Name: Geração de fibrilas pré-formadas Alpha-synuclein de monômeros e uso in vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a gerar fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleína a partir de monômeros e aplicá-las em modelos in vivo de doença de Parkinson. Este protocolo padronizado inclui controle de qualidade e injeção neurocirúrgica.

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Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Fundação Michael J. Fox, do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC (NS099416) e do Weston Brain Institute.

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li>
<li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li>
<li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Over+Quantity%3A+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621(2018).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li>
<li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+disorders+%3A+official+journal+of+the+Movement+Disorder+Society%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li>
<li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12(2017).</li>
<li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson%27s+Disease+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li>
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<li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein%2C+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788(2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li>
<li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li>
<li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li>
</ol>

Joseph Patterson, Kelvin Luk, e Caryl Sortwell estão atualmente envolvidos em acordos contratuais com a Fundação Michael J. Fox para o controle de qualidade α-SYN material gerado pela Proteos, Inc. Coauthor Nicole Polinski, é um funcionário do Michael J. Fox Fundação, que contratou a Proteos, Inc. para produzir o monómero α-SYN. Os coautores Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley e Nicholas Kanaan não têm nada a revelar.

A produção de PFFS α-SYN capazes de semeadura neurônios e levando a Lewy corpo-como inclusões é dependente de vários fatores e etapas. Um fator crítico é que os monómeros utilizados para a geração de fibrilas precisam ser especificamente formulados paraa fibrilização4,9,14,15. Se os monómeros não forem formulados para fibrilização, as fibrilas não podem formar-se ou as fibrilas que formam não podem produzir patologia α-SYN. Da mesma forma, o tampão que os monómeros também influenciam a fibrilização. Como tal, para os melhores resultados, a concentração de sal deve ser de aproximadamente 100 mM NaCl e pH entre 7,0 e 7,3. Uma etapa inicial que introduz a variabilidade é o método pelo qual o conteúdo inicial de proteína é determinado, com a medição em A280 susceptível de produzir resultados mais precisos e, portanto, é o método preferencial. A discrepância na concentração proteica pode diminuir a eficácia do processo de fibrilização, bem como alterar a concentração assumida de PFF utilizada em experimentos. Ambos podem levar a uma diminuição na eficiência de semeadura e variação de lote entre experimentos.
As etapas iniciais do controle da qualidade confirmarão características críticas dos PFFS, especificamente que têm uma conformação fibrilary (microscopia de elétron), contêm estruturas do amilóide (ensaio do thioflavin T), e são pelletable (ensaio do sedimentation). É importante notar que os resultados do ensaio de tioflavina T flutuarão com o tempo e não são uma medida direta da quantidade de estruturas amilóides presentes, em vez disso, o ensaio de tioflavina T deve ser utilizado apenas como um indicador da presença de estruturas amilóides dentro a amostra. Thioflavin T é normalmente utilizado em ensaios in vitro, tais como o referido ensaio para mostrar as fibrilas contêm estruturas amilóides. Alternativamente, a tioflavina S é usada no tecido para detectar estruturas amilóides, como mostrado na Figura 7. Em relação ao ensaio de sedimentação, os resultados mostram apenas que os PFFs são encontrados predominantemente na fração peletizável. Como as amostras são executadas em condições de desnaturação, uma única faixa proeminente de aproximadamente 14 kDa, o tamanho dos monômeros α-SYN, está presente nos géis. Isto é ao contrário das bandas múltiplas presentes em pesos moleculares mais elevados que seria esperado com PFFs se um gel nativo ou não-desnaturação foi usado. Por fim, a aprovação bem-sucedida de todos esses passos de controle de qualidade inicial não garante a atividade de semeadura de inclusão α-SYN. Por esta razão, experimentos de cultura celular ou uma pequena coorte de animais injetados cirurgicamente devem ser usados para testar a eficácia dos PFFs antes de usar em experimentos maiores.
Sonication é um passo crucial no processo e os parâmetros serão diferentes dependendo do modelo de sonicador usado. Os parâmetros de sonicação devem ser aplicados e verificados para mostrar que fragmentos curtos de PFF foram produzidos. O tamanho do fibril tem o rolamento na semeadura, com as fibrilas mais curtas que semeam mais eficientemente. Embora a semente mais curta dos fibrilas mais eficientemente, este platôs do efeito e o comprimento optimal de pff são aproximadamente 50 nanômetro4,18. Também é importante não over-SONICATE as amostras e expor os PFFs ao calor excessivo, pois isso pode diminuir a eficiência de semeadura. Estes PFFs sonicated devem ser testados para a eficácia na cultura pequena da pilha ou experimentos in vivo antes do uso em experimentos de maior escala. Como diferentes sessões de sonication têm o potencial para introduzir a variabilidade, os grupos de tratamento experimental devem ser planejados em conformidade.
Ao entregar PFFS in vivo, a localização do (s) local (es) de injeção e a quantidade total de PFFS utilizados podem afetar o número de neurônios que desenvolverão inclusões, bem como a extensão da neurodegeneração7,14. As coordenadas no protocolo fornecem um lugar a começar, mas devem ser testadas dentro do laboratório para assegurar-se de que a região desejada do alvo desenvolva a patologia do α-SYN antes do uso em experimentos em grande escala. Se desejado, o rastreamento de corante ou grânulos fluorescentes pode ser usado como uma forma de testar a segmentação regional antes de usar PFFs. A quantidade de PFFS utilizada in vivo varia entre os grupos, sendo que a maioria dos grupos utiliza um total entre 5 a 20 μg de PFFS em um ou dividido entre dois locais de injeção1,2,3,4,5 , 6 anos de , 7 anos de , 14. como o número de locais de injeção, localização de locais de injeção, e quantidade de PFFS injetado pode efeito resultados e progressão da synucleinopathy, os resultados a jusante dos parâmetros utilizados devem ser caracterizados antes de usar o modelo para testar as intervenções potenciais ou examinar as características temporais do modelo.
Ao selecionar um modelo a ser usado para testar a terapêutica ou estudar a progressão da doença, o modelo utilizado deve ser selecionado para melhor responder à pergunta feita. Nem todos os modelos possuirão determinadas características da doença do PD, ou oferecerão o timeframe necessário para testar intervenções potenciais. O modelo de PFF recapitula características chaves do paládio, tal como a patologia do α-SYN e o neurodegeneração, e pode conduzir aos prejuízos modestos do motor. O modelo oferece um tempo-curso previsível e prolongado, onde as inclusões formam meses antes da neurodegeneração. Isso permite que os pesquisadores examinem e explorem as diferentes fases ao longo da progressão prolongada da synucleinopatia. Espera-se que o uso atual e futuro do modelo global seja benéfico no estudo da progressão da doença e no desenvolvimento de novas terapias.

