Name: Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a usar Galleria mellonella como modelo alternativo para estudar tuberculose e reduzir modelos mamíferos. Este método permite avaliar eficácia e toxicidade de candidatos a fármacos antimicobacterianos de forma ética e acessível.

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Este projeto foi apoiado por subsídios do Conselho de pesquisa em biotecnologia e ciências biológicas (BBSRC), concedido a PRL e YL (BB/P001262/1), e ao centro nacional de substituição, refinamento e redução de animais em pesquisa (NC3Rs) concedido ao PRL, SMN, BDR e YL (NC/R001596/1).

Nota: todo o trabalho descrito abaixo deve ser realizado em um laboratório CL2 dentro de um gabinete de segurança microbiológica classe 2 (MSC) seguindo as diretrizes locais de saúde e segurança.
1. preparação de M. bovis BCG Lux para infeção
<ol><li>Degelo um 1,2 mL de glicerol congelado (15%) estoque de M. bovis BCG Lux, a cepa vacinal de Montreal transformada com o plasmídeo de transporte PSMT1 carregando os genes luxab de Vibrio harveyi codificando a enzima luciferase19.</li>
	<li>Inocular 15 mL de caldo Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol, 10% de albumina, dextrose, enriquecimento de catalase (ADC) e 50 μg/mL de higromicina com uma alíquota de 1,2 mL descongelada de BCG Lux, em um balão rotulado de 250 ml de Erlenmeyer.</li>
	<li>Coloque o balão em um recipiente de biossegurança selado e incubar a 37 ° c em uma incubadora orbital do abanador em 220 rpm para 72 h (ou até que a cultura alcangue a fase do mid-log do crescimento).</li>
	<li>Verifique o crescimento da cultura do BCG Lux preparando 1:10 diluições da cultura em tubos de luminômetro utilizando soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4, tampão fosfato 0, 1 m, cloreto de potássio de 0, 27 m e cloreto de sódio a 0,137 m) em duplicado. Vórtice, e carregar os tubos de luminômetro no luminômetro e medir a bioluminescência (unidade de luz relativa [RLU]/mL) usando n-DECYL aldeído como o substrato (1% v/v em etanol absoluto)20. Nota: A proporção de unidades formadoras de RLU/colônia (CFU) foi previamente determinada como sendo 3:1 quando o BCG Lux foi cultivado in vitro em caldo Middlebrook 7H920.</li>
	<li>Centrifugue a cultura em 2.175 x g por 10 minutos na temperatura ambiente para pelota as pilhas e descarte o sobrenadante em um desinfetante apropriado com atividade microbactericida conhecida. Descarte todos os resíduos de cultura com desinfetantes apropriados para micobactérias seguindo as diretrizes locais.</li>
	<li>Lave o pellet celular duas vezes em PBS contendo 0, 5% de Polissorbato 80 (PBS-T) para evitar aglutinamento bacteriano.</li>
	<li>Após a lavagem final, o sobrenadante de resíduos decante, ressuscita o pellet de células micobacterianas em PBS-T e dilui a suspensão micobacteriana para a densidade celular desejada usando medidas de RLU.</li>
	<li>Prepare diluições seriadas de dez vezes do insolvente em placas de 24 poços usando PBS-T. Placa para fora 10 μL em placas de agar Middlebrook 7H11 (0,5% glicerol, 50 μg/mL de higromicina, 10% de ácido oleico, albumina, dextrose, catalase [OADC]) em duplicado para enumerar contagens de CFU de inóculo.</li>
</ol>2. preparação de larvas de G. mellonella
<ol><li>Compre larvas de última instar de fontes apropriadas e mantenha as larvas no escuro a 18 ° c à chegada e use dentro de 1 semana de compra. Alternativamente, as larvas podem ser autorcriadas seguindo o protocolo de Jojāo et al.21. Para larvas compradas, Descarte qualquer larva morta, descolorida ou pupating antes do armazenamento. Nota: As larvas de pupating são morfològica distinguíveis às últimas larvas do instar.</li>
	<li>Identificar e selecionar larvas saudáveis para experimentação, com base na cor creme uniforme, com pouca ou nenhuma descoloração (melanização), tamanho (2 − 3 cm de comprimento), peso (aproximadamente 250 mg), exibindo um alto nível de motilidade, e possuindo a capacidade de direito se quando virou.</li>
	<li>Conte com cuidado as larvas saudáveis (mínimo de 20 − 30 por grupo) em uma placa de Petri (94/15 milímetros) alinhada com uma camada de papel de filtro (94/15 milímetros) usando as pinças Blunt-end para minimizar a contaminação e armazenar na temperatura ambiente no escuro até o uso.</li>
</ol>3. infecting G. mellonella com BCG Lux
