para um total de três lavagens. E, finalmente, resuspense as contas em um mililitro de TCM. Depois de contar as células T, transfira as contas para as células T em uma proporção de três para uma contas para células.Em seguida, diluir as células para uma concentração final de um milhão de células por mililitro e incubar a 37 graus Celsius, 5% de CO2 por 24 horas. Após a aquisição de uma construção CART19 em um vetor lentiviral, realize a produção lentiviral incubando primeiro plasmídeo lentiviral, vetor de embalagem, vetor envelope, reagente pré-complexante, reagente de transfecção e meio de transfecção à temperatura ambiente por 30 minutos. Realizar trabalhos lentivirais utilizando BSL2+precauções, incluindo capuzes de cultura celular, equipamentos de proteção individual e desinfecção de materiais usados com alvejante antes do descarte.Após a incubação, adicione esses reagentes de transfecção às 293 células T que atingiram 70 a 90% de confluência e cultura das células transfeccionadas a 37 graus Celsius e 5%DE CO2. Às 24 e 48 horas após a transfecção, colheita, centrífuga, filtro e concentrado de supernante contendo vírus por ultracentrifugação e congelamento a menos 80 graus Celsius para uso futuro. No primeiro dia, resuspend suavemente células T que foram estimuladas a um milhão de células por mililitro no dia zero, a fim de quebrar as rosetas das células.Sob as precauções BSL2+apropriadas, adicione vírus coletado fresco ou congelado às células T simuladas em uma multiplicidade de infecção de 3.0. Continue a incubar as células T transduzidas a 37 graus Celsius, 5% de CO2. Nos dias três e cinco, conte células CAR-T e adicione TCM pré-aquecido fresco à cultura para manter uma concentração celular CAR-T de um milhão de células por mililitro.Seis dias após a simulação, remova as contas das células T transduzidas pela primeira vez colhendo e reutilizando as células. Transfira as células em tubos cônicos de 50 mililitros e coloque os tubos em um ímã por um minuto. Depois de coletar o supernanato car-t contendo células e descartar as contas, coloque as células de volta na cultura em uma concentração de um milhão de células por mililitro em um frasco de cultura.Use uma amostra de células para citometria de fluxo para avaliar a expressão superficial dos CARs. Incubar o resto para retomar a expansão e, em seguida, colher e crio-preservar as células no oitavo dia, como descrito no manuscrito. Para interromper o fator estimulante da colônia de macrófagos granulocitos, utilize um RNA guia como descrito no manuscrito.Incubar reagentes de transfecção à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, adicione-as às 293 células T que atingiram 70 a 90% de confluência e cultura das células transfeinadas a 37 graus Celsius, 5% de CO2 para produzir um lentivírus. Aos 24 e 48 horas, colhe e concentra supernasce contendo vírus por ultracentrifugação em tubos ultracentrífugas de 50 mililitros e congela a menos 80 graus Celsius para uso futuro.Então, no primeiro dia, resususpenque suavemente as células T para quebrar as rosetas. Em um laboratório aprovado pelo BSL2+, para gerar células CAR-T, adicione lentivírus CAR19 e lentivírus CRISPR com destino a GMCSF às células T simuladas. No terceiro e quinto dia para células T editadas pela LentiCRISPR com sucesso que carregam resistência à puramicina, tratar células com dihidrocloriloreto de diomicina em uma concentração de um micrograma de puromicina por mililitro.O sequenciamento da maré foi usado para confirmar uma redução GM-CSF em células GM-CSF knockout CART19 com uma eficiência de interrupção de aproximadamente 71% As parcelas de fluxo de manchas de superfície de células CAR-T fechadas em células cancerígenas ao vivo CD3 mostram que tanto o CART19 wild-type quanto o GM-CSF knockout CART19 com sucesso e de forma semelhante expressam o receptor de superfície CAR in vitro. Por outro lado, a coloração intracelular de GM-CSF por citometria de fluxo também fechada em células cd3-positivas ao vivo demonstra diminuição da expressão de GM-CSF nas células eliminatórias em comparação com células CART19 do tipo selvagem confirmando o sucesso funcional do nocaute. Deve-se tomar cuidado especial durante as etapas de transdução deste procedimento, pois são os mais críticos para o desenvolvimento de células CAR-T geneticamente modificadas.A metodologia descrita pode potencialmente ser aplicada a uma variedade de genes para modificar células CAR-T via CRISPR/CAS9 para ajudar a gerar um produto menos tóxico e mais eficaz. A tecnologia CRISPR/CAS9 fornece as estratégias para direcionar diretamente o genoma das células CAR-T para projetar soluções para deficiências clínicas atuais.

