Name: Desenvolvimento do direcionamento de lesões locais induzidas em populações de genomas (lavoura) em pequenas culturas de grãos por metilo Methanesulfonate mutagenesis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda a desenvolver populações TILLING robustas com alta frequência de mutação em cereais de grãos pequenos usando mutagênese por EMS. Este método facilita a descoberta de genes e genômica funcional.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo USDA Instituto Nacional de alimentos e agricultura, Hatch projeto 1016879 e Maryland agricultural Experiment Station via MAES Grant no. 2956952.

1. preparação da curva de dosagem para mutagenese efetiva
<ol><li>Mergulhe 100 sementes com o genótipo de interesse em frascos de vidro de 6 250 mL (100 em cada frasco) contendo 50 mL de água destilada. Agitar a 100 RPM por 8 h à temperatura ambiente (RT) para embebição pelas sementes.</li>
	<li>Em uma capa de fumaça, prepare 50 mL de 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, e 1,2% (p/v) solução de metanesulfonato de etilo (EMS) dissolvendo 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 e 0,498 mL de EMS em água destilada, respectivamente. Nota: o EMS é líquido em RT com uma densidade de 1,206 g/mL. PRECAUÇÃO: utilize o equipamento de protecção individual (EPI) adequado durante o manuseamento do EMS.</li>
	<li>Decantar a água de cinco frascos e adicionar 50 mL de solução de EMS em cada frasco contendo sementes embebiadas para que existam seis tratamentos diferentes com 0,0%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, e 1,2% solução de EMS. Agitar garrafas para 16 h em 75 rpm e RT.</li>
	<li>Decantar a solução EMS e recolher as sementes tratadas separadamente para cada tratamento usando pano de queijo. Inactivate a solução usada do EMS adicionando um volume de EMS-inativando a solução (NaOH de 0,1 M, 20% w/v na2S2O3) para 24 h. Também tratar as garrafas contaminadas e pontas de pipeta com a solução de inactivação de EMS para 24 h.</li>
	<li>Lave as sementes tratadas com EMS água corrente da torneira durante 2 h. transplante cada semente individualmente em formadores de raiz contendo solo de potting.</li>
	<li>Cresça plantas em 20-25 ° c um período de luz de 16 h.</li>
	<li>Registre dados sobre a sobrevivência da planta após 15 dias do transplante. Use a seguinte equação para calcular a taxa de sobrevida para cada tratamento: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59743/59743eq1.jpg"> Nota: se a taxa de germinação for inferior a 100% nos controles, as taxas de sobrevida exatas em todos os tratamentos devem ser calculadas após subtrair o número de sementes que não germinaram nos controles. Uma taxa de sobrevivência de 40% – 60% é desejável para A mutagenese eficaz. Pode ser necessário realizar uma segunda rodada de otimização da dosagem com uma concentração modificada de acordo com a sobrevida das sementes tratadas até atingir a taxa de letalidade desejável de 40% – 60%.</li>
</ol>2. mutagenese e manutenção da população mutante
<ol><li>Mergulhe o lote final de pelo menos 3.000 sementes dividindo igualmente (600 sementes cada) em frascos de 5 1.000 mL contendo 300 mL de água destilada. Agitar por 8 h a 100 RPM RT para embebição. Nota: o tamanho final da população desejável dependerá da frequência de mutação e do nível de ploidia do genótipo, mas é aconselhável usar pelo menos 3.000 sementes para hexaploides, 4.000 sementes para tetraploides, e mais de 7.000 sementes para diploides.</li>
	<li>Em uma capa de fumaça, prepare 1.500 mL da solução de concentração de EMS otimizada em água destilada.</li>
	<li>Decantar a água fora dos frascos e adicionar 300 ml da concentração óptima da solução do EMS em cada frasco que contem 600 sementes embebidas. Agitar os frascos para 16 h em 75 rpm e RT.</li>
	<li>Decantar o EMS e recolher as sementes tratadas em pano de queijo. Inative os recipientes da solução e do tratamento do EMS com a solução do EMS-inativando como feito na etapa 1,4.</li>
