Name: Descoberta natural do produto com filtração da fragmentação diagnóstica de LC-MS/MS: aplicação para a análise do Microcystin (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda a filtragem de fragmentação diagnóstica para descoberta de produtos naturais em misturas complexas usando LC-MS/MS e MZmine. Este método identifica novos compostos estruturalmente relacionados, incluindo toxinas como microcistinas.

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Os autores agradecem Heather Roshon (centro de cultura phycological canadense, Universidade de Waterloo para fornecer a cultura do cianobactérias estudada e sawsan abusharkh (Universidade de Carleton) para a assistência técnica.

1. preparação de cromatografia líquida não direcionada (LC)-conjuntos de dados MS/MS
Nota: DFF pode ser realizado usando qualquer espectrómetro de massa de alta resolução e método analítico otimizado para uma classe alvo de analitos. MC otimizado LC-MS/MS condições no Espectrómetro de massa Orbitrap estão listados na tabela de materiais.
<ol><li>
Transferindo MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) Nota: os dados de exemplo CPCC300. Raw podem ser encontrados em https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.<ol>
<li>No menu suspenso métodos de dados brutos , selecione a opção de importação de dados brutos .</li>
		<li>Escolha o arquivo (s) de dados a ser analisado. Arquivos simples ou múltiplos podem ser importados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opcional Se o formato de dados do fornecedor não for suportado pelo MZmine, use o Proteowizard16 para gerar arquivos de dados centrados. mzml.<ol>
<li>Escolha o filtro de picking de pico para aplicar o algoritmo de centriding fornecido pelo fornecedor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. filtragem de fragmentação diagnóstica de arquivos DDA importados
<ol><li>Usando o cursor, selecione e realce o arquivo de dados na coluna arquivos de dados brutos da tela mzmine principal.</li>
	<li>No menu suspenso Visualização , selecione a opção de filtragem de fragmentação de diagnóstico .</li>
	<li>Na caixa de diálogo DFF que aparece (Figura 3), insira as seguintes opções:<ol>
<li>Tempo de retenção – use o intervalo automático ou defina o intervalo de tempos de retenção em minutos quando a classe de analitos de destino elute.</li>
		<li>
Precursor m/z -use auto Range ou defina a faixa m/z da classe de analisadores segmentadas, incluindo a possibilidade de vários compostos carregados quando apropriado.</li>
		<li>
m/z tolerância – Insira a precisão de massa MS/MS realizável do MSinstrument; 0, 1 m/z ou 3,0 ppm é apropriado para uma plataforma Orbitrap. Se somente os íons diagnósticos do produto serão investigados, entrada 0,0 na opção diagnóstica do valor da perda neutra (da) . Inversamente, se somente as perdas neutras diagnósticas serão investigadas, entrada 0,0 na opção diagnóstica dos íons do produto (m/z) .</li>
		<li>
Íons de produto de diagnóstico (m/z) – entrada do produto específico de classe Ion (s) m/z. Separe vários íons de produto com uma vírgula. Nota: inserir vários íons de produto visualizará espectros que contenham todos os íons de produtos listados.</li>
		<li>
Valor de perda neutra diagnóstica (da) – Introduza a classe de perda neutra específica (es). Separe múltiplas perdas neutras com uma vírgula. Nota: a Incolocação de múltiplas perdas neutras visualizará espectros que contenham todas as perdas neutras listadas. A incolocação de íons de produtos diagnósticos e perdas de neutros visualizará espectros que satisfaçam todos os critérios.</li>
		<li>
Intensidade mínima do íon diagnóstico (% pico base) – como% do pico de base dos espectros MS/MS, definir a intensidade mínima para os íons do produto de diagnóstico e/ou perdas neutras a serem consideradas.</li>
		<li>
Arquivo de saída Peaklist – selecione um caminho e um nome de arquivo para gerar os resultados.</li>