using-crisprcas9-to-knock-out-gm-csf-in-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O vídeo descreve um processo para criar células CAR T geneticamente modificadas por meio do Sistema CRISPR-Cas9. Infectar células T com lentivírus CRISPR e CAR resulta em modificações no gene alvo e na síntese de um receptor de antígeno quimérico ou CAR, levando à formação de células T CAR geneticamente modificadas.

Células T CAR geneticamente modificadas usando um sistema CRISPR-Cas9

Este vídeo demonstra um ensaio para realizar a edição de genes em células T humanas usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Uma mistura de células T CD4+ e CD8+ primárias é combinada com um complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, visando genes específicos para nocaute. Após a eletroporação, o sgRNA guia Cas9 para a sequência de DNA alvo, criando cortes precisos. Esses cortes são então reparados pelo mecanismo de junção final não homólogo da célula, levando ao nocaute do gene.

Uma técnica CRISPR-Cas9 para edição de genes em células T

Gene alvo edição usando CRISPR/Cas9 facilitou muito a compreensão das funções biológicas dos genes. Aqui, nós utilizamos a metodologia CRISPR/Cas9 a mutações de calreticulin modelo em células hematopoiéticas dependentes de citocina para estudar sua atividade oncogênica.

Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Estudos convencionais de perda-de-função de genes usando animais nocaute foram frequentemente dispendioso e demorado. Baseado em Electroporation mutagênese mediada por CRISPR somática é uma ferramenta poderosa entender gene funciona em vivo. Aqui, nós relatamos um método para analisar os fenótipos de nocaute nas células em proliferação do cerebelo.

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Aqui, apresentamos um protocolo para edição de genes em células T humanas primárias usando a tecnologia CRISPR Cas para modificar células CAR-T.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Novas estratégias para modelar fielmente mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) são necessárias para melhor estudar a biologia das células-tronco hematopoiéticas e as neoplasias hematológicas. Aqui, um protocolo para modelar mutações heterozigotas de ganho de função em HSPCs combinando o uso de CRISPR/Cas9 e transdução dupla de doador de rAAV é descrito.

Engenharia de Mutações de Ganho de Função Heterozigotas Oncogênicas em Células-Tronco Hematopoiéticas Humanas e Progenitoras

Aqui, descrevemos um método para alterar seletivamente a expressão gênica no plexo coroide, evitando qualquer impacto em outras áreas cerebrais.

Knockdown direcionado de genes no plexo coroide

O artigo descreve um protocolo para a aplicação de um modelo in vitro de exaustão para completar uma triagem de nocaute CRISPR em todo o genoma em células T receptoras de antígeno quimérico de doadores saudáveis.

Realizando uma triagem nocaute CRISPR em todo o genoma in vitro em células T receptoras de antígeno quimérico

Desenvolvemos um protocolo otimizado de triagem knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T primárias. Ao reduzir a transferência de gDNA por meio da digestão enzimática e da redução do de sgRNA, essa abordagem minimiza artefatos de PCR, garantindo a detecção precisa de sgRNA e a identificação robusta de alvos genéticos funcionais.

Melhorando as telas CRISPR-Cas9 em células CAR T: Um método refinado para preparação de bibliotecas

Aprenda a editar geneticamente células CAR-T usando CRISPR/Cas9 durante a fabricação celular. Este método integra produção e modificação genética para criar terapias mais eficazes e menos tóxicas contra câncer.

Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T

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