	<li>Lave as sementes tratadas com EMS água corrente de torneira para 2 h. transplante cada EMS-Tratado M1 semente individualmente em formadores de raiz.</li>
	<li>Cresça M1 plantas (derivadas de sementes de m0 ) em 20-25 ° c um período de luz de 16 h. Nota: pode ser necessário vernalizar as mudas no estágio de duas folhas por 6 semanas a 4 ° c, se o genótipo de interesse tiver um hábito de crescimento do tipo inverno.</li>
	<li>Permita que as plantas M1 se autopolinizam e colha as sementes de m2 separadamente para cada planta férteis m1 . Nota: para evitar chances de possível ultrapassamento, cubra os picos de M1 plantas com sacos de polinização antes da antese.</li>
	<li>Plante uma única semente de M2 de cada planta de m1 para evitar a redundância genética.</li>
	<li>Colete o tecido das plantas de M2 no estágio da dois-folha em 1,1 ml de microtubes acumulou do poço 96. Colete cerca de 80 mm de tecido foliar de cada planta e registre o ID de cada amostra em um plano de coleta de tecido.</li>
	<li>Congelar-secar o tecido foliar usando um liofilizado e armazenar em-80 ° c.</li>
	<li>Manter as plantas M2 a 20 – 25 ° c um período de luz de 16 h.</li>
	<li>Registre dados em fenótipos mutantes das plantas M2 em intervalos regulares. Os fenótipos esperados são Albino, Chlorina, gramíneo, variegated, parcialmente fértil, estéril, etc.</li>
	<li>Permita que as plantas de M2 autofertilize e amadureça. Colher e conservar separadamente as sementes m3 das plantas M2 (Figura 1). Nota: as sementes de M são usadas Validando o phenotype em estudos reversos da genética. Portanto, M deve ser cuidadosamente catalogado e armazenado em condições frias e secas. Alternativamente, se a semente deve ser aumentada no campo, as fileiras da cabeça podem ser plantadas para cada planta de M, e as sementes de M de cada fileira podem ser colhidas e conservadas separada como o recurso da população de TILLING.</li>
</ol>3. ensaio cel-1 para caracterização genética de mutantes
<ol><li>Extraia o DNA do tecido foliar de M2 usando um kit de extração de DNA vegetal com um sistema de purificação de DNA (ver tabela de materiais) seguindo as recomendações do fabricante.</li>
	<li>Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro e normalizar as concentrações de DNA para 25 ng/μl com água livre de nuclease em 96 blocos de poços. Nota: é importante verificar a qualidade do DNA, executando-o em um gel, como DNA de baixa qualidade (DNA manchado) pode resultar em falsos negativos em amostras agrupadas.</li>
	<li>Crie pools de DNA 4x combinando DNA de 4 96 blocos de poços em uma placa, mantendo a identidade de linha e coluna de cada amostra. Adicionar 50 μL de ADN de cada amostra individual na placa de associação, de modo a que cada placa de piscina contenha um total de 200 μL de ADN de quatro blocos diferentes de 96 poços.</li>
	<li>Catalogar a identidade do DNA agrupada no formato de pool Plate-Row-Column (por exemplo, pool 1 a1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1).</li>
	<li>Projete primers específicos do genoma [a1] para o gene de interesse usando a página de primers específicos do genoma (GSP) &lt; https://probes.pw.usda.gov/GSP &gt; com as configurações padrão para espécies poliploides. Para diploids, use primer 3 &lt; http://Primer3.UT.ee/&gt; para projetar iniciadores usando as configurações padrão. Projete vários primers, se necessário, para cobrir toda a região codificadora do gene de interesse. Nota: o último conjunto de IWGSC pode ser usado para obter sequências para o gene de interesse em trigo usando a ferramenta URGI BLAST &lt; https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST &gt;. O comprimento ideal do amplicon está na escala de 800 – 1500 BP. a tabela 1 mostra exemplos dos primers para genes waxy no trigo hexaplóide.</li>
	<li>Execute um PCR para primers gene-specific no ADN agrupada como segue:<ol>