		<li>Clique no botão OK para iniciar a análise DFF. Um gráfico DFF aparecerá ao concluir com êxito as etapas acima Observação: dois arquivos de dados. csv serão gerados. {Arquivo de saída Peaklist}. csv contém o precursor m/z, números de digitalização e tempos de retenção das varreduras. Isso pode ser usado em módulos MZmine existentes, incluindo métodos de dados brutos > detecção de pico > detecção de pico direcionada para gerar cromatogramas de íons extraídos de precursores que PREENCHERAM os critérios dff definidos. {Arquivo de saída do Peaklist} _ Data. csv contém o precursor m/z, o íon do produto m/z e os tempos de retenção para permitir a geração de plotagens dff fora do mzmine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. exemplo de uso de DFF para análise de microcistina
<ol><li>
Preparação da amostra
	<ol>
<li>Esterilizar 250 mL de frascos de Erlenmeyer contendo 30 mL de meio de MA estéril17 ou outros meios de crescimento de cianobactérias (BG-11) equipados com uma rolha de espuma.</li>
		<li>Inoculate meios de crescimento esterilizados com uma cultura de cianobactérias para aproximadamente 5 × 105 células ml-1 condições assépticas. Monitore a densidade da pilha com um Hemocytometer. Neste exemplo, cresça a estirpe de M. aeruginosa CPCC300 fotoautotrophically em 27 ° c, iluminado com luz fluorescente branca fresca (30 μe M-2 s-1) usando uma luz de 12 h: regime escuro de 12 h. Gire as células uma vez por dia.</li>
		<li>Separe as células do meio de cultura após 26 dias por filtração a vácuo usando 47 mm de diâmetro GF/C vidro filtro de microfibra papéis.</li>
		<li>Adicionar 3 mL de 80% de metanol (AQ) a células colhidas em 14 ml de tubo (s) de ensaio.</li>
		<li>Vortex e, subsequentemente, proceda o tubo (s) de teste contendo células de cianobactérias para 30 s cada. Conservar os tubos de ensaio a-20 ° c durante 1 h. devolver o tubo de ensaio à temperatura ambiente e permitir que a amostra (s) descongele durante 15 min.</li>
		<li>Repita o passo 3.1.5 duas vezes adicionais para efetivamente lyse as células.</li>
		<li>Filtre o extrato (s) de células de cianobactérias resultantes através de um filtro (s) de seringa de PTFE de 0,22 μm.</li>
		<li>Extrato seco (s) com um evaporador a uma temperatura de 30 ° c usando um fluxo suave de gás nitrogênio. Armazene o extrato seco a-20 ° c até a análise LC-MS/MS.</li>
		<li>Reconstituir o resíduo seco com 500 μL de 90% de metanol (AQ) e vórtice por 30 s num frasco de HPLC âmbar antes da análise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise o extrato de cianobactérias usando um método de aquisição DDA em um espectrómetro de massa de alta resolução. Nota: as condições otimizadas de LC-MS para a análise de MC usadas aqui são alistadas na tabela de materiais.</li>
	<li>Prepare os DataFile (s) DDA e importe para MZmine seguindo as etapas 1,1 e 1,2.</li>
	<li>Selecione os DataFiles e inicie os módulos DFF seguindo as etapas 2.1-2.2.</li>
	<li>Para a análise de MC, use as seguintes configurações dentro do módulo DFF (Figura 3).<ol>
<li>
Tempo de retenção – Insira o intervalo de 2, 0 a 6, 0 min.</li>
		<li>
Precursor m/z – entrada m/z intervalo de 430, 0 a 1200, 0.</li>
		<li>
m/z tolerância – aplique a tolerância m/z de 0, 1 m/z ou 3,0 ppm.</li>
		<li>
Íons diagnósticos do produto (m/z) -entrada m/z de 135, 803, 163,1114 como os íons diagnósticos do produto</li>
		<li>
Valor de perda de diagnóstico neutro (da) – entrada 0,0 para definir que não há perdas de diagnóstico neutro estão sendo usados.</li>
		<li>
Intensidade mínima do íon diagnóstico (% pico base) – use 15, 0 como o limiar de intensidade mínima</li>
		<li>
Arquivo de saída Peaklist – defina o arquivo de saída como putative_MCs. csv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clique no botão OK para iniciar a análise DFF. Um gráfico DFF (Figura 4) aparecerá após concluir com êxito as etapas acima</li>
</ol>