<ol><li>Minimize a desordem dentro do MSC para reduzir o risco de contaminação e ferimento da vara da agulha.</li>
	<li>Prepare a plataforma de injeção gravando um papel de filtro circular (94 mm) em uma superfície plana levantada. As superfícies macias ou duras podem ser usadas e são inteiramente dependentes da preferência do usuário, por exemplo, tampas da caixa da pipeta ou uma esponja de limpeza de nylon.</li>
	<li>Esterilizar uma microseringa de 25 μL (25 G) aspirando 3 volumes de 70% de etanol e enxaguar com 3 volumes de PBS-T estéril.</li>
	<li>Aspirar 10 μL de inocular de BCG Lux (preparado na secção 1) ou PBS-T na microseringa esterilizada de 25 μL. Utilize uma seringa separada para o controlo negativo PBS-T. Nota: Ressuscitem o inocum do BCG Lux após 10 injeções para garantir a suspensão uniforme das células.</li>
	<li>Use pinças para pegar uma larva e coloque na plataforma de injeção.</li>
	<li>Na plataforma, vire a larva para as costas e imobilize, fixando a cabeça e a cauda com a pinça. Encontre o último direita esquerdo que conta para baixo da cabeça da larva e insira com cuidado a ponta da agulha (5 − 6 milímetros) em um ângulo 10 − 20 ° ao plano horizontal. Nota: Os pinças curtos e estreitos permitem a imobilização fácil com esforço larval mínimo. Preste atenção para não penetrar mais que pode perfurar o intestino e causar não-BCG Lux melanização específico ou morte.</li>
	<li>Conte as larvas infectadas em uma placa de Petri revestida com uma camada de papel de filtro, um único prato de Petri de 90 mm pode acomodar até 30 larvas.</li>
	<li>Guarde a placa de Petri contendo as larvas em uma caixa escura exalada ou não selada dentro de uma incubadora a 37 ° c com 5% de CO2.</li>
</ol>4. monitorando a sobrevivência de G. mellonella depois da infecção
<ol><li>Durante o curso do tempo, monitore a sobrevivência das larvas cada 24 h. as larvas são consideradas mortas quando não se movem em resposta ao toque.</li>
</ol>5. medindo a carga in vivo do BCG Lux em G. mellonella
<ol><li>Em cada ponto de tempo, selecione aleatoriamente cinco larvas infectadas previamente preparadas na seção 3 e esterilize suavemente as superfícies larvares usando cotonetes de cotonete embebidos em 70% de etanol. Nota: Esta etapa é importante quando o homogeneizar larval do chapeamento para a enumeração Mycobacterial de CFU como larvas não-sterilized pode conduzir à contaminação.</li>
	<li>Coloque as larvas individualmente em 2 mL de tubos de matriz lisando contendo 800 μL de PBS estéril.</li>
	<li>Homogeneizar as larvas usando um homogeneizador para 60 s em 6,0 m/s.</li>
	<li>Centrifugue os tubos lisando em 3.500 x g para 5 s para remover o homogeneizado das tampas, e decantar com cuidado o homogeneate em tubos estéreis do luminómetro individualmente. Nota: Para enumeração de CFU (etapa 5,7), assegure-se de reservar 100 μL de homogeneate em um tubo de reação estéril de 1,5 mL.</li>
	<li>Recupere todo o homogeneate restante lavando os tubos da matriz de Lise com 1 ml de PBS-T e pipeta nos tubos correspondentes do luminómetro.</li>
	<li>Vórtice dos tubos do luminômetro e meça a bioluminescência dos homogeneatos descritos previamente na etapa 1,4.</li>
	<li>Prepare dez vezes diluições seriais do homogeneate em 24 placas da cultura do poço usando PBS-T. Placa para fora 10 μL da diluição para as placas de agar Middlebrook 7H11 contendo 0,5% de glicerol, 50 μg/mL de higromicina, 10% de OADC e 20 μg/mL de piperacilina, para determinar a relação RLU/CFU de BCG Lux após infecção in vivo. Nota: A piperacilina elimina a microbiota nativa de G. mellonella com inibição mínima de crescimento do BCG Lux16.</li>
</ol>6. análise estatística
<ol><li>Plotar a curva de sobrevida de Kaplan-Meier usando dados coletados e realizar o teste de Mantel-Cox (log-rank) para determinar a significância do resultado, onde * p < 0, 5, * * p < 0, 1, * * * p < 0, 1 e * * * * p < 0, 1.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O uso de G. mellonella como modelo de infecção foi estabelecido para um número de patógenos bacterianos e fúngicos para o estudo da virulência, interação hospedeiro-patógeno e como tela para a nova terapêutica10,22. A discussão a seguir é baseada no procedimento experimental para o uso de G. mellonella como um modelo de infecção para o mtbc.
A saúde das larvas ingênuas antes da experimentação pode ter um impa...