Parkinson ' a doença de s (paládio) é caracterizada primeiramente pós-morte por duas características patológicas principais: a patologia generalizada e progressiva do alfa-synuclein (α-SYN), e a degeneração nigrostriatal. Após a injeção em camundongos ou ratos tipo selvagem, as fibrilas pré-formadas α-SYN (PFFS) induzem acúmulo progressivo de α-SYN patológico, o que pode resultar em degeneração prolongada de neurônios de dopamina substância negra nigra pars compacta (SNPC) ao longo de muitos meses, bem como déficits sensório-motores1,2,3,4,5,6. Os neurônios são expostos a fibrilas α-SYN, seja via injeção intracerebral direta ou adicionadas à mídia de neurônios cultivados. Quando os PFFS são levados para os neurônios, os PFFS atuam para "semear" a formação de inclusões através de templating, e acúmulo de α-SYN endógena em inclusões fosforiladas1,7,8, a 9. As inclusões compartilham propriedades semelhantes aos corpos de Lewy: contendo α-SYN fosforilado na serina 129 (pSyn), ubiquitina e p62; possuem estruturas quaternárias amilóides como mostrado com coloração de tioflavina positiva; e são resistentes a proteinase K digestão1,3,5,7,8,9,10,11, doze anos. A exposição ao pff leva à formação de inclusão α-SYN na primária e alguns neurônios imortalizados na cultura, bem como camundongos, ratos e primatas não humanos in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. É importante notar que PFFs não levará à formação de inclusão α-SYN em todos os modelos de cultura celular e alguns neurônios cultivados vai semente melhor do que outros.
Outra característica importante do modelo in vivo de PFF α-SYN é as fases patológicas sequenciais distintas que emergem ao longo de vários meses. Em roedores, após injeção intraestrial, a formação de inclusão α-SYN geralmente atinge o SNPC e muitas regiões corticais dentro de 1-2 meses. Este pico de agregação é seguido pela degeneração nigrostriatal ≈ 2-4 meses mais tarde1,3,5. Esses estágios patológicos distintos fornecem aos pesquisadores a plataforma com a qual estudar e desenvolver estratégias que 1) diminuem a agregação α-SYN, 2) claras já formadas α-SYN inclusões, e/ou 3) impedem a subsequente neurodegeneração. O modelo de pff oferece vantagens e desvantagens distintas em comparação aos modelos neurotoxicant, transgenic, e virais mediados vetor do superexpressão do α-SYN como revistos previamente6. A escolha do modelo ou abordagem a tomar deve ser determinada pelo modelo que melhor se adapte à pergunta que os investigadores estão pedindo.
Embora o modelo PFF tenha sido utilizado com sucesso por muitos laboratórios, ainda existem grupos que sofreram inconsistências com a geração de fibrilas e produzindo uma patologia α-SYN consistente14. Exemplos de inconsistências variam de PFFs que produzem pouca ou nenhuma patologia α-SYN, lote para a eficiência de semeadura em lote, e até mesmo a falha de fibrilas para formar. Assim, a padronização da geração de α-SYN PFF e da aplicação in vivo é fundamental para possibilitar interpretações precisas sobre o impacto de novas intervenções terapêuticas. O seguinte protocolo esboça as etapas exigidas para a geração de PFFs dos monómeros do α-SYN, o controle in vitro da qualidade dos PFFs formados uma vez, o sonication e a medida dos PFFs antes do uso, e as sugestões para facilitar in vivo bem sucedida a injeção de PFFs em ratos ou ratos.