<li>Adicionar 5 μL de tampão PCR, 2 μL (cada) de 4 μM de primers para a frente e reverso, 0,1 μL de DNA polimerase (ver tabela de materiais), 5 μL de modelo de DNA agrupado e, em seguida, aumentar o volume para 25 μL utilizando água sem nuclease.</li>
		<li>Utilize um perfil de toque para baixo para executar a reacção de PCR num termociclador da seguinte forma: 95 ° c durante 1 min, sete ciclos de 95 ° c durante 1 min, 67 ° c a 60 ° c durante 1 min com diminuições de temperatura de 1 ° c por ciclo e 72 ° c durante 2 min , seguido de 30 ciclos de 95 ° c por 1 min, 60 ° c por 1 min, 72 ° c por 2 min e extensão final a 72 ° c por 7 min. Nota: acima do perfil do PCR trabalha no molde do ADN do trigo para a maioria dos primers projetados usando a primeira demão 3 ajustes do defeito. Em caso de amplificação não específica, o perfil de PCR deve ser rigoroso antes de passar para as próximas etapas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gere heteroduplexes entre o ADN incompatível incubando produtos do PCR no Thermal cycler usando o perfil como segue: 95 ° c para 2 minutos, cinco ciclos de 95 ° c para 1 s, 95 ° c a 85 ° c por 1 minuto com diminuições da temperatura de 2 ° c por o ciclo, e 60 ciclos de 85 ° c a 25 ° c com diminuições de 1 ° c por ciclo.</li>
	<li>Adicionar 2,5 μL de endonuclease cel-1 caseira aos produtos de PCR heteroduplexados e incubar por 45 min a 45 ° c. Termine a reacção cel-1 adicionando 2,5 μL de 0,5 M de EDTA (pH 8,0). Nota: a endonuclease cel-1 pode ser extraída de hastes de aipo frescas utilizando o protocolo realizado por Till et al.19 é muito importante testar a atividade e a quantidade óptima de endonuclease cel-1, que pode ser testada usando mutantes previamente caracterizados ou um kit de detecção de mutação disponível comercialmente.</li>
	<li>Executar o Cel-1 produtos tratados em um gel de agarose 3,0% em 100 V para 2,5 h. Os poços que contêm a faixa (s) clivada menor e original, além do que faixas uncleaved full-length, conterá a amostra do ADN do mutante.</li>
	<li>Piscinas mutantes denconvolute.<ol>
<li>Siga as etapas 3,6, 3,7, 3,8 e 3,9 para amostras de DNA individuais de M2 que constituem as piscinas mutantes identificadas na etapa 3,9.</li>
		<li>Para determinar o zigoticidade dos mutantes, funcione dois PCR (como descrito na etapa 3,6) para o ADN individual de m2 , em que a primeira reação contem 2,5 μl do ADN de m2 e do μl 2,5 do selvagem-tipo ADN e a segunda reação contem somente 5 μl do ADN de m2 . Se a mutação é heterozygous, uma faixa clivada adicional estará atual em ambas as reações. Por outro lado, bandas clivadas adicionais só serão encontradas na primeira reação se o mutante for homozygous.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para identificar a natureza da mutação, sequencia os produtos de PCR dos mutantes confirmados usando uma plataforma de sequenciamento de Sanger seguindo as instruções do fabricante.</li>
</ol>4. cálculo da frequência de mutação
Nota: a frequência de mutação de uma população de TILLING refere-se à distância física média em que ocorre uma mutação nos indivíduos dessa população. Por exemplo, uma frequência de mutação de 1/35 KB em uma população de TILLING significa que um indivíduo médio dessa população possui 1 mutação por cada 35 KB no genoma.
<ol><li>Para determinar a frequência de mutação de uma população de TILLING, calcule o número total de bases rastreadas.</li>
	<li>Para calcular o número total de bases rastreadas, multiplique o tamanho do produto PCR pelo número total de indivíduos rastreados.</li>
	<li>Divida o número total de bases rastreadas pelo número de mutações únicas observadas usando a seguinte equação, que produzirá a região física possuindo 1 mutação na população de TILLING dada: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59743/59743eq2.jpg"> Nota: para dar conta da limitação na resolução de 50 BP em ambas as extremidades com base em uma plataforma baseada em gel de agarose, subtrair 100 BP do tamanho do produto no cálculo.</li>
</ol>