<ol><li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li>
<li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS%E2%80%93NRPS%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li>
<li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li>
<li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828(2016).</li>
<li>Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%3A+An+International+Journal+Devoted+to+the+Rapid+Dissemination+of+Up-to-the-Minute+Research+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li>
<li>Bartók, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+%28FB1%29+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395(2010).</li>
<li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendix+3%3A+tables+of+microcystins+and+nodularins%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+cyanobacterial+monitoring+and+cyanotoxin+analysis%22%5BJournal%5D)">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li>
<li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blooming+algae%3A+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Fisheries+and+Aquatic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li>
<li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms%3A+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+algae%22%5BJournal%5D)">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li>
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<li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li>
<li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoWizard%3A+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li>
<li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+%28Microcystis+aeruginosa%29+under+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li>
<li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li>
<li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions%3A+differences+of+electrospray+ionization%2Fcollision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda%5BTitle%5D)+AND+%22European+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li>
<li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+%26+technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science & technology. 48 (4), 2097(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

DFF é uma estratégia direta e rápida para a detecção de classes inteiras de compostos, especialmente relevantes para a descoberta de compostos de produtos naturais. O aspecto mais importante do DFF é definir os critérios específicos de fragmentação MS/MS para a classe de compostos de destino. Neste exemplo representativo, o DFF foi utilizado para detectar todos os resíduos de Adda contendo MCs presentes em extrato celular M. aeruginosa . Embora a grande maioria dos MCs contenha um resíduo de Adda, outros resíduo...

A espectrometria de massas em tandem (MS/MS) é um método de espectrometria de massas amplamente utilizado que envolve isolar um íon precursor e induzir a fragmentação via aplicação da energia de ativação, como a dissociação induzida por colisão (CID)1. A forma como os fragmentos de íons estão intimamente ligados à sua estrutura molecular. Os produtos naturais são muitas vezes biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de como um único produto químico único2. Como tal, compostos estruturalmente relacionados que fazem parte da mesma classe biossintética muitas vezes compartilham características-chave de fragmentação MS/MS, incluindo íons de produtos compartilhados e/ou perdas neutras. A capacidade de amostras complexas de tela para compostos que possuem íons de produto de classe específica e/ou perdas neutras é uma estratégia poderosa para detectar classes inteiras de compostos, potencialmente levando à descoberta de novos produtos naturais3, 4. º , 5. º , 6. por décadas, os métodos de espectrometria de massa, como a digitalização de perda neutra e a digitalização de íons precursores realizados em instrumentos de baixa resolução permitiram a detecção de íons com a mesma perda neutra ou íons de produto. No entanto, os íons ou transições específicas precisavam ser definidos antes da realização dos experimentos. Como espectrómetros de massa de alta resolução tornaram-se mais populares em laboratórios de pesquisa, amostras complexas são agora comumente rastreadas usando métodos de aquisição (DDA) não direcionados e dependentes de dados. Em contraste com a perda neutra tradicional e a varredura do íon do precursor, os compostos estruturalmente relacionados podem ser identificados pela análise do borne-aquisição7. Neste trabalho, demonstramos uma estratégia que desenvolvemos denominado filtragem de fragmentação diagnóstica (dff)5,6, uma abordagem direta e fácil de usar para detectar classes inteiras de compostos dentro de matrizes complexas. Este módulo DFF foi implementado na plataforma de código aberto, MZmine 2 e disponível baixando MZmine 2,38 ou lançamentos mais recentes. DFF permite aos usuários a tela eficientemente conjuntos de dados DDA para MS/MS espectros que contêm íons do produto (s) e/ou perda neutra (es) que são diagnósticos para classes inteiras de compostos. Uma limitação de DFF é íons do produto característico e/ou as perdas neutras para uma classe de compostos devem ser definidas pelo analista.
Por exemplo, cada uma das mais de 60 micotoxinas fumonisicas diferentes identificadas8,9possuem uma cadeia lateral tricarballylic, que gera um íon de produto m/z 157, 142 (C6H5O5-) após fragmentação do [M-H]- Ion4. Portanto, todas as fumonisinas putativas em uma amostra podem ser detectadas usando DFF por meio da triagem de todos os espectros MS/MS dentro de um conjunto de dados DDA que contenham o íon de produto m/z 157, 142 proeminente. Da mesma forma, os compostos sulados podem ser detectados pela triagem de conjuntos de dados DDA para espectros MS/MS que contêm uma perda neutra diagnóstica de 79,9574 da (SO3)3. Esta abordagem também foi aplicada com sucesso para a detecção de novos peptídeos cíclicos5 e produtos naturais que contêm resíduos de triptofano ou fenilalanina6.
Para demonstrar a efetividade do DFF e sua facilidade de uso dentro da plataforma MZmine10, aplicamos essa abordagem à análise de microcistinas (MCS); uma classe de mais de 240 toxinas estruturalmente relacionadas produzidas por cianobactérias de água doce11,12,13.
As cianotoxinas mais comumente relatadas são MCs, com o congéner MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) mais freqüentemente estudado (Figura 1). MCs são heptapeptides não-ribossômicos monocílicos, biossintetizados por múltiplos gêneros de cianobactérias, incluindo Microcystis, Anabaena, no, e Planktothrix12,13. Os MCs são compostos por cinco resíduos comuns e duas posições variáveis ocupadas por aminoácidos L. Quase todos os MCs possuem um resíduo característico do ácido β-aminoácido 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico (Adda) na posição 511.  As vias de fragmentação MS/MS do MCS são bem descritas14,15; o resíduo de Adda é responsável para o íon proeminente do produto de MS/MS, m/z 135, 803+ (c9H11O+) assim como outros íons do produto que incluem m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (Figura 2). Conjuntos de dados de DDA não direcionados de extratos celulares de Microcystis aeruginosa podem ser rastreados para todas as microcistinas presentes usando esses íons diagnósticos, dado que as microcistinas têm um resíduo de Adda.