<table><tbody><tr><td>1x Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-alfa-sinucleína (fosforilada na serina 129)</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-alfa-sinucleína</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>ácido bicincônico</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>Tubo retrátil médico transparente (0,036" de diâmetro interno)</td> <td>Nordson Medical</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>Tubo retrátil médico transparente (0,044" de diâmetro interno)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tampa aquecida ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td> Revestido com <td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbono Electron</td><td>Microscopy Sciences</td><td>FCF300-</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidro (0,53 mm de diâmetro externo; 0,09 mm de diâmetro interno; 54 mm de comprimento)</td> <td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de agulha de vidro</td><td>Seringa Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>Monômero de alfa-sinucleína humana para gerar fibrilas pré-formadas</td><td>Proteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>Monômero de alfa-sinucleína de camundongo para gerar fibrilas pré-formadas</td> Tubo retrátil médico <td>laranja Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>(diâmetro interno de 0,021")</td> <td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica ponta</td> <td>de 3,2 mmQsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Q125 sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina T</td><td>EMD Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToxinSensor Cromogênico LAL Kit de Ensaio de Endotoxina</td><td>Genscript</td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de fibrilas pré-formadas alpha-synuclein de monômeros e uso in vivo

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

O uso do alfa-synuclein in vivo pré-formado fibrila (α-SYN PFF) modelo de synucleinopathy está ganhando popularidade entre os pesquisadores com o objetivo de modelar a doença de Parkinson synucleinopathy e degeneração nigrostriatal. A padronização da geração de α-SYN PFF e da aplicação in vivo é fundamental para garantir uma patologia α-SYN consistente e robusta. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a geração de fibrilas de α-SYN monomérica, etapas de controle de qualidade pós-fibrilização e parâmetros sugeridos para a injeção neurocirúrgica bem-sucedida de PFFs α-SYN em ratos ou camundongos. Começando com o α-SYN monomérico, a fibrilização ocorre durante um período de incubação de 7 dias, enquanto agitando em condições de buffer, concentração e temperatura ideais. O controle da qualidade da borne-fibrilização é avaliado pela presença de fibrilas pelletable através do ensaio da sedimentação, pela formação da conformação do amilóide nas fibrilas com um ensaio do thioflavin T, e pelo elétron-visualização microscópica das fibrilas. Considerando que a validação bem-sucedida usando esses ensaios é necessária para o sucesso, eles não são suficientes para garantir que os PFFs irão propagar inclusões α-SYN em neurônios, pois essa atividade de agregação de cada lote de PFF deve ser testada na cultura celular ou em coortes animais-piloto. Antes do uso, os PFFs devem ser sonicated circunstâncias precisamente estandardizadas, seguidos pelo exame usando a microscopia de elétron ou a dispersão clara dinâmica para confirmar comprimentos do fibrila estão dentro da escala óptima do tamanho, com um comprimento médio de 50 nanômetro. Os PFFs podem então ser adicionados à mídia de cultura de células ou usados em animais. A patologia detectável pela imunomarcação para α-SYN fosforilado (psyn; serina 129) é dias ou semanas aparentes mais tarde na cultura de pilha e em modelos do roedor, respectivamente.

