Name: In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda a técnica de imagem óptica transcraniana para visualizar o transporte de líquido cefalorraquidiano em camundongos vivos através do crânio intacto. Este método permite medições dinâmicas do sistema glicinfático com custo reduzido.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e pelo Instituto Nacional de envelhecimento (institutos nacionais de saúde dos EUA; R01NS100366 e RF1AG057575 a MN), o programa de redes de excelência transatlântica Fondation Leducq e o programa de investigação e inovação da UE Horizon 2020 (subvenção n. º 666881; SVDs @ Target). Também gostaríamos de agradecer a Dan Xue pela assistência especializada com ilustrações gráficas.

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê universitário de recursos animais (UCAR, protocolo n º 2011-023) da Universidade de Rochester e realizados de acordo com o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. preparando a cânula da cisterna magna, a placa principal, e o suporte principal
<ol><li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e placas de cabeça antes da cirurgia. Nota: os traçadores fluorescentes são entregados diretamente no CSF através de um cannulation do Magna do cisterna. Para instruções detalhadas sobre este procedimento, por favor consulte Xavier et al9.</li>
	<li>Momentaneamente, usando um excitador da agulha, quebre a ponta de uma agulha de 30G x 12,7 milímetro (1/2 polegadas), 3/4 da maneira para baixo, e coloc a extremidade sem corte da agulha em uma extremidade da tubulação do polietileno 10 (PE10) (aproximadamente 45 cm de comprimento). Certifique-se de que somente o chanfro está salientes fora da borda da tubulação PE10.</li>
	<li>Quebre 1/4 da extremidade chanfrada de uma outra agulha 30G e coloc a extremidade sem corte da agulha restante na outra extremidade da tubulação PE10, com o luer-fechamento plástico ainda Unido.</li>
	<li>Encha uma seringa de vidro de 100 μL com o CSF estéril, artificial (aCSF: 126 milímetros NaCl, 2,5 milímetros KCl, 1,25 milímetros NaH2po4, 2 milímetros MgSO4, 2 milímetro CAcl2, 10 milímetros de glicose, e 26 milímetros NaHCO3).</li>
	<li>Prenda a seringa até ao fim da linha e encha-a com aCSF até atingir a ponta da agulha chanfrada. É importante que a seringa é preenchida com aCSF e não ar, como uma coluna de ar é mais propensos a volumes de infusão variável.</li>
	<li>Para experimentos crônicos, deixe a linha preenchida com aCSF e pule a etapa 1,7.</li>
	<li>Para experimentos agudos, coloque a seringa em uma bomba de infusão e retire aproximadamente 5 mm de ar, o que impedirá a mistura. Em seguida, retire o volume total de traçador (s) que é desejado para o experimento (20% extra é recomendado devido a perdas de espaço morto). Nota: a tubagem PE10 deve ser suficientemente longa para que a bolha de ar não introduza o manguito plástico da seringa de vidro ao carregar o traçador. Para um experimento típico, o protocolo utiliza 10 μL de albumina sérica bovina conjugada para Alexa fluor 647 (BSA-647) diluída em aCSF a 0,5%.</li>
	<li>Confirme que a placa de cabeça cabe no suporte da cabeça e que é o tamanho certo para o mouse que está sendo usado. Os marcadores anatômicos para assegurar isto são: a beira superior da janela alinha com a linha interocular e a beira do posterior cai rostral à crista occipital. Nota: as placas de cabeça de aço inoxidável podem ser esterilizadas e reutilizadas. A maioria das misturas de cianoacrilato pode ser removida com uma solução de acetona.</li>
</ol>2. procedimento cirúrgico
<ol><li>Pesar e anestesiizar o rato (por exemplo, cetamina/xilazina; 100 mg/kg de cetamina, 10 mg/kg de xilazina; i.p.).</li>
	<li>Uma vez que o rato já não responde a uma pitada do dedo do pé, umedecer a garganta e a cabeça com água estéril e raspar usando tosquiadeiras. Uma vez que a área é raspada, limpe a área com um cotonete de álcool novamente para remover qualquer cabelo residual. Nota: umedecendo a pele antes que o grampeamento reduza dramàtica a quantidade de cabelo na janela da imagem latente após a incisão.</li>
	<li>Coloc o rato em um frame stereotactic sobre uma almofada temperatura-controlada e aplique a pomada oftálmica do petróleo aos olhos do rato para assegurar-se de que não seque para fora.</li>
	<li>Limpe a pele exposta com um cotonete de clorexidina. Após 2 min, retire a clorexidina com uma limpeza de álcool. Finalmente, aplique uma solução de iodo que pode ser deixada para secar.</li>
	<li>Injetar analgesia subcutânea (0,25% bupivacaína HCl) para o topo do crânio e do pescoço.</li>
	<li>Começando pela parte do pescoço que cobre a crista occipital, faça um corte da linha média na pele sobrejacente e continue rostralmente em direção à linha interorbital. Incise lateralmente para a fronteira onde o músculo temporal insere no crânio. Remova toda a pele da incisão fusiforme para expor os ossos frontais e parietal. Cuidado: a cavidade retroorbital encontra-se caudal aos olhos e as grandes filiais da mentira facial da veia do posterior rostral ao Pinna. Tenha cuidado ao fazer a incisão para poupar essas estruturas. Se isso ocorrer, pare de sangrar Mantendo a hemostasia com um cotonete estéril por vários minutos e continue.</li>
	<li>Irrigar o crânio com soro fisiológico estéril e limpar a superfície usando cotonetes de algodão para que ele está livre de detritos e pêlos, uma vez que estes irão interferir com a qualidade da imagem. A transparência do crânio é melhor preservada deixando o periósteo e a fáscia sobrejacente intacta. Nota: se estas estruturas são removidas acidentalmente, o crânio pode tornar-se seco e opaco ao longo do tempo. Re-umedecer com aCSF ou usar uma mistura de óleo de parafina e glicerol para reduzir a reflectância do crânio em experimentos agudos21.</li>