<table><tbody><tr><td>Cyanobacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td> CENTRO CANADENSE DE <td>CULTURA FICOLÓGICA</td><td></td> CPCC300 <td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteowizard (software)</td><td></td><td>software</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td></tr> <tr><td>software Mzmine 2</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://mzmine.github.io/LC-MS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap</td> <td>Thermo-Equipado</td> <td>com fonte de ionização HESI</td><td></td></tr> <tr><td>1290 UHPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Equipado com bomba binária, amostrador automático, compartimento de coluna</td></tr><tr><td>Coluna</td> <td>C18Agilent</td><td>959757-902</td><td>Eclipse Plus C18 RRHD coluna (2.1 &times; 100 mm, 1.8 &mu; m)</td></tr> <tr><td>< forte > solventes < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Optima LC-MS grau Metanol</td><td>Fisher</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>OptimaLC-MS grau Acetonitrila</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>OptimaLC-MS grau Água</td><td>Fisher</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grau Ácido fórmico</td><td>Fisher</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Indústrias Científicas</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Micro 21</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-772-436</td><td></td></tr><tr><td><forte>Outros</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Frascos de HPLC âmbar 2 mL/caps</td><td>Agilent</td><td>5182-0716/5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>0.2-&mu; m Filtros de seringa PTFE</td><td>Pall Corp.</td><td>4521</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de microfibra de vidro Whatman 47mm GF/A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1820047</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MA media (pH 8,6) (quantidade/L)</td><td></td><td></td><td>Watanabe, M. F. & Oishi, S. Efeitos de fatores ambientais na toxicidade de uma cianobactéria (Microcystis aeruginosa) em condições de cultivo. Microbiologia aplicada e ambiental. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td></tr><tr><td>Ca(NO3)&middot; 4H2O, 50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2786</td><td></td></tr><tr><td>KNO3, 100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8291</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3, 50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5022</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4, 40 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5640</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H20, 50 mg</td><td>de Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Glicerofosfato de sódio, 100 mg</td><td>de Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3, 20 mg</td><td>de Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bicina, 500 mg</td><td>de Sigma-Aldrich</td><td>RES1151B-B7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>P(IV) solução metálica, 5 mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Traga o seguinte para 1 L com ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaEDTA&middot; 2HO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3 &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>Baker</td><td>2540</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Baker</td><td>3764</td><td></td></tr><tr><td>Cyanobacteria BG-11 50X Solução de água doce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

descoberta natural do produto com filtração da fragmentação diagnóstica de lc-ms/ms: aplicação para a análise do microcystin

