In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

O principal objetivo deste protocolo é usar o poder da genética avançada para identificar genes que quando desregulados levam à neurodegeneração. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma abordagem imparcial e direta para a identificação de genes neuroprotetores que podem ser mais difíceis de realizar em modelos mamíferos. Essa técnica pode ser usada para identificar novos genes implicados no processo de neurodegeneração que está associado a muitas doenças, como Alzheimer e Mal de Parkinson.

Além de identificar genes neuroprotetores, a abordagem genética avançada pode ser usada para descobrir genes envolvidos em outros processos biológicos, como função neuronal e transmissão. Para começar, colete moscas homozigos de linhas pertencentes à coleção mutagenizada da ENU de mutantes Drosophila mapeados para o segundo cromossomo. Vire as moscas de 10 a 12 dias em uma câmara de testes sem anestesia uma linha de cada vez e permita que elas se recuperem por cinco minutos.

Com a marca de linha de cinco centímetros lado para baixo, bata à força na câmara três vezes em um mouse pad colocado em uma superfície sólida para que todas as moscas comecem o ensaio na parte inferior. Observe a locomoção de moscas durante um período de 10 segundos. Regissei o número de moscas que atingem ou passam da linha de cinco centímetros dentro deste tempo, bem como o número total de moscas testadas.

Espere um minuto antes de começar um segundo julgamento. Repita um mínimo de três réplicas de ensaio por linha. Depois de anestesiar as moscas em uma almofada de dióxido de carbono, corte cabeças de mosca com uma lâmina cirúrgica e use um pincel para colocá-las suavemente em um mililitro da fixação de Carnoy em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, armazene o tubo a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, certifique-se de que as cabeças estão afundadas na solução fixa. Sob um capô de fumaça, use uma pipeta P1000 para substituir a solução fixa por um mililitro de 70% de etanol e manter as amostras a quatro graus Celsius para análise futura.

Usando uma pipeta Pasteur, transfira as cabeças fixas em fitas de microbiopsia e feche as fitas. Envie as fitas para uma instalação de histologia para processamento ou coloque-as em uma máquina de processamento de tecidos automatizada, se disponível no local. Execute o programa para desidratar, limpar e infiltrar as cabeças com parafina.

Em seguida, transfira as fitas para uma estação de incorporação de parafina com parafina aquecida a 60 graus Celsius e coloque moldes de base metálica que se encaixam nas fitas na estação aquecida. Use fórceps finos para orientar as cabeças de tal forma que elas enfrentem o topo no molde base. A orientação adequada da cabeça é fundamental para a análise de histologia.

Após o endurecimento, corte cada bloco de parafina para minimizar a superfície que será seccionada. Corte cinco seções de micrômetros de cada bloco no microtoma. Em seguida, coloque as fitas de parafina seccionadas em um banho de água aquecida a 35 graus Celsius por um máximo de cinco minutos.

Mergulhe um escorregador revestido de polilise no banho de água aquecida e use um aplicador de madeira para colocar as fitas seccionadas no escorregador. Deixe o ar deslizar durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, use um aquecedor de slides para aquecer os slides por 15 minutos a 63 graus Celsius.

Sob um capô de fumaça, coloque os slides em um rack de manchas de slides e coloque o rack em HistoChoice por cinco minutos duas vezes seguido por vários tratamentos de etanol e banho de água destilado de acordo com o manuscrito. Transfira o rack para um recipiente cheio de Hematoxilina Harris por dois a cinco minutos para colorir. Em seguida, tire o rack da solução de Hematoxilina e coloque-o sob água da torneira por 10 minutos antes das seguintes etapas de coloração.

Após a coloração, usando fórceps, tire os slides da solução HistoChoice ou Xileno. Goteque uma fina camada de meio de montagem permanente na amostra e coloque delicadamente uma mancha de cobertura na parte superior. Evite a formação de bolhas.

Depois que o meio de montagem for endurecido, coloque o slide sob um microscópio leve para obter imagens de seções cerebrais representativas em aproximadamente midbrain. Primeiro, prepare um frasco contendo frasco para gerar moscas fêmeas heterozigous. Após anestesia de dióxido de carbono, use um pincel para transferir cinco machos da linha mutante e 10 fêmeas virgens do lobo estarnopleural preso e fixar sobre a linha Curly O no frasco para fazer uma cruz.