	<li>Proceder à inserção da cânula cisterna magna-para detalhes cirúrgicos deste procedimento, consulte Xavier et al9.</li>
	<li>Depois de inserir a cânula CM, aplique uma mistura de cimento dentário com cola de cianoacrilato no lado ventral da placa de cabeça ao redor da borda e coloque-a no crânio para que a borda anterior da placa principal se alinhe com a ponta posterior do osso nasal e o po a borda do esterior alinha-se com o aspecto anterior do osso interparietal, certificando-se de que a sutura sagital (linha média) é centrada e reta em relação à janela (Figura 1b).</li>
	<li>Fixar a posição da placa de cabeça usando algumas gotas de acelerador de cola. Encha todas as lacunas restantes com a mistura de cimento e cure-a com acelerador. Atenção: Certifique-se de que o cianoacrilato não entra em contacto com os olhos do rato ou bloqueie a janela de imagem.</li>
	<li>Cole a cânula CM na placa de cabeça para garantir que estas não fiquem desanexadas durante o transporte ou quando o rato acordar.</li>
	<li>Para experimentos agudos, avance para o passo 2,16.</li>
	<li>Para experimentos crônicos, aplique uma fina camada de cola de cianoacrilato de secagem clara ao crânio exposto, tendo cuidado para não criar bolhas, pois elas interferirão na imagem. A colagem fornece a proteção para o crânio e não interferirá com a imagem latente. Certifique-se de que a cola cobre o crânio exposto todo o caminho para a pele na borda da incisão.</li>
	<li>Use uma braçadeira do hemostat para prender a tubulação aCSF-enchida de PE10 2-3 cm do CM e para cortar a linha com uma ponta de cauterização de alta temperatura. Uma vez que é separado, aplainam a tubulação PE10 derretida para selar a cânula. PRECAUÇÃO: Certifique-se de que não liberta o grampo até que a cânula tenha sido selada e confirme que não existem fugas na tubagem para evitar uma fístula LIQUÓRICA.</li>
	<li>Administrar carprofeno (5 mg/kg a cada 24 h durante 3 dias; i.p. ou s.c.) e devolver o rato a uma gaiola controlada por temperatura, única e permitir-lhe recuperar durante pelo menos 24 h antes da imagem. Não deixe o rato desacompanhado até que recupere a consciência suficiente para manter o recumbency esternal. As janelas cranianas intactas permanecem estáveis por várias semanas. Nota: o experimento crônico pode ser pausado aqui. Cuidado: algumas complicações postoperative são: cephalohematoma/hematomas subgaleal, fístula do CSF, e infecção.</li>
	<li>Para experimentos agudos, coloque o mouse no suporte da cabeça usando a placa de cabeça para que o crânio esteja em uma posição fixa. Certifique-se de verificar o nível de anestesia e colocar uma almofada de aquecimento o mouse. O rato está agora pronto para ser levado para o Macroscópio. Atenção: transportar cuidadosamente o rato juntamente com a bomba de perfusão num carrinho. Se o canulação do cm se tornar desalojado, causará uma gota na pressão intracranial e todos os escapes do CSF alterarão os resultados experimentais.</li>
</ol>3. preparando o mouse para a imagem
Observação: o protocolo varia dependendo se o experimento de imagem será executado em um mouse anestesiado (iniciar no passo 3,1) ou acordado (iniciar no passo 3,2).
<ol><li>Ratos anestesiados<ol>
<li>Coloque o suporte da cabeça no palco do Macroscópio, certificando-se de que não há dobras na linha da bomba da seringa para a cânula CM e que não é tenso, uma vez que isso pode afetar a infusão de traçador.</li>
		<li>Observar a frequência respiratória e coloração rosa das membranas mucosas, indicando boa oxigenação. Injetar soro fisiológico por via subcutânea para garantir o nível de hidratação, se necessário. Verifique se o animal está suficientemente anestesiado e redose, se necessário.</li>
		<li>Ligue a câmara de Macroscópio e o LED e inicie o modo LIVE.</li>
		<li>Confirme a ampliação do campo de imagem para que a sutura nasofrontal na parte superior do campo e a sutura lambdóide na parte inferior possam ser claramente visualizadas, com a sutura sagital paralela e centrada no meio da imagem (Figura 1C). Uma vez no lugar, prenda o suporte principal ao estágio do Macroscópio com fita.</li>
		<li>Concentre o Macroscópio no crânio exposto. Apesar dos macroscópios terem uma profundidade de campo relativamente grande, a curvatura do crânio do mouse só permite que uma área específica esteja em foco. Os melhores resultados são obtidos quando o plano focal está localizado nos lados laterais dos ossos parietal posteriores às suturas coronais. Nota: esta é a localização das artérias cerebrais médias (MCA), onde ocorre a maior parte do fluxo de LCR (Figura 1D, E)10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Camundongos acordados<ol>
<li>Antes da sessão da imagem latente, deixe os animais recuperar pelo menos 24 h da cirurgia da placa principal. Períodos de recuperação mais longos (5-7 dias) também são recomendados. Durante este tempo, treinar o mouse para ser cabeça fixada no palco no tubo de retenção para 0.5-1 h por dia para a duração do período de recuperação. Nota: habituação permite que o mouse para ser anexado ao suporte da cabeça sem anestesia e reduz o stress e ansiedade durante o experimento real. Se isso não for viável e a anestesia não interferir com o experimento, uma dose de indução de um anestésico inalatório (por exemplo, isoflurano 2% a 1-2 L/min O2 vazão) pode ser usada para anexar rapidamente o mouse ao estágio principal.</li>
		<li>Uma vez que o rato é fixado ao suporte principal e no tubo de retenção, siga os passos 3.1.1-3.1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. infusão de traçadores fluorescentes do CSF
<ol><li>
Cannulation agudo do CM
	<ol>