<ol><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+screening+for+induced+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li>
<li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li>
<li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations%3A+TILLING+by+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li>
<li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+%28Hordeum+vulgare+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li>
<li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+%28+SBEII+%29+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Science%22%5BJournal%5D)">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li>
<li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205(2012).</li>
<li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILL-D%3A+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li>
<li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li>
<li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li>
<li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li>
<li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li>
<li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li>
<li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115(2009).</li>
<li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li>
<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li>
<li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268(2017).</li>
<li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Genome%22%5BJournal%5D)">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li>
<li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li>
<li>Wu, J. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li>
<li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li>
<li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li>
<li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li>
<li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tilling+by+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Functional+Genomics%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

O TILLING é uma ferramenta de genética reversa altamente valiosa para validação de genes, especialmente para pequenos grãos, onde abordagens baseadas em transformação têm gargalos sérios11. Desenvolver uma população mutagenized com uma freqüência elevada da mutação é uma das etapas críticas em conduzir estudos funcionais da genômica. A etapa a mais importante em desenvolver uma população robusta do TILLING é determinar a concentração óptima de EMS. A taxa de sobrevida de 40%-60% no M1 f...

As mutações pontuais nos genomas podem servir a muitos propósitos úteis para os pesquisadores. Dependendo de sua natureza e localização, essas mutações podem ser usadas para atribuir funções a genes ou até mesmo domínios distintos de proteínas de interesse. Por outro lado, como fonte de nova variação genética, mutações úteis podem ser selecionadas para as características desejadas usando telas de fenotipagem e mais utilizadas na melhora da cultura. O TILLING é uma poderosa ferramenta de genética reversa que inclui mutagenese química e detecção de variação de seqüência no gene alvo. Desenvolvido pela primeira vez em Arabidopsis1 e Drosophilia melanogaster2, as populações de lavoura foram desenvolvidas e utilizadas em muitas culturas de grãos pequenos, como o trigo de pão hexapóide (Triticum aestivum)3, cevada (Hordeum vulgare)4, trigo duro tetrapóide (t. usambarense duro)5, trigo diploide (t. monococcum)6 e o progenitor do genoma "D" do trigo Aegilops tauschii7 . Esses recursos têm sido utilizados para validar os papéis dos genes na regulação da tolerância ao estresse abiótico e biótico8, regulando o tempo de floração9e desenvolvendo variedades de culturas nutricionalmente superiores5.
O cultivo, juntamente com o uso de agentes mutagênicos alquilantes, como o metilo metanesulfonato (EMS), azida sódica, N-metil-N-nitrosourea (MNU) e metanesulfonato de metilo (MMS), tem vantagens sobre outras ferramentas de genética reversa por várias razões. Em primeiro lugar, a mutagenese pode ser conduzida em praticamente qualquer espécie ou variedade de plantas10 e é independente do gargalo de transformação, o que é particularmente desafiador no caso de pequenos grãos11. Em segundo lugar, além de gerar mutações Knockout que podem ser obtidas por outras abordagens de validação genética, uma gama de mutações missense e splicing pode ser induzida, o que pode discernir funções de domínios individuais das proteínas de interesse12. Além disso, o TILLING gera uma coleção imortal de mutações em todo o genoma; assim, uma única população pode ser usada para a validação funcional de genes múltiplos. Em contrapartida, outras ferramentas de genética reversa geram recursos específicos apenas para o gene em estudo13. Mutações úteis identificadas através do TILLING podem ser implantadas para fins de reprodução e não estão sujeitas à regulação, diferentemente da edição gênica, cuja classificação não transgênica ainda é incerta em muitos países. Isso se torna especialmente relevante para pequenos grãos que são negociados internacionalmente14.
