Geração de fibrilas pré-formadas Alpha-synuclein de monômeros e uso in vivo

O modelo Fibril Pré-Formado Alfa-Synuclein está sendo usado por laboratórios em todo o mundo para estudar sinucleinopatias. Embora o modelo tenha sido usado com sucesso por muitos laboratórios, alguns grupos têm experimentado inconsistências gerando fibrilas e produzindo patologia alfa-sinucleína consistente. Esperamos que este protocolo, que detalha a geração de fibrilas a partir de monômeros alfa-sinucleína e o uso de fibrilas pré-formadas in vivo, possa responder a perguntas que os pesquisadores têm sobre o uso do modelo.

O modelo Fibril Pré-Formado Alfa-Synuclein recapitula as principais características da doença de Parkinson, como patologia alfa-sinucleína e neurodegeneração. E tem sido mostrado para levar a danos motores modestos em alguns modelos animais. A formação de inclusões contendo alfa-sinucleína fosforilada e curso de tempo prolongado para neurodegeneração oferece aos pesquisadores diferentes estágios ao longo da progressão da sinucleinopatia, para estudar e direcionar possíveis intervenções terapêuticas.

Demonstrando a preparação de agulhas de vidro personalizadas, está nosso técnico de laboratório, Christopher Kemp. Para começar este procedimento, descongele monômeros alfa-sinucleína no gelo. Re-suspened os monômeros descongelados, suavemente piscando no tubo.

E centrífuga a 15.000 g e 4 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, transfira o supernascer para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mL limpo e registe a quantidade transferida. Diluir os monômeros com 1x dPBS a uma concentração final de 5 mg por mL.

Brevemente vórtice para misturar, e brevemente centrífuga para coletar todo o líquido na parte inferior do tubo. Em seguida, use filme adesivo para fixar a tampa do tubo de micro centrífuga fechada. Coloque o tubo em uma misturador termo orbital com uma tampa por sete dias a 37 graus Celsius enquanto treme a 1.000 rpm.

Ao final de sete dias, o conteúdo do tubo deve parecer turvo. Primeiro, não há todos os equipamentos de proteção pessoal necessários, incluindo luvas, um jaleco e um escudo facial. Em seguida, em uma capa de cultura celular, conecte uma sonda de 3,2 mm de diâmetro ao conversor.

Defina a amplitude dos sonicadores para 30% e pulso para um segundo ligado e um segundo desligado e o tempo para um minuto. Descongele as fibrilas à temperatura ambiente, e ainda na capa da cultura, dilua as fibrilas com dPBS estéreis. Em seguida, umedeça um tecido de laboratório com 70% de etanol e use isso para limpar a sonda do sonicator para limpá-lo.

Submergir a ponta da sonda em água dupla destilada e pulso 10 vezes para limpar ainda mais a sonda. Depois disso, limpe a sonda com um tecido de laboratório. Coloque a ponta da sonda limpa no tubo de fibrilas diluídas e posicione a ponta na parte inferior do tubo.

Sonicar as fibrilas diluídas usando os parâmetros previamente definidos enquanto move a sonda para cima e para baixo durante cada pulso para garantir que todas as fibrilas do líquido sejam sônicas. Após a sônicação, centrífuga brevemente por um segundo a 2.000 g para coletar todo o líquido das laterais do tubo. Submergir a ponta da sonda em 1%SDS e pulso 10 vezes para limpar a sonda.

Em seguida, remova a ponta do SDS e submerse-a em água dupla destilada e pulso 10 vezes. Limpe a sonda com um tecido de laboratório umedecido com 70% de etanol e limpe-a com um tecido de laboratório seco. Retire a sonda do conversor e armazene.

Depois disso, limpe todas as superfícies do capô com 1%SDS, seguida por 70% de etanol. Para começar, coloque um tubo capilar de vidro siliconado em um puxador de agulha de vidro. Ligue o elemento de aquecimento e deixe os pesos ligados esticarem o tubo capilar de vidro aquecido.

Em seguida, use uma tesoura para cortar o tubo capilar de vidro puxado no ponto mais fino do meio e remova a agulha de vidro do puxador de agulha de vidro. Em seguida, use uma tesoura para cortar um comprimento de envoltório de envoltório para aproximadamente 40 mm. Deslize o envoltório de envoltório sobre a agulha metálica de uma seringa chanfrada de 10 microliter.