<li>Uma vez que o traçador já foi carregado na cânula antes de ser colocado na cisterna magna na etapa 1,6, defina a bomba de infusão para a taxa desejada e volume. Os paradigmas da infusão usados rotineiramente são 5-10 μL em 1-2 μL/min, mas estes parâmetros podem ser ajustados dependendo do experimento particular, ou do tamanho e da idade do animal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cannulation crônico do CM
	<ol>
<li>Antes de iniciar a sessão de imagem, siga as etapas 1.2-1.7 para experimentos agudos para preparar a linha de infusão para entregar os traçadores.</li>
		<li>Uma vez que a linha é preparada, usando uma braçadeira do hemostat cortou a extremidade selada da cânula crônica do CM. Retire a agulha da linha preparada no passo 4.2.1 e insira-a suavemente na cânula. Solte o grampo e usando a bomba da seringa, avance o traçador CSF na taxa de infusão desejada (por exemplo, 2 μL/min) para o experimento até que o traçador atinja a agulha implantada no CM. Atenção: se a agulha perfurar através da tubagem ao ligar a linha, retire a agulha, corte o segmento perfurado e repita este passo. Qualquer rasgo na tubulação PE10 causará um vazamento e afetará os resultados do experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Configurando a sessão de imagem
<ol><li>Baseado no Tracer fluorescente que está sendo infundido, determine o comprimento de onda da excitação e o tempo da exposição para cada canaleta. Escolha o tempo de exposição o mais curto necessário para visualizar o Tracer a fim maximizar a definição temporal da imagem latente do lapso de tempo. Este tempo de exposição será utilizado para todos os experimentos subsequentes com o objetivo de comparar o transporte do LCR entre diferentes animais. Nota: uma dica é usar o traçador na linha CM para ajustar o tempo de exposição. Embora esta seja uma primeira abordagem útil, isso deve ser otimizado ao longo do tempo.</li>
	<li>Escolha a duração do experimento e os intervalos nos quais as imagens serão adquiridas. Experimentos duram normalmente entre 30-60 min, dependendo de qual fase do transporte glicmfático é de interesse. Taxas de quadros de 1 frame/min e mais rápido são suficientes para a maioria dos experimentos.</li>
	<li>Defina o nome do arquivo e o diretório de salvamento.</li>
	<li>Se a imagem será coletada além da aquisição simultânea de outras variáveis (por exemplo, eletrocardiograma, pressão arterial, eletrofisiologia), o Macroscópio e a bomba podem ser programados para serem acionados com o software de aquisição de dados. Verifique se a função de disparo no Macroscópio está correta antes de passar para a próxima etapa.</li>
</ol>6. experimento de imagem óptica transcraniana
<ol><li>Inicie a infusão do traçador e a imagem ao mesmo tempo.</li>
	<li>Verific rotineiramente a cânula do CM e a tubulação PE10 para todos os sinais de um escape. Se houver qualquer vazamento de traçador no CM, os resultados deste experimento devem ser excluídos. Nota: se o traçador começar a acumular-se no cerebelo e não percorrer a via glicmfática da MCA, é provável que a cânula CM tenha sido injetada no cerebelo. Esses dados não devem ser incluídos.</li>
	<li>Para experimentos agudos, após a conclusão do experimento, retire o mouse do microscópio e verifique se ele ainda está adequadamente anestesiado. Rapidamente decapitar o mouse e colher o tecido cerebral. Imersão-fixar o cérebro em 4% paraformaldeído (PFA) durante a noite a 4 ° c.<ol>
<li>Para experimentos crônicos, uma vez que a imagem é concluída, retire a linha CM da cânula, lave com aCSF estéril e reseal a cânula CM com uma ponta de cauterização de alta temperatura. Retire o mouse do suporte da cabeça e devolvê-lo à sua gaiola. Repita esse processo até que outras imagens não sejam necessárias e siga a etapa 6,3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. análise de dados
Observação: as análises baseadas em MATLAB, como o rastreamento frontal do CSF, podem extrair grandes quantidades de dados quantitativos das frentes de traçador nesses conjuntos de dados de imagens10,22. No entanto, esses tipos de arquivos também podem ser facilmente importados e analisados em software de análise de imagem de código aberto como Fiji23.
<ol><li>Importe as pilhas de imagens para Fiji usando a ferramenta de importação de bio-formats. Essa função preservará os metadados de arquivo que inclui a resolução de tempo e pixel. Salve a pilha de imagens como um arquivo. TIFF.</li>
	<li>Desenhe manualmente uma região de interesse (ROI) ao redor do crânio ou da área de interesse usando a ferramenta de seleção de polígono. Por exemplo, na Figura 1G um ROI foi desenhado separadamente para o hemisfério ipsilateral e contralateral após uma lesão cerebral traumática. Certifique-se de adicionar o ROI no Gerenciador de ROI (Analyze > Tools > ROI Manager) e salvá-lo. Nota: o transporte do LCR pode ser quantificado de duas formas principais: 1) intensidade média de fluorescência ao longo do tempo ou 2) área de influxo expressa em percentagem do ROI ou área total (mm2) após ter aplicado um limiar. O último método (Figura 1h) será descrito nas próximas etapas.</li>
	<li>Defina o limiar no quadro com fluorescência máxima (Selecione Image &Gt; ajustar &Gt; Threshold...). Os métodos automatizados do limiar tais como Otsu são normalmente bons em detectar o Tracer do CSF. Aplique o limiar.</li>
	<li>Antes de ir para a frente, certifique-se de que em analisar &Gt; definir medições, a área de opções e a fração de área são selecionadas. Em seguida, no Gerenciadorde ROI , selecione mais > multimedida.</li>
	<li>Converta o valor de área% em mm2 usando o valor de área do ROI do output. Os valores da área% refletem a porcentagem da superfície cortical dorsal com o traçador do LCR.</li>
	<li>Plotar o influxo do traçador CSF em mm2 em função do tempo.</li>
</ol>