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Os produtos naturais são frequentemente biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de um único composto. Devido a suas características estruturais comuns, muitos compostos dentro da mesma classe sofrem a fragmentação similar de MS/MS e têm diversos íons idênticos do produto e/ou perdas neutras. O objetivo da filtragem de fragmentação diagnóstica (DFF) é detectar eficientemente todos os compostos de uma determinada classe em um extrato complexo, selecionando conjuntos de dados não direcionados de LC-MS/MS para espectros MS/MS que contenham íons de produto específicos de classe e/ou perdas neutras. Este método é baseado em um módulo DFF implementado dentro da plataforma MZmine de código aberto que requer extratos de amostra ser analisado por aquisição dependente de dados em um espectrómetro de massa de alta resolução, como Quadrupole Orbitrap ou Quadrupole massa de tempo de vôo Analisadores. A principal limitação desta abordagem é que o analista deve primeiro definir quais íons de produto e/ou perdas neutras são específicos para a classe alvo de produtos naturais. DFF permite a descoberta subseqüente de todos os produtos naturais relacionados dentro de uma amostra complexa, incluindo novos compostos. Neste trabalho, demonstramos a eficácia do DFF através da triagem de extratos de Microcystis aeruginosa, uma flor de algas nocivas proeminente causando cianobactérias, para a produção de microcistinas.

A parcela de DFF gerada após a análise de M. aeruginosa CPCC300 é mostrada na Figura 4. O eixo xdeste gráfico é o m/z dos íons precursores que satisfizeram os critérios definidos do dff, enquanto o eixo ymostra o m/z de todos os íons do produto dentro dos espectros MS/MS do MCS. Para esta análise, os critérios para detecção de MC incluíram íons precursores dentro da faixa de m/z de 440-1200, tempos de rete...

Filtragem de fragmentação de diagnóstico, implementada em MZmine, é uma abordagem elegante, pós-aquisição para tela LC-MS/MS conjuntos de dados para classes inteiras de produtos naturais conhecidos e desconhecidos. Esta ferramenta procura espectros MS/MS para íons de produto e/ou perdas neutras que o analista definiu como sendo diagnóstico para toda a classe de compostos.

Descoberta natural do produto com filtração da fragmentação diagnóstica de LC-MS/MS: aplicação para a análise do Microcystin

