Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

Este ensaio in vitro demonstra o broto angiogênico em uma plataforma de alto rendimento e escalável. Isso pode ser usado para encontrar novos alvos em angiogênese. Este ensaio de angiogênese combina ambientes micro celulares complexos que incluem gradientes e perfusão com uma plataforma compatível com triagem de alto rendimento.

A angiogênese desempenha um papel importante tanto na saúde quanto na doença. Entender os mecanismos que ocorrem durante a angiogênese pode nos ajudar a entender como os cânceres crescem e como os tecidos se reparam. Esse método poderia dar uma visão dos mecanismos durante doenças cardiovasculares e regeneração tecidual.

Em ambos, a angiogênese desempenha um papel importante. Para o uso pela primeira vez desta plataforma microfluida, você precisa estar ciente da lei dos volumes e como pipeta. Você pode confirmar os passos olhando sob um microscópio ou virando a placa de cabeça para baixo.

Alguns passos são difíceis de obter uma sensação de quando apenas ler o método, por exemplo, quão pequenos são os canais microfluidos ou como segurar a placa. Demonstrando esses procedimentos será Wendy Stam, uma técnica do nosso laboratório. Para começar, transfira a placa microfludica de 384 poços para um capô de fluxo laminar estéril.

Remova a tampa e adicione 50 microlitadores de água ou salina tamponada de fosfato a cada um dos 40 poços de observação usando uma pipeta multicanal. Em seguida, adicione 1,5 microliters de quatro miligramas por colágeno mililitro uma solução à entrada de gel de cada unidade microfluidica. Certifique-se de que a gota de gel é colocada no meio de cada poço para que o gel entre no canal.

Depois de encher cinco unidades microfluidas, vire a placa de cabeça para baixo para inspecionar visualmente o preenchimento correto dos canais de gel. Coloque a placa microfluida em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 minutos para polimerizar o colágeno. Em seguida, tire a placa da incubadora e transfira para um capô de fluxo laminar estéril.

Adicione 50 microliters de 10 microgramas por solução de codificação de fibronectina mililitro ao poço de saída do canal de perfusão superior de cada unidade microfluidica. Pressione a ponta da pipeta contra o lado do poço para o correto enchimento do poço sem prender bolhas de ar. O canal enche e as panelas líquidas na tomada sem encher bem a tomada.

Em seguida, coloque a placa na incubadora por pelo menos dois dias. Agora, descongele rapidamente os IPSC-CE congelados por menos de um minuto em um banho de água de 37 graus Celsius. Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mililitros e adicione lentamente 10 mililitros de meio basal para diluir.

Desenhe 10 microliters da solução e conte as células em um balcão de celular. Centrifugar o tubo a 100 vezes g durante cinco minutos. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular e resuspend em meio basal para produzir uma concentração de duas vezes 10 para a sétima célula por mililitro.

Em seguida, transfira a placa microfluídica de 384 poços da incubadora para uma coifa de fluxo laminar estéril. Aspire a solução de codificação de fibronectina a partir da tomada de perfusão e adicione 25 microliters de meio basal nos poços de saída. Adicione uma gota de microliter de suspensão celular a cada entrada de perfusão superior bem.

A gota se achata em poucos segundos. Verifique sob um microscópio se a semeadura é homogênea dentro de um único canal e entre canais. Incubar a placa do poço microfluido por uma a 1,5 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Depois disso, verifique as células para confirmar que elas aderiram. Remova o meio basal dos poços de saída de perfusão superior. Adicione meio de cultura de vaso quente na entrada superior de perfusão e saída.

Coloque a placa em uma plataforma de roqueiro que é definida em um ângulo de sete graus e oito minutos de balanço na incubadora. No primeiro e dois dias pós-semeadura, imagem a placa usando um microscópio Brightfield com estágio automatizado para confirmar a viabilidade celular. Depois de dois dias, uma monocamada confluente formou-se contra o colágeno um andaime.

Primeiro, prepare 4,5 mililitros de meio de brotação angiogênica suplementando 4,5 mililitros de meio basal com 4,5 microliters de estoque VEGF, 4,5 microliters de estoque PMA e 2,25 microliters de estoque S1P. Prepare 8,5 mililitros de meio de crescimento de vasos, suplementando meio basal com 5,1 microliters de VEGF e 3,4 microliters de BFGF. Aspirar o meio dos poços e adicionar 50 microliters de meio de cultura de vaso fresco na entrada superior de perfusão e poços de saída e poços de entrada de gel e poços de saída.