<ol><li>Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid+and+barriers+-+anatomic+and+physiologic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations.</a> Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).</li>
<li>Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Glymphatic+System%3A+A+Beginner%27s+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">The Glymphatic System: A Beginner's Guide.</a> Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes%2C+including+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+glymphatic+fluid+transport+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).</li>
<li>Da Mesquita,, S,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li>
<li>Gaberel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+glymphatic+perfusion+after+strokes+revealed+by+contrast-enhanced+MRI%3A+a+new+target+for+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis.</a> Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).</li>
<li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).</li>
<li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+optical+imaging+reveals+a+pathway+for+optimizing+the+delivery+of+immunotherapeutics+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain.</a> JCI Insight. 3 (23), (2018).</li>
<li>Kress, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+paravascular+clearance+pathways+in+the+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain.</a> Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).</li>
<li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+of+cerebrospinal+fluid+is+driven+by+arterial+pulsations+and+is+reduced+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension.</a> Nature Communications. 9 (1), 4878(2018).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li>
<li>Plog, B. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Glymphatic+System%5BTitle%5D)+AND+%22in+Central+Nervous+System+Health+and+Disease%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future.+Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Glymphatic System.</a> in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+pathway+for+waste+clearance+captured+by+contrast-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).</li>
<li>Davoodi-Bojd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+glymphatic+system+of+the+brain+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Modeling glymphatic system of the brain using MRI.</a> Neuroimage. 188, 616-627 (2019).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Body+Posture+on+Brain+Glymphatic+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).</li>
<li>Hablitz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glymphatic+influx+is+correlated+with+high+EEG+delta+power+and+low+heart+rate+in+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia.</a> Science Advances. 5 (2), (2019).</li>
<li>Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glymphatic+pathway+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">The glymphatic pathway in neurological disorders.</a> The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).</li>
<li>Mestre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4-dependent+glymphatic+solute+transport+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Monai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+reveals+glial+involvement+in+transcranial+direct+current+stimulation-induced+plasticity+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain.</a> Nature Communications. 7, 11100(2016).</li>
<li>Munk, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-B+Is+Required+for+Development+of+the+Glymphatic+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System.</a> Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hit+%26+Run%27+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+%28TBI%29+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li>
<li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li>
<li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434(2017).</li>
<li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li>
<li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li>
<li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós descrevemos um protocolo detalhado para executar a imagem latente Transcranial do CSF em ratos vivos usando macroscópios e traçadores fluorescentes comercialmente-disponíveis. Esta técnica é simples e minimamente invasiva, mas quantitativa. A imagem latente in vivo correlaciona bem com os métodos sensíveis tais como a contagem líquida do cintilação de traçadores rádio-etiquetados que incluem 3H-Dextran e 14C-Inulin após a entrega do cm, e com a quantificação ex vivo da seção coronal<sup class="x...