O TILLING é uma estratégia de validação genética simples e eficiente e requer que populações mutagenizadas sejam desenvolvidas para investigar genes de interesse. O desenvolvimento de uma população mutagenizada efetiva é fundamental para determinar a eficiência de um estudo de validação de genes baseado em TILLING. Uma população de tilling com uma baixa freqüência total da mutação indica que uma população impraticamente grande deve ser selecionada para mutações desejadas, visto que uma concentração alta do mutagênico conduz à mortalidade elevada na população e a um número insuficiente de indivíduos mutagenizados. Uma vez que uma boa população é desenvolvida, existem várias maneiras de detectar mutações nos genes de interesse, e a escolha da plataforma depende da escala experimental e da disponibilidade de recursos. O sequenciamento do genoma completo e o sequenciamento do exoma têm sido utilizados para caracterizar todas as mutações em populações de lavantes em plantas com pequenos genomas15,16. O sequenciamento de exome de duas populações de TILLING tem sido realizado em pão e trigo duro e está disponível ao público para identificar mutações desejáveis e ordenar linhas mutantes de interesse17. É um grande recurso público em termos de disponibilidade de mutações desejáveis; Entretanto, em estudos da validação do gene, a linha do selvagem-tipo deve possuir o gene do candidato do interesse. Infelizmente, ainda é custo-proibitivo para sequenciar o exoma de toda a população de TILLING para validação reversa baseada em genética de alguns genes candidatos em outro fundo. O sequenciamento de amplicon e os ensaios baseados em cel-1 têm sido usados na detecção de mutações em populações direcionadas em trigo, e os ensaios cel-1 são mais simples, não exigindo nenhum conhecimento computacional e são especialmente adequados para a validação de um pequeno número de genes com equipamento de laboratório6,18.
No presente artigo, descrevem-se métodos para o desenvolvimento de uma boa população de TILLING, incluindo a preparação da curva de dosagem, mutagenese e manutenção da população mutante, e triagem da população mutante usando o ensaio cel-1 baseado em PCR . Este protocolo já foi implementado com sucesso no desenvolvimento e utilização de populações mutagenizadas de Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, cevada, Aegilops tauchii7e várias Outros. Incluídos são detalhes explícitos destes métodos, juntamente com dicas úteis que ajudarão os pesquisadores a desenvolver populações de TILLING, usando EMS como um mutagênico em qualquer planta de grãos de pequeno porte de escolha.

<table><tbody><tr><td>96 microtubos de 1,1 ml de poços em microracks</td><td>National Scientific</td><td>TN0946-08R</td><td>Para a recolha de tecidos foliares</td></tr><tr><td>Agarose I grau biotecnológico</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>Biosprint 96 Kit de plantas de ADN</td> Kit <td>de 941558</td><td>Qiagen</td><td>para extracção de ADN</td></tr><tr><td>Endonuclease Cel-1</td><td>Extraído conforme descrito por Till et al 2006</td><td></td><td>Endonuclease específica de fita simples</td></tr><tr><td>Centrífuga 5430</td><td>R Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etil metanossulfonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-0880-25G</td><td>EMS, mutagênico químico</td></tr><tr><td>Sistema de congelamento Freeze Dry / Shell</td><td>Labconco</td><td></td><td>Para liofilização de tecido foliar Sistema de</td></tr><tr><td>purificação Kingfisher Flex</td><td>Thermo fisher científico</td><td>5400610</td><td>Robô de extração de DNA de alto rendimento</td></tr><tr><td>My Taq DNA Polimerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Sigma aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel NuGenius</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbit Environ-shaker</td><td>Lab-line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPECTROstar</td><td>Nano BMG LABTECH</td><td></td><td>Nano drop para quantificação de DNA</td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BIO-RAD</td><td>1861096</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento do direcionamento de lesões locais induzidas em populações de genomas (lavoura) em pequenas culturas de grãos por metilo methanesulfonate mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