Em seguida, adicione 50 microliters de mistura de broto angiogênico a cada uma das entradas do canal de perfusão inferior e poços de saída. Coloque a placa de volta na incubadora na plataforma roqueiro, a fim de formar um gradiente de fatores de crescimento angiogênico. Um dia e dois dias após a adição dos fatores de crescimento angiogênico, use um microscópio Brightfield para imaginar os poços em um estágio automatizado.

Para estudar a anastomose e a estabilização do broto, adicione um microliter de 0,5 miligramas por mililitro fluorescente rotulado albumina à entrada superior de perfusão. Em seguida, misture a solução com uma pipeta de 50 microliter. Transfira a placa para um microscópio fluorescente com estágio automatizado e incubadora a 37 graus Celsius.

Defina o microscópio no objetivo de 10X e corrija as configurações de exposição. Adquira imagens timelapse a cada minuto por 10 minutos. Retire a placa do microscópio e transfira a placa para um capô de fluxo laminar estéril.

Remova todos os meios dos poços e substitua tanto o meio de cultura do vaso quanto o meio de brotação angiogênico nos poços correspondentes. Coloque a placa microfluida de volta na incubadora para continuar a brotar angiogênica. No sexto dia, repita a imagem para estudar a permeabilidade.

Para consertar a cultura celular, aspirar todos os meios de cultura dos poços. Adicione 25 microliters de 4% PFA em PBS a todos os poços de entrada e saída de perfusão. Em seguida, coloque um lado da placa microfluidic na tampa em um leve ângulo de cinco graus para induzir o fluxo.

Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, aspire o PFA dos poços. Lave todas as entradas e tomadas de perfusão duas vezes com 50 microliters de HBSS.

Em seguida, aspire o HBSS dos poços. Paraformaldeído é um produto químico perigoso que deve ser manuseado usando luvas e aberto apenas em um capuz de fumaça. Em seguida, adicione 50 microlitadores de surfactante não iônico de 0,2% a todas as entradas e saídas de perfusão para permeabilize em temperatura ambiente por 10 minutos e coloque a placa microfluida na tampa em um leve ângulo de cinco graus.

Aspire o surfactante não iônico dos poços e lave os canais de perfusão duas vezes adicionando 50 microliters de HBSS a todos os poços de entrada e saída de perfusão. Aspire o HBSS dos poços. Prepare hoechst 1.000 a 2.000 para coloração dos núcleos e prepare Phalloidin 100 a 200 em HBSS para coloração F-actin.

Combine seis mililitros de HBSS, 30 microliters de F-actin, e três microliters de Hoechst em um tubo Falcon. Em seguida, adicione 25 microliters a cada entrada de perfusão e bem saída. Coloque a placa sob um ângulo leve e incubar em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.

Lave duas vezes com 50 microliters de HBSS em todas as entradas e tomadas de perfusão. Em seguida, imagem direta usando um microscópio fluorescente com estágio automatizado ou armazenar a placa protegida da luz a quatro graus Celsius para uso posterior. Neste protocolo, os micro vasos foram continuamente perfundidos e expostos a um gradiente de fatores de crescimento angiogênico.

A semeadura dos IPSC-CEs utilizando o método de bombeamento passivo resultou em densidades homogêneas de semeadura. O timelapse de uma gotícula que é colocada em cima da entrada do canal microfluido mostra a gota logo após a adição, a gota em cima do tronco de entrada após a adição, até que o menisco gotícula foi fixado pela entrada que resultou em um fluxo em direção à tomada. A exposição a um gradiente de fatores angiogênicos resultou no broto angiogênico direcional dos micro vasos dentro do colágeno padronizado um gel.

A formação de células de ponta clara e a invasão no colágeno um gel foi visível 24 horas após a adição do gradiente angiogênico, enquanto as células de estoque, incluindo a formação de lúmen, eram visíveis após 48 horas. Após fixação e coloração, foram identificadas a forma e o comprimento desses brotos. No entanto, sem adição de fatores de crescimento, não foi observada invasão ao colágeno um gel.

Com a imagem confocal, o diâmetro do broto foi determinado e a formação do lúmen foi confirmada. Este método poderia ser usado para testar novos inibidores angiogênicos. Isso pode ajudar a encontrar novos tratamentos contra retinopatia diabética, artrite reumatoide e câncer.

No momento, estamos explorando como podemos criar co-culturas, incluindo um modelo da barreira hemenceroencefálica e organoides vascularizados.