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Os produtos naturais são muitas vezes biossintéticos como uma classe de compostos, e não como um único produto. A filtragem de fragmentação diagnóstica é uma abordagem simples para detectar todos os compostos relacionados estruturalmente dentro de uma mistura complexa. A filtragem de fragmentação diagnóstica, implementada dentro do software MZmine, permite ao analista explorar conjuntos de dados de espectrometria em massa para novos produtos naturais que de outra forma seriam perdidos.Isso inclui novos bioprodutos, e também novas toxinas. A filtragem de fragmentação diagnóstica, aplicada a classes de toxinas que contaminam alimentos e água, pode informar avaliações de exposição. Quando aplicado a extratos microbianos e vegetais, pode resultar na descoberta de novos compostos.O uso da filtragem de fragmentação diagnóstica requer uma compreensão das principais características de espectrometria de massa tandem que definem uma classe química. Isso significa que compostos estruturalmente semelhantes gerarão íons característicos. Meu nome é Shawn Hoogstra.Sou técnico de pesquisa e desenvolvedor de software em nosso centro, e vou demonstrar o procedimento. Para preparar uma amostra para análise de microcistina, inocular 30 mililitros de cianobactérias estéreis de crescimento de cianobactérias para aproximadamente cinco vezes 10-10-o-quinto células por mililitro, sob condições assépticas, em frascos erlenmeyer de 250 mililitros, monitorando a densidade celular com um hemocitometro. Após 26 dias de cultura fotoautotrófica, iluminada com luz fluorescente branca fria usando um regime claro-escuro de 12 horas a 27 graus Celsius, com redemoinho uma vez por dia, use papéis de filtro de microfibra de vidro GF/C de 47 mililitros de diâmetro para separar as células do meio de cultura por filtragem de vácuo.Adicione três mililitros de 80% de metanol às células colhidas em tubos de ensaio de 14 mililitros, e vórtice e, posteriormente, sonicar cada tubo por 30 segundos. Após a sônicação,lise as amostras com três congelamentos consecutivos de uma hora, menos-20 graus Celsius e ciclos de degelo de temperatura ambiente de 15 minutos, e filtrar cada extrato celular de cianobactéria resultante através de filtros de seringa de politefluoroetileno individuais de 0,22 micrômetros. Usando um fluxo suave de gás nitrogênio, seque os extratos com um evaporador a 30 graus Celsius, e armazene os extratos secos a menos 20 graus Celsius.Para análise de espectrometria de massa cromatografia líquida, reconstitua o resíduo seco a ser analisado com 500 microliters de 90% de metanol e vórtice das amostras por 30 segundos. Transfira para um frasco de cromatografia líquida de alta pressão âmbar. Em seguida, analise o extrato de cianobactéria usando um método de aquisição dependente de dados em um espectrômetro de massa de alta resolução de acordo com os protocolos padrão.A maioria das microcistinas contém um resíduo ATA que produz dois íons de produto diagnóstico em espectrometria de massa em conjunto, M a Z 135,0803 e 163.1114. Para a preparação do conjunto de dados de espectrometria de massa de cromatografia líquida não-direcionada, abra o MZmine 2 e selecione a importação de dados raw"sob os métodos de dados raw"menu suspenso. Em seguida, selecione os arquivos de dados a partir da análise de microcistina e selecione o filtro de captação de pico para aplicar um algoritmo de centroiding fornecido pelo fornecedor.Para filtrar a fragmentação diagnóstica, ou DFF, dos arquivos de aquisição dependentes de dados importados, use o cursor para destacar os arquivos de dados e abra o menu suspenso da Visualização para selecionar a opção DFF. Na caixa de diálogo DFF que aparece, insira a faixa de tempos e minutos de retenção quando a classe alvo de analitos se elute, e para encontrar a faixa de relação massa-carga da classe alvo de analitos, incluindo a possibilidade de múltiplos compostos carregados quando apropriado. Insira a precisão de massa tandem alcançável do instrumento de espectrometria de massa e insira os íons de produtos específicos da classe da relação massa-carga.Insira as perdas neutras específicas da classe e defina a intensidade mínima para íons de produtos diagnósticos e/ou perdas neutras a serem consideradas como uma porcentagem do pico base do espectrometria de massa tandem. Em seguida, selecione um nome de caminho e arquivo para produzir os resultados e clique em OK"para iniciar o DFF. Um gráfico DFF aparecerá após uma conclusão bem sucedida da configuração.O analista deve interpretar espectros em massa de compostos conhecidos dentro de uma classe composta para identificar os íons do produto e/ou perdas neutras que são diagnósticas para toda a classe de compostos. Este lote DFF foi gerado após a análise do M.aeruginosa CPCC 300. O eixo x representa essa relação massa-carga dos íons precursores que satisfizeram os critérios de DFF definidos, enquanto o eixo y mostra a razão massa-carga de todos os íons do produto dentro do espectrometria de massa microcystinas tandem.Para esta análise, os critérios para detecção de microcistina incluíram íons precursores na relação massa-carga de 400 a 1.200 e tempos de retenção entre dois a seis minutos. Mais importante, estes espectrometria de massa tandem continham ambas as relações de massa-carga acima do limiar de intensidade de pico definido de 15%. Dos 4.116 espectrometria de massa adquiridas durante a análise, 26 satisfizeram os critérios de DFF e foram detectados no extrato M.aeruginosa CPCC 300.As principais microcistinas detectadas podem ser atribuídas com confiança como microcistina leucina arginina e microcistina ácido aspartatosinasina arginina. À medida que novos compostos são descobertos usando filtragem de fragmentação diagnóstica, os organismos podem ser cultivados em larga escala para isolamento e caracterização dos compostos por RMN. Quando aplicada a microcistinas, a filtragem de fragmentação diagnóstica nos permite determinar se os métodos tradicionais de triagem direcionada estão detectando as principais toxinas presentes dentro de uma amostra.

natural-product-discovery-with-lc-msms-diagnostic-fragmentation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Considerando coleta de saliva para uma futura aplicação clínica, um pirulito, como ultrafiltração sonda (LLUF) foi fabricada para caber na cavidade bucal humana. Análise directa da saliva não digerido por espectrometria de massa nanoLC-LTQ demonstraram a capacidade das sondas de LLUF para remover as proteínas grandes e proteínas de abundância elevadas, e fazer de baixa abundantes péptidos mais detectável.

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Descoberta natural do produto com filtração da fragmentação diagnóstica de LC-MS/MS: aplicação para a análise do Microcystin

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