O direcionamento de lesões locais induzidas em genomas (TILLING) é uma poderosa ferramenta de genética reversa que inclui mutagenese química e detecção de variação de seqüência em genes alvo. O TILLING é uma ferramenta de genômica funcional altamente valiosa para validação genética, especialmente em pequenos grãos em que abordagens baseadas em transformação possuem sérias limitações. O desenvolvimento de uma população mutagenizada robusta é fundamental para determinar a eficiência de um estudo de validação de genes baseado em TILLING. Uma população de tilling com uma baixa freqüência geral da mutação indica que uma população impraticamente grande deve ser selecionada para encontrar mutações desejadas, visto que uma concentração alta do mutagênico conduz à mortalidade elevada na população, conduzindo a um insuficiente número de indivíduos mutagenizados. Uma vez que uma população efetiva é desenvolvida, existem várias maneiras de detectar mutações em um gene de interesse, e a escolha da plataforma depende da escala experimental e da disponibilidade de recursos. O ensaio de cel-1 e a aproximação gel-baseada do agarose para a identificação do mutante são convenientes, reprodutíveis, e uma plataforma menos recurso-intensiva. É vantajoso que seja simples, não exigindo nenhum conhecimento computacional, e é especialmente adequado para a validação de um pequeno número de genes com equipamento de laboratório básico. No presente artigo, descrevem-se os métodos para o desenvolvimento de uma boa população de TILLING, incluindo a preparação da curva de dosagem, mutagenese e manutenção da população mutante, e triagem da população mutante usando o ensaio cel-1 baseado em PCR .

A Figura 2 mostra a curva de dosagem do trigo hexapóide cultivar Jagger, trigo diploide Triticum Monococcum6, e um doador de genoma de Aegilops de trigo tauschii7. As doses de EMS para as taxas de sobrevida desejadas de 50% foram de cerca de 0,25%, 0,6% e 0,7% para t. monococcum, ae. tauschiie t. aestivum, respectivamente. A maior tolerância do EMS do trigo hexaplóide...

Descrito é um protocolo para o desenvolvimento de uma população de lesões locais induzidas em genomas (TILLING) em culturas de grãos pequenos com uso de metilo metanesulfonato (EMS) como um mutagênico. Também é fornecido um protocolo para detecção de mutação usando o ensaio cel-1.

Desenvolvimento do direcionamento de lesões locais induzidas em populações de genomas (lavoura) em pequenas culturas de grãos por metilo Methanesulfonate mutagenesis