A geração de fibrilas de monômeros α-SYN começa com a determinação da concentração dos monómeros. O teste de BCA e a medida da absorvância em 280 nanômetro (A280) podem ser usados para medir o índice de proteína; os resultados do ensaio de BCA, entretanto, sugeriram uma concentração mais elevada do que o método A280. Os PFFs derivados do monômero α-SYN do camundongo apresentaram um valor de BCA de 14, 5 ± 0,22 e um A280 de 8, 5 ± 0, 3 μg/μL (Figura 1). Da mesma forma, os PFFs derivados do monômero α-SYN humano também pareciam estar em maior concentração, com um valor de BCA de 12,95 ± 0,38 e um A280 de 7,83 ± 0, 5 μg/μL (Figura 1). As medidas de A280 são específicas para α-SYN com base na inclusão dos coeficientes de extinção e estes resultados foram utilizados para diluir os monómeros antes da incubação de 7 dias.
Antes da incubação, o líquido contendo os monômeros α-SYN foi claro, mas deve aparecer turvo após a formação da fibrila. O exame com microscopia eletrônica de transmissão confirmou a presença de fibrilas longas, medindo 10-20 nm de largura (Figura 4). Em comparação, os monômeros α-SYN eram pouco visíveis e não apresentavam forma discernível aparente (Figura 4). Com a confirmação visual de estruturas fibrilar, a conformação do amilóide dos fibrilas é a característica seguinte dos PFFS que devem confirmado usando um ensaio do thioflavin T. A tioflavina T apresenta fluorescência aumentada quando se liga ao amiloide; assim, o sinal fluorescente aumentado das amostras indica a presença de amyloid. Como exemplo, a tioflavina em dPBS produziu um sinal de 3.287 ± 580 unidades fluorescentes relativas (RFU), o monômero α-SYN do rato produziu um sinal de 4.174 ± 158 RFU, e os PFFs do rato produziram um sinal de 59.754 ± 6.224 RFU (Figura 5). Em comparação, o monômero α-SYN humano produziu um sinal semelhante de 4.158 ± 105 RFU para monômero de camundongo, e os PFFs humanos produziram um sinal mais alto de 1.235.967 ± 113.747 RFU em comparação com os PFFs do mouse (Figura 5). Para avaliar a presença de fibrilas pelletáveis, realizou-se um ensaio de sedimentação. Fibrils vai sedimento com centrifugação. Tanto nas amostras de camundongo quanto no PFF humano, a fração sobrenadante deve ter mais proteínas no pellet do que o sobrenadante (Figura 6). Em contrapartida, a maioria das proteínas do camundongo e dos monómeros humanos esteve presente no sobrenadante, com pouco presente no pellet (Figura 6). Com os PFFs visivelmente presentes por microscopia eletrônica, estruturas amilóides presentes, e fibrilas pelletable, os PFFs passaram todos os passos de controle de qualidade in vitro.
Tanto o mouse quanto os PFFS humanos foram sonicados para produzir PFFS de comprimentos apropriados para a semeadura de inclusões α-SYN4,18. Os PFFs foram diluídos para a concentração desejada de 4 μg/μL e sonicados. Imediatamente antes da cirurgia, 25 fibrilas representativas foram fotografadas por microscopia eletrônica e medidas para verificar o tamanho da fibrila. Os PFFs sonicated do rato mediram 48,8 ± 3,1 nanômetro, visto que os PFFs humanos mediram 52,1 ± 4,4 nanômetro do comprimento; As PFFs de ambas as espécies foram, portanto, o comprimento adequado (50 nm ou menos) para induzir a atividade de semeadura. Uma examinação mais detalhada de aproximadamente 500 fibrilas revelou a distribuição média do comprimento e do comprimento das fibrilas sonicated do rato. O comprimento médio foi de 44,4 ± 0,6 nm, com 86,6% dos PFFs medindo 60 nm ou menos (Figura 4). Em comparação, os PFFs humanos tinham média de 55,9 ± 1,1 nm com 69,6% dos PFFs medindo 60 nm ou menos (Figura 4).
Depois da injeção intraestrial de PFFS sonicated do rato em ratos como descrito previamente3,5, uma série de seções do tecido foram processadas em 2 meses de borne-cirurgia, quando o número de inclusão que contem neurônios é sabido ao pico em o SNpc, para a confirmação de inclusões α-SYN fosforiladas5. Os neurônios do rolamento de inclusão, como indicado pela coloração imuno-histoquímica para pSyn (anticorpo na tabela de materiais) estão presentes dentro do SNPC (Figura 7), bem como outras regiões em todo o cérebro que inervam o estriado (anterior núcleo olfativo, motor, cingulado, piriforme, prelímbico, somatossensorial, entorhinal e córtices insulares, amígdala, striatum)1,3,4,5,19. Estas inclusões compartilham propriedades similares com corpos de Lewy, tais como a ligação thioflavin S, e a resistência do α-SYN total à proteinase K (Figura 7), como mostrado pela mancha immunohistochemical (anticorpo e proteinase K na tabela de materiais) . A confirmação da semeadura dentro do cérebro indica que o controle de qualidade in vivo foi passado, e alíquotas de PFFs previamente congeladas e salvas do mesmo lote podem ser sonicadas parâmetros idênticos, com comprimentos validados, em experimentos maiores.