O líquido cefalorraquidiano (LCR) Bane o cérebro e a medula espinhal e está envolvido na manutenção da homeostase, fornecendo nutrientes e regulando a pressão intracraniana1. O CSF no espaço subarachnoid entra no cérebro através de uma rede de espaços perivasculares (PVS) que cercam artérias pial corticais e flui então para baixo ao longo das arteríolas penetrantes2. Uma vez no parênquima, as trocas de LCR com fluido intersticial (ISF), transportando metabólitos nocivos como amiloide-β (aβ) e proteínas tau agregam fora do cérebro através de intervalos de matéria branca de baixa resistência e espaços perivenosos2,3 . Este caminho é dependente de astroglial Aquaporin-4 (AQP4) canais e, portanto, tem sido denominado o glial-linfático (glymphatic) sistema4. Os produtos waste do neurópilo são cancelados finalmente do CSF-ISF através dos vasos linfáticos perto dos nervos cranianos e nas meninges para fora para os nós de linfa cervicais5. A falha deste sistema foi implicada em diversas doenças neurológicas tais como a doença de Alzheimer6,7, ferimento de cérebro traumático3, e curso isquêmico e hemorrágico8.
O transporte do CSF pode ser visualizado pela infusão de traçadores na cisterna magna (cm)9,10 e os estudos glicmfáticos no passado utilizaram principalmente a microscopia de dois fótons4,11,12, 12, 13, ressonância magnética (RM)14,15,16,17e ex vivo Imaging3,6,11, 18 para avaliar a cinética do traçador. A microscopia do dois-fotão é um método apropriado para a imagem latente detalhada de traçadores do CSF nos PVSs e o parênquima devido a sua definição espacial elevada, entretanto, tem um campo de visão estreito e exige uma janela craniana invasora ou um afinamento do crânio. A imagem latente ex vivo, em combinação com Immunohistochemistry, permite análises multinível que variam das únicas pilhas até o cérebro inteiro19. No entanto, o processo de fixação da perfusão que é necessário para observar o tecido pós-morte produz profundas mudanças na direção do fluxo do LCR e colapsa o PVS, alterando significativamente a distribuição e a localização dos traçadores12. Finalmente, quando MRI puder controlar o fluxo do CSF durante todo o cérebro murino e humano inteiro, falta a definição espacial e temporal do fluxo perivascular.
Uma técnica nova, imagem latente macroscópica transcraniana, resolve algumas destas limitações permitindo a imagem latente do largo-campo do transporte perivascular do CSF no córtice dorsal inteiro de ratos vivos. Este tipo de imagem é feito com um Macroscópio epifluorescente usando um cubo de filtro multibanda, fonte de luz LED sintonável, e câmera CMOS de alta eficiência10. Estes set-ups são capazes de resolver PVSs até 1-2 mm abaixo da superfície do crânio e pode detectar fluoróforos até 5-6 mm abaixo da superfície cortical, deixando o crânio totalmente intacto10. Os filtros e os diodos emissores de luz Multiband que podem rapidamente ajustar o comprimento de onda da excitação permitem o uso de fluoróforos múltiplos permitindo que o CSF seja etiquetado com os traçadores de pesos moleculars e de propriedades químicas diferentes na mesma experiência.
Este procedimento requer uma cirurgia simples, minimamente invasiva para expor o crânio e colocar uma placa de cabeça de peso leve para estabilizar a cabeça durante a sessão de imagem. Os traçadores podem ser entregues no cm sem perfurar no crânio ou penetrar o tecido cortical com pipetas ou cânulas9,20. Ambas as cânulas CM e placas de cabeça permanecem estáveis por vários dias a semanas e facilitam projetos experimentais mais complexos em comparação com a visualização clássica do ponto final. Este protocolo descreve como a imagem latente macroscópica Transcranial é usada para estudar a função glymphatic do sistema que segue a injeção aguda ou crônica do Tracer fluorescente do CSF no CM de ratos anestesiados/dormindo ou acordados.