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Este protocolo detalha o desenvolvimento de populações robustas de TILLING com alta frequência de mutação pela MUTAGÊNESE EMS em pequenas culturas de grãos. Populações de lavoura podem ser usadas para genômica funcional, bem como para a descoberta de genes do espaço genético avançado em pequenas culturas de grãos. As populações tilling desenvolvidas usando essa técnica têm altas frequências de mutação, e este protocolo pode ser aplicado a qualquer genótipo.A detecção de mutação baseada em ensaio Cel-1 pode ser conduzida usando equipamentos básicos de laboratório. O passo mais importante é determinar a concentração ótima do EMS. Portanto, uma curva de dosagem emS deve ser feita especificamente para a população individual.Para começar, mergulhe 100 sementes com o genótipo de interesse em cada um dos seis frascos de vidro de 250 mililitros, contendo 50 mililitros de água destilada. Agite a 100 RPM por oito horas em temperatura ambiente para imbibição. Em seguida, em um capô de fumaça, prepare 50 mililitros de soluções EMS de cinco concentrações diferentes misturando líquido EMS e água destilada.Após a imbibição, decante a água de cinco frascos. Adicione 50 mililitros de solução EMS em cada um dos cinco frascos contendo sementes absorvidas. Agite os frascos por 16 horas a 75 RPM e temperatura ambiente.Agora, decante a solução EMS em uma garrafa de lixo vazia e despeje as sementes tratadas em pano de queijo colocado em uma garrafa de lixo vazia para coletar separadamente para cada tratamento. Use água extra para ajudar no derramamento das sementes. Além disso, pulverizar vários mililitros de solução inativante em EMS na parede de frascos contaminados.E mergulhe as pontas de pipeta usadas na solução por 24 horas. Inativo a solução EMS usada adicionando um volume de solução de ativação EMS para tratar por 24 horas. Usando uma gravata de torção, segure as sementes tratadas em EMS dentro da toalha de queijo e lave sob água da torneira por duas horas.Após a lavagem, transplante cada semente individualmente em treinadores radiculares contendo solo em vasos. Cultivar plantas a 20 a 25 graus Celsius por um período de luz de 16 horas. Após 15 dias de transplante, verifique as plantas e conte o número de sementes que não conseguiram germinar.Dados recordes de sobrevivência vegetal. Se a taxa de sobrevivência não estiver dentro de 40 a 60% realizar uma segunda rodada de otimização de dosagem com uma concentração modificada até atingir a taxa de letalidade desejada de 40 a 60% Após o experimento mutagênese, colete o tecido da folha das plantas M2 em uma caixa de coleta de tecido de 96 poços. O tecido é coletado de plantas M2 que foram cultivadas a partir de plantas M1 autoecoladas.Uma planta M2 é mostrada de cada planta M1. Extrair DNA usando um kit de extração de DNA vegetal com um sistema de purificação de DNA seguindo as recomendações do fabricante. Em seguida, carregue dois microliters do extrato de DNA em placas de LV com 16 ranhuras.Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro em comprimentos de onda de 260 e 280 nanômetros. Diluir a concentração de DNA para 25 nanogramas por microliter com água livre de nuclease. Crie quatro vezes piscinas de DNA de 200 microliters combinando o DNA de cada poço nos quatro blocos de poço 96 em uma placa de piscina, mantendo a identidade da linha e coluna de cada amostra.Em seguida, prepare um tubo de mistura mestre pcr para primers específicos de genes adicionando em cada tubo pcr buffer, primers para a frente e reverso, e polimerase de DNA de acordo com o manuscrito. Aliquot a mistura mestre nos poços de uma placa PCR de 96 poços. Em seguida, adicione o modelo de DNA agrupado.Carregue os tubos PCR em um cicloviário térmico e use um perfil de touchdown para executar a reação do PCR no ciclofaindo térmico. Para gerar heteroduplexos entre DNAs incompatíveis, incubar produtos PCR no ciclor térmico em um programa diferente. Em seguida, adicione 2,5 microliters de endonuclease Cel-1 caseiro a cada um dos produtos PCR heteroduplexos.Incubar por 45 minutos a 45 graus Celsius. Depois disso, termine a reação cel-1 adicionando 2,5 microliters de 0,5 molar EDTA em pH oito. Carregue 30,5 microliters de cada produto tratado Cel-1 misturado com cinco microliters de corante em um gel de 3%agarose e execute a 100 volts por duas horas e meia.Para desconvolucer piscinas mutantes, determine a zigosidade dos mutantes executando duas reações pcr para DNA M2 individual em que a primeira reação contém 2,5 microliters de DNA M2 e 2,5 microliters de DNA tipo selvagem e a segunda reação contém apenas cinco microliters de DNA M2. Este protocolo mostra a EMS mutagenizando pequenas culturas de grãos e a caracterização de mutantes. A curva de dosagem indica ótimas doses de EMS para as taxas de sobrevivência desejadas de 50% para três espécies diferentes de trigo.A presença de fenótipos facilmente identificáveis na população M2 confirma a eficácia da mutagênese em pequenas populações de grãos. Aqui estão quatro exemplos dos fenótipos mutantes em populações M2 TILLING, um mutante albino em uma população de cevada M2, um mutante de cloro em uma população de cevada M2, um mutante variegated com descoloração rosa em uma população de Aegilops tauschii M2, e um mutante de baixa lavoura em uma população de Triticum monococcum M2. Uma identificação mutante usando Cel-1 em plataformas de gel de agarose mostra uma potencial piscina mutante identificada entre 12 piscinas mutantes por bandas únicas.A desconvolução de piscinas mutantes determinou a zigosidade da mutação e ajudou a rastrear a mutação até amostras individuais. A piscina A4 tinha mutações heterozigous, indicadas por bandas cortadas em amostras de DNA do tipo selvagem Caixa 4 e Box 4. A piscina H5 continha mutações homozigosas, pois bandas únicas de fenda só estavam presentes na amostra de DNA tipo selvagem box 5 H5.O passo mais importante é determinar a concentração ideal do EMS para atingir a taxa de letalidade de 40 a 60%. Uma vez que uma população de TILLING com alta frequência de mutação tenha sido desenvolvida, ela pode ser usada para caracterização funcional de qualquer gene de interesse. Além disso, a população pode ser uma fonte de variação genética útil para o melhoramento das culturas.O TILLING tem sido amplamente utilizado para estudos genômicos funcionais em plantas de modelo e cultura. A gama de mutações obtidas pode ser erros, nocautes, formas silenciosas ou até mesmo mal-anotados. EMS é um mutagênico.Portanto, use equipamentos de proteção individual adequados enquanto manuseia o EMS. Descontaminar as sobras e usar dicas de pipeta.