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> Figura 1 . Métodos para a geração de fibrilas α-SYN. Esboço dos passos necessários para produzir fibrilas de monômeros α-SYN. Os monómeros são centrifugados por 10 min (15.000 x g, a 4 ° c). O sobrenadante é transferido para um tubo limpo e a concentração proteica é determinada pela absorvência a 280 nm, ou um ensaio de BCA. O gráfico mostra as concentrações dos monômeros α-SYN humanos e do rato. As colunas indicam os meios do grupo, as barras de erro representam o erro padrão de ± 1 da média. Depois que a concentração da proteína é determinada, os monómeros do α-SYN são diluídos, vórtice momentaneamente e incubados para o ° c 37 por 7 dias, ao agitar em um misturador orbital ajustado em 1.000 rpm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> Figura 2 . Métodos de coloração para microscopia eletrônica de transmissão. Diagrama de coloração negativa para microscopia eletrônica. A) imagens que descrevem grades de amostras de microscopia eletrônica. A grade tem um lado maçante ou leve e um lado brilhante ou escuro. O lado brilhante/escuro é revestido com um filme de apoio formvar/carbono. B) ilustração do procedimento de coloração. A grade é lado brilhante/escuro flutuado para baixo na primeira gota de ddH2o para 1 minuto e o excesso é ímpios afastado com papel de filtro. O processo é repetido com a segunda gota de DDH2o, PFFS diluídos ou monómeros, duas gotas de acetato de uranilo, e duas gotas adicionais de DDH2o. grades podem ser armazenadas em uma caixa de grade até imaged. Barra de escala = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> Figura 3 . Montagem de seringas de agulhas de vidro personalizadas. Diagrama das etapas necessárias para montar seringas de agulha de vidro anexadas. Os tubos capilares de vidro siliconized são puxados e cortados no meio para produzir as agulhas de vidro. A tubulação do envoltório do psiquiatra é usada para preparar a agulha do metal e para dar forma a um selo interno quando a agulha de vidro é deslizada na agulha do metal. Duas camadas adicionais de tubulação do shrink-wrap que sobrepõem a base da agulha de vidro e a agulha do metal são adicionadas consecutivamente e o calor aplicou-se para fixar a agulha de vidro e para dar forma a um selo água-apertado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> Figura 4 . Visualização de monômeros α-SYN e fibrilas α-SYN via microscopia eletrônica de transmissão. Micrografias representativas de monômeros α-SYN e fibrilas. Painéis superiores: rato e monômero α-SYN humano. Painéis médios: comprimento total do rato e humanos α-SYN PFFs. painéis inferiores: mouse e humanos α-SYN PFFs após sonication. Gráfico inferior: distribuição de mouse sonicado e humanos α-SYN PFF comprimentos. Barra de escala = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> Figura 5 . Confirmação de estruturas amilóides por ensaio tioflavina T. Medida do sinal fluorescente do rato e do monômero humano do α-SYN e das amostras de pff. Esquerda: resultados do rato α-SYN monômeros e α-SYN PFFs. Direita: resultados de monômeros α-SYN humanos e PFFs α-SYN. Um controle negativo do dPBS é mostrado em cada gráfico. Todas as medições são expressas em unidades fluorescentes relativas (RFU). As colunas indicam os meios do grupo, as barras de erro representam o erro padrão de ± 1 da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> Figura 6 . Ensaio de sedimentação para α-SYN. imagens de géis manchados de Coomassie. As bandas mostradas estão em aproximadamente 14 kDa com base na escada de proteínas. Esquerda: monômero do rato e PFFs. Direita: monómeros humanos e PFFs. Para todas as amostras de monômero e PFF, a pelota de ressuspensão (P) e o sobrenadante (S) são mostrados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> Figura 7 . Características das inclusões no modelo do rato que confirma a patologia do α-SYN. Micrografias representativas do substância negra nigra pars compacta em 2 meses após a injeção. Esquerda: neurônios contendo pSyn e contramanchado com violeta cresilo. Médio: os neurônios positivos de Thioflavin S. Direita: inclusões contendo α-SYN resistentes à proteinase K. barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O objetivo deste artigo é delinear as etapas necessárias para a geração de fibrilas de alfa-synucleina monomérica, controle de qualidade subsequente e uso das fibrilas pré-formadas in vivo.