A tuberculose (TB) é uma grande ameaça à saúde pública global com 9 milhões casos novos por ano e 1,5 milhões mortes1. Além disso, estima-se que um quarto da população mundial está infectado com o agente causador da doença, Mycobacterium tuberculosis (MTB). Entre a população infectada, 5 − 10% desenvolverão doença ativa da TB ao longo de sua vida. Além disso, a emergência e a propagação do MTB resistente do multi-droga (MDR) e do extensivamente-droga (XDR) representa uma ameaça séria ao controle da doença, com os 123 países que reportam pelo menos um caso XDR1. O tratamento da TB requer um coquetel de pelo menos quatro medicamentos antimicobacterianos, dos quais isoniazida e rifampicina são prescritos por uma duração mínima de seis meses; o tratamento é associado frequentemente com os efeitos secundários e as toxicidades complexos. A proteção da única vacina licenciada contra a TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), é variável2. Uma compreensão incompleta da patogênese da TB dificulta significativamente o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e de vacinação.
Durante décadas, os modelos de infecção animal têm sido vitais para a pesquisa de TB para compreender a patogênese básica e a resposta do hospedeiro à infecção, e para avaliar novos agentes antimicobacterianos, imuno-terapêutica e novas candidatas à vacina3, 4. no entanto, a pesquisa utilizando modelos de infecção animal da TB é notoriamente difícil, pois a patogênese e a progressão da infecção por TB são complexas, e não há um modelo animal único que imita o espectro completo e as características importantes da doença5 ,6. Além disso, experimentos com animais são caros, demorados a empreender e necessitam de plena justificação ética. No entanto, modelos de infecção animal de TB têm sido descritos em primatas não humanos (por exemplo, macaques), cobaias, coelhos, bovinos, suínos, camundongos e zebrafish, cada um com suas limitações3,4. O modelo murino é o modelo mais comumente utilizado devido ao custo, disponibilidade de linhagens, reprodutibilidade da infecção e abundância de reagentes imunológicos. Entretanto, não formam tipicamente granulomas associados a áreas de hipóxia que são características de infecção latente por tuberculose (LTBI)6. As cobaias são altamente suscetíveis à infecção de MTB , com patologia e formação adiantada do granuloma similar àquelas nos seres humanos, e são amplamente utilizadas no teste da vacina; ainda a falta de reagentes imunológicos dificulta seu uso como modelo de infecção7. Os zebrafish são apropriados para a seleção em grande escala em estudos pré-clínicos do cedo-estágio devido a seu tamanho pequeno, a reprodução rápida e as ferramentas genéticas avançadas, mas são anatomicamente e fisiologicamente diferentes aos seres humanos e são somente suscetíveis a Infecção do marinum do Mycobacterium 3. Os modelos animais mais parecido com a infecção humana MTB são primatas não-humanos (por exemplo, o macaco), mas eles são caros e têm considerações éticas e práticas significativas que limita consideravelmente o seu uso8.
A larva do inseto da traça maior da cera ou da traça do favo de mel, Galleria mellonella, tornou-se cada vez mais popular como um modelo da infecção para uma variedade de micróbios patogénicos bacterianos e fungosos9, e como uma tela para candidatos antimicrobial novos da droga 10. G. mellonella é um modelo de invertebrados de sucesso devido ao seu sofisticado sistema imunológico inato (composto por defesas celulares e humorais) que compartilha um alto grau de semelhança estrutural e funcional com o dos vertebrados11 . Isso inclui mecanismos imunes como a fagocitose de patógenos por hemócitos (funcionalmente semelhantes aos macrófagos de mamíferos e neutrófilos)12,13, a produção e circulação de peptídeos antimicrobianos (AMPS) e proteínas complemento-like dentro da hemolinfa (análoga ao sangue de mamíferos) de G. mellonella11. Outras vantagens9,14,15 de larvas de G. mellonella como um modelo incluem 1) seu tamanho grande (20 − 30 milímetros) que permite a manipulação e a infecção fáceis, assim como a coleção do tecido e hemolinfa para análises, 2) fácil manutenção a 37 ° c, compatível para estudo de patógenos humanos, 3) infecção precisa por injeção sem necessidade de anestesia, 4) a eficácia dos agentes antimicrobianos pode ser avaliada utilizando menos medicamentos para avaliação, 5) falta de restrições éticas em relação ao uso de mamíferos, 6) grandes tamanhos de grupo podem ser usados em comparação com modelos animais permitindo maior reprodutibilidade, e 7) tempos mais curtos para experimentos de infecção são necessários.
Em um estudo recente, Nós demonstramos que G. mellonella pode ser usada como um modelo novo da infecção para estudar a patogénese da infecção pelo Luxbioluminescente de M. bovis BCG, uma versão genetically modificada da tensão da vacina e do membro do complexo MTB (mtbc)16. Enquanto G. mellonella tem sido usada anteriormente como um modelo de infecção para micobactérias não tuberculosas (NTM), principalmente M. marinum e Mycobacterium abscessus17,18, estudos usando mtbc são limitados a de Li et al.16. Cepas micobacterianas não patogênicas bioluminescentes, que podem ser usadas no nível de contenção (CL) 2 como um substituto para MTB, oferecem as vantagens de segurança e praticidade sobre micobactérias patogênicas. Após a infecção pelo BCG Lux, as larvas começam a desenvolver estruturas semelhantes ao Granuloma precoce, o que poderia fornecer uma visão valiosa sobre o papel da imunidade inata no estabelecimento da infecção por TB16. Além disso, este modelo simples de infecção por invertebrados tem o potencial de fornecer uma avaliação rápida, de baixo custo e confiável da patogênese da TB incorporando desafio controlado e múltiplas repetições para reprodutibilidade. Além disso, o modelo tem o potencial para ser usado para a tela de novos candidatos a drogas e vacinas anti-TB no desenvolvimento precoce, reduzindo o número total de animais em experimentação. A capacidade de medir mudanças na estrutura hospedeira e patógeno, transcriptoma e proteoma para determinar alvos de drogas e avaliar mecanismos de ação de novas drogas e vacinas terapêuticas, também são vantajosas.
Aqui nós descrevemos os protocolos experimentais para a preparação de um inocular bioluminescente de M. bovis BCG Lux e de larvas de G. mellonella para a infecção Mycobacterial, assim como a determinação de larval e de Mycobacterial sobrevivência em resposta à infecção.