development-targeting-induced-local-lesions-genomes-tilling

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Triagem de mutantes com defeitos fenotípicos é um método simples para identificar genes que funcionam em um determinado processo biológico. Neste artigo vamos descrever como worms cultura livre vivos (por...

Uma Introdução ao Lab Worm: de Worms Cultivar a mutagênese

Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis ​​pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Uma estratégia para gerar mutações em genes de histonas em sua localização endógena em Saccharomyces cerevisiae é apresentada.

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de um gene CRISPR/Cas9-baseado edição sistema de reparação de mutações pontuais em células de mamíferos. Aqui, usamos uma abordagem combinatória para gene edição com uma estratégia detalhada de follow-on experimental para medir indel formação no local de destino — em essência, analisando o mutagenesis local.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Este protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para pesquisadores interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro das variações números de cópia em plantas.

Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para o mutagenesis aleatório de um gene alvo no fermento de fissão. Como exemplo, temos como alvo rpt4 +, que codifica uma subunidade do proteossomo 19S e tela para as mutações que desestabilizam a heterocromatina.

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Descreveremos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII Lambda selecione em culturas de células de roedores transgênicos ou correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos.

O Lambda selecione cII sistema de deteção de mutação

Neste artigo, nós apresentamos o protocolo que é descrito como a análise de derretimento de alta resolução (HRM)-baseou as lesões locais induzidas alvo nos genomes (TILLING). Este método utiliza mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN e é apropriado para a seleção da elevado-produção da inserção/apagamento (Indel) e da única base cifras (SBS).

Identificando mutações por derretimento de alta resolução em uma população de lavando de arroz

Endonucleases de restrição com nova especificidade de seqüência podem ser desenvolvidas a partir de enzimas que reconhecem uma seqüência parcialmente degenerada. Aqui fornecemos um protocolo detalhado que usamos com sucesso para alterar a especificidade da seqüência da enzima NlaIV. Os ingredientes-chave do protocolo são a compartimentação in vitro da reação de transcrição/tradução e a seleção de variantes com novas especificidades de seqüência.

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

Aprenda a desenvolver populações TILLING robustas com alta frequência de mutação em cereais de grãos pequenos usando mutagênese por EMS. Este método facilita a descoberta de genes e genômica funcional.

Desenvolvimento do direcionamento de lesões locais induzidas em populações de genomas (lavoura) em pequenas culturas de grãos por metilo Methanesulfonate mutagenesis (Vídeo) | JoVE Journal

Desenvolvimento do direcionamento de lesões locais induzidas em populações de genomas (lavoura) em pequenas culturas de grãos por metilo Methanesulfonate mutagenesis

Explorar mais vídeos