<table><tbody><tr><td>0,25% Bupivacaína HCl</td><td></td><td></td><td>Universidade de Rochester Vivarium</td></tr><tr><td>100 &micro; L Seringa à prova de gás modelo 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td><td>Hamilton Company</td><td>81020</td><td></td></tr><tr><td>A-M Systems Cimento dental em pó</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9991371</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td></td><td></td><td>Universidade de Rochester Biotério</td></tr><tr><td>Clorexidina</td><td>Prevantics</td><td>B10800</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>ORCA Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cabeça</td><td>Universidade de Rochester</td><td>Sem catálogo #</td><td>Feito sob medida na oficina mecânica da Universidade de Rochester</td></tr><tr><td>Cautério de Alta Temperatura</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Acelerador Insta-set</td><td>Bob Smith Industries</td><td>BSI-151</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano - Fluriso</td><td>Vet One</td><td>502017</td><td>University of Rochester Vivarium</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td></td><td></td><td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td>Elmer's Products, Inc</td><td>Sem catálogo #, veja o link nos comentários</td><td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td></tr><tr><td>Fita cirúrgica Micropore</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PE10 - Polietileno .011" x .024" por pé, 100 ft. contínuo</td><td>Braintree Scientific</td><td>PE10 100 FT</td><td></td></tr><tr><td>Bomba 11 Elite Infusão Apenas Seringa Dupla</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>POMADA VET PURALUBE</td><td>Dechra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puritan PurSwab Bastões de Limpeza com Ponta de Algodão</td> Microscópio de Zoom Macro de Pesquisa <td>Fisher Scientific</td><td>22-029-553</td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Suporte de Cabeça Simples (para ratos)</td> <td>Narishige International USA Inc</td><td>MAG-1</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de uso único, BD Medical</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de preparação de álcool estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>LED ajustável</td><td>PRIOR Lumen 1600-LED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td></td><td></td><td>University of Rochester Vivarium</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