Geração de fibrilas pré-formadas Alpha-synuclein de monômeros e uso in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

O modelo Fibril Pré-Formado Alfa-Synuclein está sendo usado por laboratórios em todo o mundo para estudar sinucleinopatias. Embora o modelo tenha sido usado com sucesso por muitos laboratórios, alguns grupos têm experimentado inconsistências gerando fibrilas e produzindo patologia alfa-sinucleína consistente. Esperamos que este protocolo, que detalha a geração de fibrilas a partir de monômeros alfa-sinucleína e o uso de fibrilas pré-formadas in vivo, possa responder a perguntas que os pesquisadores têm sobre o uso do modelo.O modelo Fibril Pré-Formado Alfa-Synuclein recapitula as principais características da doença de Parkinson, como patologia alfa-sinucleína e neurodegeneração. E tem sido mostrado para levar a danos motores modestos em alguns modelos animais. A formação de inclusões contendo alfa-sinucleína fosforilada e curso de tempo prolongado para neurodegeneração oferece aos pesquisadores diferentes estágios ao longo da progressão da sinucleinopatia, para estudar e direcionar possíveis intervenções terapêuticas.Demonstrando a preparação de agulhas de vidro personalizadas, está nosso técnico de laboratório, Christopher Kemp. Para começar este procedimento, descongele monômeros alfa-sinucleína no gelo. Re-suspened os monômeros descongelados, suavemente piscando no tubo.E centrífuga a 15.000 g e 4 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, transfira o supernascer para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mL limpo e registe a quantidade transferida. Diluir os monômeros com 1x dPBS a uma concentração final de 5 mg por mL.Brevemente vórtice para misturar, e brevemente centrífuga para coletar todo o líquido na parte inferior do tubo. Em seguida, use filme adesivo para fixar a tampa do tubo de micro centrífuga fechada. Coloque o tubo em uma misturador termo orbital com uma tampa por sete dias a 37 graus Celsius enquanto treme a 1.000 rpm.Ao final de sete dias, o conteúdo do tubo deve parecer turvo. Primeiro, não há todos os equipamentos de proteção pessoal necessários, incluindo luvas, um jaleco e um escudo facial. Em seguida, em uma capa de cultura celular, conecte uma sonda de 3,2 mm de diâmetro ao conversor.Defina a amplitude dos sonicadores para 30% e pulso para um segundo ligado e um segundo desligado e o tempo para um minuto. Descongele as fibrilas à temperatura ambiente, e ainda na capa da cultura, dilua as fibrilas com dPBS estéreis. Em seguida, umedeça um tecido de laboratório com 70% de etanol e use isso para limpar a sonda do sonicator para limpá-lo.Submergir a ponta da sonda em água dupla destilada e pulso 10 vezes para limpar ainda mais a sonda. Depois disso, limpe a sonda com um tecido de laboratório. Coloque a ponta da sonda limpa no tubo de fibrilas diluídas e posicione a ponta na parte inferior do tubo.Sonicar as fibrilas diluídas usando os parâmetros previamente definidos enquanto move a sonda para cima e para baixo durante cada pulso para garantir que todas as fibrilas do líquido sejam sônicas. Após a sônicação, centrífuga brevemente por um segundo a 2.000 g para coletar todo o líquido das laterais do tubo. Submergir a ponta da sonda em 1%SDS e pulso 10 vezes para limpar a sonda.Em seguida, remova a ponta do SDS e submerse-a em água dupla destilada e pulso 10 vezes. Limpe a sonda com um tecido de laboratório umedecido com 70% de etanol e limpe-a com um tecido de laboratório seco. Retire a sonda do conversor e armazene.Depois disso, limpe todas as superfícies do capô com 1%SDS, seguida por 70% de etanol. Para começar, coloque um tubo capilar de vidro siliconado em um puxador de agulha de vidro. Ligue o elemento de aquecimento e deixe os pesos ligados esticarem o tubo capilar de vidro aquecido.Em seguida, use uma tesoura para cortar o tubo capilar de vidro puxado no ponto mais fino do meio e remova a agulha de vidro do puxador de agulha de vidro. Em seguida, use uma tesoura para cortar um comprimento de envoltório de envoltório para aproximadamente 40 mm. Deslize o envoltório de envoltório sobre a agulha metálica de uma seringa chanfrada de 10 microliter.Use uma chama aberta para aquecer e adere ao envoltório de encolhimento à agulha, ao mesmo tempo em que certifique-se