<table><tbody><tr><td>Tubo de reação de 1,5 mL (Eppendorf)</td> <td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>20, 200 e 1.000 &micro; L pipeta e ponteiras filtradas</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 24 poços</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de 25 mL e pipeta menino</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 3 compartimentos (94/15 mm)</td><td>Greiner</td><td>637102</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugador</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Armário de segurança Classe II</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/ um</td><td></td></tr><tr><td>balão Erlenmeyer com tampa ventilada (250 mL)</td><td>Corning</td><td>CLS40183</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (>99,7%)</td><td>VWR</td><td>208221.321</td><td></td></tr><tr><td>Galleria mellonella (250 por pk)</td><td>Livefood Direct UK</td><td>W250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador (FastPrep-24 5G)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Corning</td><td>30-240CR</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer (Autolumat LB 953)</td><td>Berthold</td><td>34622</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de luminômetro</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Lysing matrix (S, 2.0 mL)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116925500</td><td></td></tr><tr><td>Micro seringa (25 &micro; L, 25 G)</td><td>SGE</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11 ágar</td><td>BD Bioscience</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Middlebrook 7H9</td><td>BD Bioscience</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Enriquecimento Middlebrook ADC</td><td>BD Bioscience</td><td>212352</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook Enriquecimento OADC</td><td>BD Bioscience</td><td>212240</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium bovis BCG lux</td><td>Vários</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>n-decil aldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7384-100G</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação orbital</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Polissorbato 80 (Tween-80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8074-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Caixa pequena</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td>caixa escura ventilada ou não selada recomendada</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td>Pinças curtas e estreitas/sem corte Winterm</td></tr><tr><td>(V1.08)</td><td>Berthold</td><td>n/a</td><td>Programa LB953. Placa de Petri TTB</td></tr><tr><td>(94/15 mm)</td>Papel <td>de filtro 633181</td><td></td> <td>Greiner</td></tr><tr><td>(94 mm)</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>n/a</td><td>Corte para caber</td></tr></tbody></table>