O fluxo de líquido cefalorraquidiano (LCR) em roedores tem sido largamente estudado com quantificação ex vivo de Traçadores. As técnicas tais como a microscopia do dois-fotão e a imagem latente de ressonância magnética (MRI) permitiram in vivo a quantificação do fluxo do CSF mas são limitadas por volumes reduzidos da imagem latente e pela baixa definição espacial, respectivamente. O trabalho recente constatou que o LCR entra no parênquima cerebral através de uma rede de espaços perivasculares em torno das artérias piais e penetrantes do córtex do roedor. Esta entrada perivascular do CSF é um excitador preliminar do sistema glymphatic, um caminho implicado no afastamento de solutos metabólicos tóxicos (por exemplo, amyloid-β). Aqui, nós ilustramos uma técnica macroscópica nova da imagem latente que permita o tempo real, imagem latente mesoscópicos de traçadores fluorescentes do CSF através do crânio intacto de ratos vivos. Este método minimamente invasivo facilita uma infinidade de experimentos experimentais e permite o teste único ou repetido da dinâmica do LCR. Os macroscópios têm alta resolução espacial e temporal e seu grande pórtico e distância de trabalho permitem a criação de imagens durante a execução de tarefas em dispositivos comportamentais. Esta aproximação da imagem latente foi validada usando a imagem latente do dois-fotão e as medidas da fluorescência obtidas desta técnica correlacionam fortemente com a fluorescência ex vivo e a quantificação de Tracers rádio-etiquetados. Neste protocolo, nós descrevemos como a imagem latente macroscópica Transcranial pode ser usada para avaliar o transporte glymphatic em ratos vivos, oferecendo uma alternativa acessível às modalidades mais caras da imagem latente.