de girar a agulha para aplicar o calor uniformemente. Deslize a extremidade maior da agulha de vidro puxada cuidadosamente sobre a agulha metálica da seringa. Depois disso, corte um comprimento de envoltório de envoltório para aproximadamente 40 mm e deslize-o cuidadosamente sobre a agulha de vidro para sobrepor a base da agulha de vidro e a agulha metálica da seringa.Use uma chama aberta para aquecer o envoltório de encolhimento para fixar a agulha de vidro na agulha de metal. Para fixar ainda mais a agulha e evitar possíveis vazamentos, corte um comprimento adicional de envoltório de envoltório para aproximadamente 40 mm, e deslize-a cuidadosamente sobre a agulha de vidro para sobrepor a base da agulha de vidro e a agulha metálica da seringa. Use uma chama aberta para aquecer o envoltório de encolhimento para fixar a agulha de vidro na agulha de metal.Em seguida, use a tesoura para aparar a agulha de vidro para que a ponta tenha aproximadamente 8 mm de comprimento. Para testar a agulha, encha uma seringa de 1 mL com uma agulha de calibre 26 presa com água destilada. Remova o êmbolo metálico da seringa de agulha de vidro personalizada e insira a agulha da seringa cheia de água na base da seringa personalizada.Inspecione a interface da agulha de vidro e a agulha de metal para vazamentos e confirme um fluxo constante de água. Em seguida, encha um tubo de micro centrífuga com água destilada. Use a seringa de agulha de vidro personalizada para desenhar na água destilada.Inspecione a agulha para confirmar que o líquido está sendo levado para a seringa e que não há bolhas. Se houver bolhas, ou se a água não estiver sendo redigida na agulha, aparar a agulha pode ajudar a aliviar a pressão. Depois disso, armazene cuidadosamente a seringa com as agulhas de vidro presas, nas caixas de seringa até que seja necessário para cirurgias.O exame com microscopia eletrônica de transmissão confirma a presença de fibrilas longas. Em comparação, os monômeros alfa-sinucleína são visíveis na cevada e não têm forma perceptível. A confirmação analóide das fibrilas é então confirmada usando um Ensaio Thioflavvin T.Um ensaio representativo mostra que os monômeros dPBS e mouse produzem um sinal menor em unidades relativas de farinha em comparação com pffs. Monômero alfa-sinucleína humano produz um sinal semelhante ao monômero do mouse. Enquanto os PFFs humanos também produzem um sinal maior do que os monômeros.Para avaliar a presença de fibrilas pelitáveis, é realizado um ensaio de sedimentação. Tanto nas amostras de PFF do camundongo quanto do humano, a infração superata deve ter mais proteína na pelota do que o supernante. Em contraste, a maioria da proteína do camundongo e dos monômeros humanos está presente no supernante com pouco presente na pelota.Tanto os PFFs do mouse quanto do humano são sonicados para produzir PFFs de comprimentos apropriados para semeadura de inclusões de sinucleína alfa. Um exame abrangente de aproximadamente 500 fibrilas revela que o comprimento médio das fibrilas do rato é de aproximadamente 44 nanômetros. Com 86,6% dos PFFs medindo 60 nanômetros ou menos.Os PFFs humanos, no entanto, têm um comprimento médio de aproximadamente 55,9 nanômetros com 69,6% dos PFFs medindo 60 nanômetros ou menos. O exame in vivo da eficácia do PFF é confirmado por meio da imunohistoquímica. Inclusões formadas na substantia nigra, compartilham propriedades semelhantes aos corpos de Lewy, na forma de conter sinucleína alfa fosforilada, contêm estruturas aminloyed, e mancha com thioflavina S, e são resistentes à digestão Proteinase K.A sônica pode expor a sônica individual a fibrilas pré-formadas aerossolizadas. Como tal, devem ser usados trajes de segurança adequados e sônicação realizada em um capô para minimizar o risco de exposição.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra a injeção de fibrilas de alfa-sinucleína em um camundongo para induzir neuroinflamação. As fibrilas são injetadas intraperitonealmente em um camundongo transgênico que expressa proteínas alfa-sinucleína mutadas. Ao atingir o sistema nervoso central, as fibrilas entram nos neurônios e induzem a agregação das proteínas mutadas. Os agregados se espalham para neurônios, micróglias e astrócitos vizinhos. O reconhecimento dos agregados desencadeia a micróglia para induzir...