Coloque o frasco a 25 graus Celsius. Após 10 a 12 dias, colete pelo menos 15 progêneras virgens carregando o cromossomo mutante e o cromossomo marcador. Cruze-os para cinco machos de uma linha equilibrada que carrega outro marcador dominante visível Curly O sobre scutóide ou equivalente.

Após 10 a 12 dias, colete a prole heterozigosa masculina carregando scutóide ou Curly O e o cromossomo potencialmente recombinado da cruz. Acasalá-las individualmente para fêmeas virgens do estoque carregando o cromossomo mutante. Dez a 12 dias depois, recolha a prole da última cruz em novos alimentos contendo frascos e envelhece as moscas a 29 graus Celsius a 10 a 14 dias.

Faça histologia em cabeças de mosca e repita para prole de cada cruz individual. Com essas informações, realize o mapeamento de deficiências na região estreita do cromossomo para refinar a localização da mutação recessiva. Cada linha de deficiência tem uma exclusão de diferentes regiões dos cromossomos permitindo que eles sejam usados para testes de complementação.

Em seguida, cruzam as linhas do kit de deficiência de Drosophila para o segundo cromossomo e buscam a não complementação do fenótipo do interesse. Para obter referência para análise de sequência de DNA, baixe um arquivo em formato FASTA contendo a sequência de consenso genômico do gene BRAT da FlyBase ou use um arquivo contendo resultados para sequência BRAT de um controle de fundo genético, por exemplo, a linha Dphiloa originalmente mutagenizada. Abra arquivos de sequenciamento no Editor A Plasmid.

Vá para Editar e clique em Alinhar sequências. Usando o mouse do computador, selecione todas as sequências para comparar. No menu de queda, indique a sequência de referência para este alinhamento.

Inspecione a região sequenciada para obter alterações de nucleotídeos em comparação com a sequência de referência. Se desejar, salve o alinhamento em um computador no formato RTF clicando em Texto e salvar. Realize o experimento de resgate coletando descendentes de F1 de cada cruz.

Selecione cuidadosamente os balanceadores marcados. Idade as moscas em médium de alimentos Drosophila a 29 graus Celsius e realizar análises histologia em cérebros para procurar neurodegeneração como anteriormente. Para realizar a análise dependente da idade da neurodegeneração em 867 mutantes, a idade das moscas para cinco, 15 e 25 dias e realizar a análise histologia subsequente.

Este protocolo apresenta uma abordagem genética avançada para a tela através de uma coleção de moscas quimicamente mutagenizadas usando um ensaio de escalada. Entre 235 linhas homozigosas, cerca de 37% das linhas testadas apresentaram taxa de passagem de escalada abaixo de 50% quando testadas aos 10 a 12 dias. A tela histológica subsequente em 51 das linhas que exibem a menor taxa de passagem de escalada revelou que 29 dessas linhas mostraram aparência visível de buracos no neuropilação cerebral variando de leve a grave indicativo de neurodegeneração.

O fenótipo de neurodegeneração em 867 moscas é recessivo porque os cérebros de 867 moscas heterozidas que foram ultrapassadas a uma cepa selvagem eram comparáveis aos dos controles. A linha de deficiência Df24116 não complementa o fenótipo mutante 867 baseado no ensaio de escalada. A verificação histológica mostra que a linha de deficiência Df24116 não complementa o fenótipo de neurodegeneração 867, enquanto o Df9296.

Examinando o fenótipo cerebral de 867 mutantes cruzados com linhas de deficiência adicionais confirmou que a mutação está contida na região do genoma que inclui o gene BRAT. É importante lembrar durante este procedimento trabalhar da forma mais rigorosa e precisa possível, pois este protocolo combina várias etapas que se executadas de forma inadequada podem afetar a identificação de mutantes com neurodegeneração em genes candidatos. Dependendo dos genes identificados, a análise subsequente pode incluir testar ovulos adicionais do gene do interesse ou interações com genes que desempenham um papel em vias conhecidas da neurodegeneração.

Durante o procedimento de histologia, lembre-se de lidar com a solução fixa do Carnoy com cautela, pois contém clorofórmio. Use luvas e use com ventilação adequada idealmente sob o capô de fumaça. Da mesma forma, realize toda a mancha de histologia sob o capô da fumaça.