Projetando experimentos de crescimento de células contínuas, de alta produtividade e automatizados usando o eVOLVER

O eVOLVER dá aos pesquisadores liberdade experimental, a capacidade de definir seus próprios experimentos de crescimento de cultura com feedback automatizado sobre múltiplos parâmetros e dimensioná-los para qualquer tamanho que eles precisam. O eVOLVER é mais flexível do que outros dispositivos. Os usuários podem facilmente personalizar o software em Python, bem como o hardware, modificando as mangas inteligentes que seguram sensores para cada cultura.

O sistema pode parecer complicado à primeira vista com múltiplos componentes e conexões. Um guia visual dá aos usuários da primeira vez mais confiança na execução de experimentos por conta própria. A configuração adequada é crítica.

Certifique-se de entender o que cada componente faz. Então você pode confirmar que eles estão trabalhando. Certifique-se de que tudo está roteado corretamente e conectado com força.

Embora projetado para cultivo aeróbico de bactérias e leveduras em condições variadas, o eVOLVER também poderia ser modificado para fermentação anaeróbica ou para manter células mamíferas em suspensão. Este vídeo demonstrará como configurar, inicializar e executar um experimento de cultura contínua de alto rendimento usando a plataforma eVOLVER. Um dia antes do experimento, preparem a mídia, os frascos e o inóculo de acordo com o manuscrito.

Em três béquers grandes, prepare dois béquers de 10% de alvejante e um béquer de 70% de etanol. Usando os interruptores no dispositivo eVOLVER, ligue a fonte de alimentação de cinco volts no eVOLVER, espere por cinco segundos e ligue a fonte de alimentação de 12 volts. Se executar vários frascos da mesma garrafa de mídia, conecte várias linhas de entrada de mídia com divisores de tubos.

Divisores de tubulação personalizados podem ser construídos com componentes inferiores. Submergir as linhas de entrada de mídia no primeiro béquer de alvejante e nas linhas eflux da mídia no segundo béquer de alvejante. Conecte a extremidade a jusante das linhas de entrada de mídia ao segundo béquer com as linhas eflux.

Coloque linhas de lixo em um carboy de lixo. Adicione um a dois litros de alvejante no carboy de resíduos para esterilizar os resíduos gerados durante o experimento. Usando a tela sensível ao toque no eVOLVER, navegue até a seção de configuração e execute todas as bombas por 20 segundos para encher as linhas de fluido com alvejante de 10%.

Deixe o alvejante sentar nas linhas por pelo menos 30 minutos para esterilizar. Execute as bombas novamente usando a tela sensível ao toque até que as linhas não estejam mais submersas, empurrando o ar através das linhas para obter o máximo de alvejante possível. Coloque linhas de entrada de mídia no béquer de etanol, encha as linhas com etanol, lave-as com ar.

Em seguida, conecte as linhas de entrada de mídia às garrafas de mídia com os conectores inferiores e execute as bombas até que a mídia passe totalmente pelas linhas que liberam qualquer etanol residual. Insira parcialmente frascos esterilizados nas mangas inteligentes eVOLVER e conecte as linhas de entrada à palha de fluxo curto e às linhas de resíduos ao longo eflux strawq de acordo com a codificação de cores. Ajuste na tela sensível ao toque eVOLVER para executar todas as bombas em incrementos de 10 segundos para encher os frascos com mídia.

Certifique-se de que, por inspeção visual, as bombas eflux estão removendo eficientemente a mídia através dos canudos eflux para evitar transbordamentos. Em seguida, empurre os frascos para baixo até ficar totalmente envolto pela manga inteligente. Na página de configuração interativa eVOLVER touchscreen, arraste um dedo pela tela sensível ao toque ou pressione o botão Selecionar Tudo para selecionar todos os frascos e definir as condições iniciais de temperatura em 30 graus Celsius e a agitação para 10.

Em um computador, especifique o dispositivo eVOLVER no qual o experimento será executado. Certifique-se de que as configurações de calibração desejadas foram selecionadas. Abra o painel eVOLVER e navegue até a página Gerenciador de experimentos.

Selecione o experimento Base no painel Navegador de Experimentos ou um experimento existente como ponto de partida e clique em Clone. Navegue até a página do Editor de Experimentos. Use os painéis de definição de seletor de frascos e parâmetros para ajustar a temperatura a 30 graus Celsius e definir um limiar superior e inferior de OD para cada frasco de acordo com o design experimental.

Salve o experimento clicando em Salvar. Em seguida, clique na seta para voltar à página Gerenciador de experimentos e clique no botão Reproduzir para executar. Uma vez que o experimento esteja em andamento, navegue até o painel Dados em Tempo Real no painel interativo.

Para cada frasco, verifique se os valores de OD estão segurando a zero. Navegue pelos gráficos de temperatura para verificar se as temperaturas estão em 30 graus Celsius. Para preparar o inóculo, primeiro meça o OD das culturas noturnas e calcule a diluição total desejada para culturas noturnas assumindo um volume de frasco de 25 mililitros e um OD inicial desejado de cerca de 0,05.

Através da porta de amostragem, pipeta o volume calculado de inóculo ou mistura de inocula. Verifique os gráficos no painel para ver se o OD está aumentando para 0,05. O crescimento celular e as condições do frasco podem ser monitorados em tempo real, pois o experimento está em andamento, permitindo que o pesquisador intervenha caso ocorram problemas.

O eVOLVER é uma plataforma automatizada de cultura contínua que permite o controle multiparmetro das condições da cultura. Diferenças qualitativas foram mostradas entre os grupos selvagens, sensíveis à temperatura e sensíveis ao sal quando as razões de registro foram traçadas contra gerações interpoladas a partir de dados de taxa de crescimento eVOLVER. A cor indica a temperatura da seleção, enquanto os traços distinguem as concentrações de sal.

Uma inclinação que se encaixa na porção linear de cada parcela usando um mínimo de três pontos, produz um valor de aptidão quantitativa que descreve como a tensão variante compete contra a cepa de referência. Os valores negativos de aptidão indicam que a cepa variante é out-competida pela cepa de referência. Verifique sempre se todas as bombas estão funcionando eficientemente e que as linhas de fluido estão livres de quaisquer tamancos.

Um estouro pode arruinar um experimento e potencialmente danificar as mangas inteligentes. Amostras colhidas do eVOLVER podem ser sequenciadas posteriormente para verificar alterações genômicas como resultado do experimento. Essas informações podem ser usadas para projetar novas cepas ou sistemas.

Para pesquisadores que usam a evolução do laboratório ou a seleção da biblioteca, é fácil aplicar pressões de seleção únicas em cada experimento eVOLVER. O controle de feedback e ambientes dinâmicos também são muito acessíveis. O carboy de lixo conterá pequenas quantidades de alvejante e etanol após um experimento.

Consulte o coordenador de segurança do laboratório para o descarte adequado dos resíduos.