uso do invertebrado galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo mycobacterium tuberculosis

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

A tuberculose é a principal causa global de mortalidade por doenças infecciosas e cerca de um quarto da população mundial é acreditado para ser infectado com Mycobacterium tuberculosis. Apesar de décadas de pesquisa, muitos dos mecanismos por trás do sucesso da M. tuberculosis como um organismo patogénico continuam a ser investigados, e o desenvolvimento de drogas antimiccobacterianas mais seguras e eficazes são urgentemente necessários para enfrentar o aumento e disseminação da tuberculose resistente à droga. No entanto, a progressão da investigação da tuberculose é estrangulada por modelos tradicionais de infecção de mamíferos que são dispendiosos, demorados e eticamente desafiadores. Previamente nós estabelecemos as larvas do inseto Galleria mellonella (maior traça de cera) como uma novela, reprodutível, de baixo custo, de alta taxa de transferência e eticamente aceitável modelo de infecção para os membros do complexo M. tuberculosis . Aqui nós descrevemos a manutenção, a preparação, e a infecção de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG . Usando este modelo da infecção, a virulência dependente da dose Mycobacterial pode ser observada, e um leitura rápido da carga Mycobacterial in vivo usando medidas do bioluminescência é facilmente alcançável e reprodutível. Embora existam limitações, como a falta de um genoma totalmente anotado para a análise transcriptômica, a análise ontológica contra insetos geneticamente semelhantes pode ser realizada. Como um modelo de baixo custo, rápido e eticamente aceitável para a tuberculose, G. mellonella pode ser usado como uma pré-tela para determinar a eficácia e toxicidade da droga, e para determinar a virulência micobacteriana comparativa antes do uso de mamíferos convencionais Modelos. O uso do modelo de G. mellonella-micobactérias levará a uma redução no número substancial de animais atualmente utilizados na pesquisa em tuberculose.

Aqui apresentamos dados representativos que podem ser obtidos usando o modelo de infecção por g. mellonella — BCG Lux e destacam os benefícios de g. mellonella como um modelo de infecção para os membros do mtbc (Figura 1). Os procedimentos experimentais com pontos técnicos principais estão descritos na Figura 2.
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A Galleria mellonella foi recentemente estabelecida como um modelo de infecção reprodutível, barato e eticamente aceitável para o complexo Mycobacterium tuberculosis . Aqui nós descrevemos e demonstramos as etapas tomadas para estabelecer a infecção bem sucedida de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG .

Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Este protocolo descreve o uso da Galleria mellonella como um modelo alternativo de infecção para estudar a tuberculose, reduzindo o número de modelos mamíferos utilizados na pesquisa. Quando comparada com modelos convencionais de mamíferos, como camundongos, a Galleria mellonella é um modelo mais barato, eticamente aceitável e mais acessível para estudar a tuberculose. Uma maior otimização desse modelo permitirá a triagem da eficácia e toxicidade de medicamentos antimicobacterianos candidatos e contribuirá para o desenvolvimento de novas terapêuticas urgentemente necessárias para a tuberculose.Galleria mellonella possui um complexo sistema imunológico inato comparável ao dos mamíferos. O estudo da interação hospedeiro-patógeno pode revelar ainda mais o papel da imunidade inata na tuberculose. O uso da Galleria mellonella como modelo de infecção não se limita à tuberculose e tem sido amplamente utilizado para outros patógenos bacterianos e fúngicos na última década.Para começar, descongele um estoque de glicerol congelado de 1,2 mililitro de Mycobacterium bovis BCG lux, a cepa de vacina de Montreal transformada com o pSMT1 de transporte plasmídeo carregando os genes luxAB. Em um fra

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Oral e intra infecção haemocolic de larvas de traça da...

O inseto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um modelo de infecção poderosa para investigar Patogênese Bacteriana

Este vídeo demonstra um método para estabelecer um modelo de infecção por Mycobacterium bovis nas larvas da mariposa-da-cera, Galleria mellonella. Uma cepa bioluminescente de Mycobacterium bovis BCG é injetada na hemolinfa da larva para estabelecer a infecção, e a bioluminescência é medida em intervalos predefinidos para estudar o progresso da infecção.

Uma técnica para estabelecer um modelo de infecção bacteriana em larvas de insetos

Este vídeo mostra a medição da carga bacteriana in vivo usando Bacillus Calmette-Guérin, BCG, larvas de insetos infectados com lux. O processo envolve homogeneização larval, tratamento com substrato de luciferase e medição de bioluminescência para determinar unidades de luz relativas que se correlacionam com a carga bacteriana.

Medição da carga in vivo de bactérias que expressam luciferase em uma larva de inseto

A larva da cera traça Galleria mellonella foi recentemente estabelecido como um modelo in vivo para estudar a infecção Legionella pneumophila. Aqui, nós demonstramos técnicas fundamentais para caracterizar a patogênese da Legionella nas larvas, incluindo a inoculação, a medida da virulência bacteriana e replicação, bem como extração e análise de hemócitos infectados.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Descrevemos a imagem óptica de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) usando fluorescência de enzima repórter (REF). Esse protocolo proporciona uma detecção sensível e específica de M. tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para investigação patogenia, terapêutica e vacina.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Galleria mellonella serve como um modelo de invertebrados para candidíase disseminada. Aqui, detalhamos a infecção do protocolo e fornecer dados de apoio para a eficácia do modelo.

O modelo de infecção Waxworm Galleria mellonella para candidíase disseminada

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de administração oral usando Galleria mellonella larvas e como caracterizar induzido inatas respostas imunes. Usando este protocolo, será capazes de usar a alimentação forçada método mellonella g. pesquisadores sem experiência prática.

Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

Este estudo apresenta uma estrutura padronizada para otimizar os modelos de infecção por G. mellonella para uso na avaliação antimicrobiana pré-clínica. A aplicação de um modelo de G. mellonella como parte de um pipeline de desenvolvimento antimicrobiano pré-clínico pode diminuir o número de compostos ineficazes que progridem para ensaios clínicos.

Galleria mellonella como modelo de triagem antimicrobiana

Aqui apresentamos um protocolo para realizar uma inoculação intradérmica de baixa dose de Mycobacterium avium em uma orelha de camundongo para refletir condições semelhantes à exposição.

Inoculação intradérmica de Mycobacterium avium na orelha de camundongo

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

Aprenda a usar Galleria mellonella como modelo alternativo para estudar tuberculose e reduzir modelos mamíferos. Este método permite avaliar eficácia e toxicidade de candidatos a fármacos antimicobacterianos de forma ética e acessível.

Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

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