Indução de neuroinflamação em camundongos por injeção de fibrilas de alfa-sinucleína

Este vídeo demonstra o processo de quantificação do acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios de dopamina embrionários de camundongos pré-tratados com fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleína. Ele descreve as etapas para fixar, corar e quantificar os neurônios dopaminérgicos contendo agregados de alfa-sinucleína usando imunofluorescência.

Estudando o acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios embrionários primários de dopamina de camundongo

As proteínas podem adotar uma estrutura nativa ou se dobrar em amilóide insolúvel. As condições que favorecem a via de desdobramento levam à formação de diferentes tipos de fibrilas amilóides. Os métodos descritos aqui permitem a rápida conversão de proteínas nativas em amilóide in vitro.

Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

Um ELISA que oferece uma nova abordagem quantitativa é descrito. Ele detecta especificamente a α-sinucleína associada à doença (αSD) em um modelo de camundongo transgênico (M83) de sinucleinopatia usando vários anticorpos contra a forma fosforilada de αS na Ser129 ou a parte C-terminal da proteína.

Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez mais insolúvel/agregada do tecido cerebral humano post-mortem. Através da utilização de tampões com aumento da força do detergente e técnicas de ultracentrifugação de alta velocidade, as propriedades variáveis da agregação de α-syn em tecidos doentes e não doentes podem ser examinadas.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu ou língua de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos, que expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T familiar e a luciferase do pirilampo, pode induzir a neuropatologia, incluindo neuroinflamao , em seu sistema nervoso central.

Imagem de bioluminescência de Neuroinflammation em Ratinhos Transgénicos Após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas

O objetivo do presente protocolo é fornecer um sistema celular que Replica a formação do alfa-synuclein agrega na vivo. Inclusões intracelulares alfa-synuclein são semeados nos neurônios primários pela internalização e propagação de exógeno administrado agregados nativo associado microssomas alfa-synuclein, isolados de ratos transgênicos doentes alfa-synuclein.

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estudar o acúmulo neuronal de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina de camundongos. Os agregados fosforilados de α-sinucleína em neurônios são induzidos com fibrilas pré-formadas de α-sinucleína. Imagens automatizadas de células imunofluorescentamente rotuladas e análise de imagem imparcial tornam este protocolo robusto adequado para a triagem de rendimento médio a alto de drogas que inibem o acúmulo de α-sinucleína.

Estudando o acúmulo de α-sinucleína induzida por fibril pré-formado em neurônios de dopamina de cérebro médio do camundongo embrionário primário

Um modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína é necessário para estudar e entender a patogênese da doença de Parkinson. Descrevemos um método para monitorar a citotoxicidade e a formação de agregados de α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado.

Um método para estudar a toxicidade e agregação da α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado

O presente protocolo descreve um método para administração intranasal de agregados de α-sinucleína. Este método fornece informações sobre a propagação da α-sinucleína da mucosa olfatória para o bulbo olfatório na doença de Parkinson.

Técnica para administração intranasal de agregados de α-sinucleína

Aprenda a gerar fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleína a partir de monômeros e aplicá-las em modelos in vivo de doença de Parkinson. Este protocolo padronizado inclui controle de qualidade e injeção neurocirúrgica.

Geração de fibrilas pré-formadas Alpha-synuclein de monômeros e uso in vivo

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