O afluxo do CSF é imaged em um Macroscópio epifluorescente (Figura 1a), que permita a imagem latente mesoscópicos do transporte do Tracer do CSF no córtice murino. A placa da cabeça do inteiro-crânio permite o visualização dos ossos nasais rostral, dos ossos frontais e parietal no centro, e da parcela rostral do osso interparietal caudalmente (Figura 1b). Durante a imagem, as suturas nasofrontal, sagital, coronal e lambdóide podem ser prontamente identificadas (...

A imagem latente ótica de Transcranial permite a imagem latente do largo-campo do transporte do líquido cerebrospinal no córtice de ratos vivos através de um crânio intacto.

In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Esta nova técnica para imagens mesoscópicas em tempo real de traços florescente de CSF através do crânio intacto de ratos vivos pode ser usada para avaliar o transporte glifático. A principal vantagem é que essa técnica permite medições dinâmicas de rastreadores intracisternais in-vivo a uma fração do custo de outras modalidades de imagem. Os procedimentos necessários para colocar a placa da cabeça na cisterna magna cânula são simples e minimamente invasivos, mas exigem que a prática seja realizada corretamente.A demonstração visual das etapas críticas deste método é necessária para maximizar a qualidade da imagem e permitir comparações reprodutíveis entre diferentes camundongos e grupos experimentais. Depois de confirmar a falta de resposta ao dedo do pé, molhar o pescoço e a cabeça com água estéril e raspar a pele umedeçada. Limpe a pele exposta com um cotonete de álcool para remover qualquer cabelo residual e coloque o mouse em uma moldura estereotática em cima de uma almofada controlada pela temperatura.Aplique pomada nos olhos dos animais e limpe a pele exposta com um cotonete de Clorhexidine. Após 2 minutos, remova a Clorhexidine com um lenço de álcool e aplique uma solução de iodona. Quando a iodota tiver injetado analgesia subcutânea no topo do crânio e pescoço.Começando na parte do pescoço que cobre a crosta occipital, faça um corte médio na pele sobreposta continuando rostrally em direção à linha intraorbital. Estenda a incisão lateralmente até a borda onde o músculo temporal insere no crânio e remova toda a pele da incisão fusiforme para expor os ossos frontal e parietal. Irrigar o crânio com soro fisiológico estéril, e use cotonetes de algodão para limpar a superfície até que esteja livre de detritos e cabelos.Após inserir a cisterna magna cânula aplique uma mistura de cimento dental e cola cianoacrilato no lado ventral da placa da cabeça ao redor da borda. Coloque a placa da cabeça sobre o crânio para que a borda anterior da placa se alinhe com a ponta posterior do osso nasal e a borda posterior se alinhe com o aspecto anterior do osso interparietal certificando-se de que a sutura sagital esteja centrada e reta em relação à janela. É importante garantir que a placa da cabeça esteja presa e que não obstrua o campo de visão da cisterna magna cannulation.Use algumas gotas de acelerador de cola para fixar a posição da placa da cabeça e preencher quaisquer lacunas restantes com a mistura de cimento. Cole a cisterna magna cânula na placa da cabeça e use a placa da cabeça para colocar o mouse no suporte da cabeça em uma posição fixa. Coloque cuidadosamente o mouse e a bomba de infusão presa à cânula em um carrinho para transporte ao macroscópio e coloque o porta-cabeça no palco do macroscópio.Certifique-se de que a linha da bomba de seringa até a cisterna magna cânula não está esticada e que não tem dobras. Observe a taxa respiratória e coloração rosa das membranas mucosas para confirmar uma boa oxigenação. Ligue a câmera do macroscópio e o diodo emissor de luz e inicie o modo ao vivo.Ajuste a ampliação do campo de imagem para que a sutura nasofrontal na parte superior do campo e a sutura lambdoid na parte inferior possam ser claramente visualizadas. Uma vez no lugar, tape o suporte da cabeça para o estágio do macroscópio e concentre o macroscópio no crânio exposto até que o plano focal esteja localizado nas laterais laterais dos ossos parietal posteriores às suturas coronais. Para a infusão do rastreador CSF, ajuste a bomba de infusão na taxa e volume apropriados e defina o comprimento de onda de excitação apropriado e o tempo de exposição do rastreador para cada canal.Em seguida, verifique se a função de acionamento no macroscópio está correta antes de iniciar simultaneamente a infusão do rastreador e a imagem. Durante a imagem, as suturas naso frontal, sagital, coronal e lambdoid podem ser prontamente identificadas. Uma vez que o rastreador CSF tenha sido infundido na cisterna magna, a fluorescência do rastreador é observada pela primeira vez em grandes piscinas de CSF subaracnóide na cisterna olfactofrontal e na cisterna quadrigeminal perto do recesso pineal e eventualmente em torno das artérias cerebrais médias.Os rastreadores CSF então entram em seu cérebro ao longo de espaços vasculares peri dos ramos de peal cortical da artéria cerebral média. Imagens de transporte csf após lesão cerebral traumática revelam rastreador inicialmente na cisterna olfactofrontal, mas o fluxo glicênico ao longo dos espaços perivasculares cortical é completamente abolido na lateral da lesão. A análise quantitativa nas imagens in vivo demonstra que a área de influxo ipsilateral é reduzida quase um terço em comparação com o hemisfério contralateral.Para evitar artefatos de movimento e as mudanças no plano focal lembre-se de fixar corretamente a placa da cabeça e o porta-cabeça e verificar o nível de anestesia do animal. Após o experimento, os resultados de imagem in vivo podem ser validados quantificando ainda mais a penetração do rastreador usando a real Esta técnica permite o estudo do sistema glicêmático de forma fisiológica e minimamente invasiva e pode ajudar a abordar questões futuras sobre hidrodinâmica CSF em saúde e doenças.

in-vivo-imaging-cerebrospinal-fluid-transport-through-intact-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

Um protocolo minimamente invasiva para estabilizar a coluna vertebral do mouse e executar...

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

Fonte: Bisht, K., et al. Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuroimune em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra imagens de fluorescência da dinâmica neuroimune em um camundongo transgênico com implante de crânio. A estabilidade vascular e neuronal é visualizada juntamente com as alterações microgliais dinâmicas, refletindo as respostas imunes à atividade neuronal.

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Fonte: Sweeney, A. M., et al. Imagem in vivo do transporte de líquido cefalorraquidiano através do crânio intacto do camundongo usando macroscopia de fluorescência. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o processo de visualização do fluxo do líquido cefalorraquidiano (LCR) no cérebro de um camundongo usando imagens de fluorescência. Um traçador fluorescente é injetado na cisterna magna (MC), permitindo que seu movimento com o LCR seja rastreado através dos espaços subaracnóideo e perivascular.

Imagens in vivo do transporte de líquido cefalorraquidiano em um cérebro de camundongo usando macroscopia de fluorescência

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

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Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

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Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

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