Use uma chama aberta para aquecer e adere ao envoltório de encolhimento à agulha, ao mesmo tempo em que certifique-se de girar a agulha para aplicar o calor uniformemente. Deslize a extremidade maior da agulha de vidro puxada cuidadosamente sobre a agulha metálica da seringa. Depois disso, corte um comprimento de envoltório de envoltório para aproximadamente 40 mm e deslize-o cuidadosamente sobre a agulha de vidro para sobrepor a base da agulha de vidro e a agulha metálica da seringa.

Use uma chama aberta para aquecer o envoltório de encolhimento para fixar a agulha de vidro na agulha de metal. Para fixar ainda mais a agulha e evitar possíveis vazamentos, corte um comprimento adicional de envoltório de envoltório para aproximadamente 40 mm, e deslize-a cuidadosamente sobre a agulha de vidro para sobrepor a base da agulha de vidro e a agulha metálica da seringa. Use uma chama aberta para aquecer o envoltório de encolhimento para fixar a agulha de vidro na agulha de metal.

Em seguida, use a tesoura para aparar a agulha de vidro para que a ponta tenha aproximadamente 8 mm de comprimento. Para testar a agulha, encha uma seringa de 1 mL com uma agulha de calibre 26 presa com água destilada. Remova o êmbolo metálico da seringa de agulha de vidro personalizada e insira a agulha da seringa cheia de água na base da seringa personalizada.

Inspecione a interface da agulha de vidro e a agulha de metal para vazamentos e confirme um fluxo constante de água. Em seguida, encha um tubo de micro centrífuga com água destilada. Use a seringa de agulha de vidro personalizada para desenhar na água destilada.

Inspecione a agulha para confirmar que o líquido está sendo levado para a seringa e que não há bolhas. Se houver bolhas, ou se a água não estiver sendo redigida na agulha, aparar a agulha pode ajudar a aliviar a pressão. Depois disso, armazene cuidadosamente a seringa com as agulhas de vidro presas, nas caixas de seringa até que seja necessário para cirurgias.

O exame com microscopia eletrônica de transmissão confirma a presença de fibrilas longas. Em comparação, os monômeros alfa-sinucleína são visíveis na cevada e não têm forma perceptível. A confirmação analóide das fibrilas é então confirmada usando um Ensaio Thioflavvin T.

Um ensaio representativo mostra que os monômeros dPBS e mouse produzem um sinal menor em unidades relativas de farinha em comparação com pffs. Monômero alfa-sinucleína humano produz um sinal semelhante ao monômero do mouse. Enquanto os PFFs humanos também produzem um sinal maior do que os monômeros.

Para avaliar a presença de fibrilas pelitáveis, é realizado um ensaio de sedimentação. Tanto nas amostras de PFF do camundongo quanto do humano, a infração superata deve ter mais proteína na pelota do que o supernante. Em contraste, a maioria da proteína do camundongo e dos monômeros humanos está presente no supernante com pouco presente na pelota.

Tanto os PFFs do mouse quanto do humano são sonicados para produzir PFFs de comprimentos apropriados para semeadura de inclusões de sinucleína alfa. Um exame abrangente de aproximadamente 500 fibrilas revela que o comprimento médio das fibrilas do rato é de aproximadamente 44 nanômetros. Com 86,6% dos PFFs medindo 60 nanômetros ou menos.

Os PFFs humanos, no entanto, têm um comprimento médio de aproximadamente 55,9 nanômetros com 69,6% dos PFFs medindo 60 nanômetros ou menos. O exame in vivo da eficácia do PFF é confirmado por meio da imunohistoquímica. Inclusões formadas na substantia nigra, compartilham propriedades semelhantes aos corpos de Lewy, na forma de conter sinucleína alfa fosforilada, contêm estruturas aminloyed, e mancha com thioflavina S, e são resistentes à digestão Proteinase K.

A sônica pode expor a sônica individual a fibrilas pré-formadas aerossolizadas. Como tal, devem ser usados trajes de segurança adequados e sônicação realizada em um capô para minimizar o risco de exposição.