Name: Ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda ensaios bioquímicos in vitro com rótulos de biotina para estudar interações proteína-ácido nucleico. Este método robusto e acessível permite realizar experimentos reprodutíveis em um dia, sem equipamentos especiais.

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Agradecemos P. Jeremy Wang (Universidade da Pensilvânia) por edições e discussões úteis. Agradecemos também a Sigrid Eckardt pela edição de idiomas. K. Z. foi apoiado pela chave nacional R & D programa da China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) e National natural Science Foundation da China (31771653). L. Y. foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81471502, 31871503) e programa inovador e empreendedor da província de Jiangsu. J. N. foi apoiado pelo Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. foi apoiado por concessões da Fundação Nacional da ciência natural de China (31771588) e do plano do Talent da juventude 1000.

1. preparação de proteínas
<ol><li>Construções de expressão MEIOB e MOV10<ol><li>Gerar expressão de cDNA constrói mouse de codificação MEIOB-A, C e e (Figura 1A) e MOV10.<ol>
<li>Ajuste as reações da reacção em cadeia do polymerase (PCR) para cada fragmento. Misture 1 μL de cDNA do rato (a partir de C57BL/6 mouse testis), 1 μL de dNTP, 2 μL de 10 μM de primer para a frente, 2 μL de primer reverso de 10 μM, 1 μL de DNA polimerase, 25 μL de tampão 2x PCR e 18 μL de H2o duplo destilado (DDH2o) em a final volume de 50 μL. Nota: os primers para a amplificação dos fragmentos do gene MeioB e Mov10 estão listados na tabela 1.
</li>
			<li>Realize reações de PCR utilizando os seguintes programas: 95 ° c por 5 min, 35 ciclos de aquecimento a 95 ° c por 15 s, recozimento a 64 ° c para 15 s, extensão a 72 ° c por 20 s (2 min para extensão total de comprimento MOV10) e prolongamento final a 68 ° c por 7 min. Nota: Use o par da primeira demão MEIOB-E (F1) e MEIOB-E-MUT (R1) e MEIOB-E-MUT (F2) e MEIOB-E (R2) para amplificar dois segmentos que contêm a seqüência do mutante dentro de uma seqüência de sobreposição nos 3 ' e 5 ' extremidades, respectivamente, para gerar um molde do</li>
		</ol></li>
		<li>Analise o ADN amplificado do PCR pela electroforese do gel, corte a faixa do tamanho exigido do gel rapidamente uma lâmpada UV, e coloc em um tubo de centrifugação. Nota: os tamanhos de produto esperados visíveis no gel de agarose para MEIOB-A é 536 BP, MEIOB-C é 296 BP, MEIOB-E são 312 BP e 229 BP, e MOV10 é 3015 BP.</li>
		<li>Purify o ADN do PCR com um jogo da extração do gel que segue o protocolo do fabricante.<ol>
<li>Adicione um volume igual de dissolver o amortecedor no tubo de centrifugação da etapa 1.1.2 e derreta o gel em um banho de água de 50-55 ° c por 5-10 minutos, assegurando-se de que as partes do gel derretem completamente. Centrifugue brevemente para recolher todas as gotas da parede do tubo. Nota: a concentração de massa/volume do gel e o tampão de dissolução é de 1 mg/μL.</li>
			<li>Coloque a coluna de adsorção no tubo de coleta, transfira a solução contendo o fragmento de gel dissolvido para a coluna de adsorção e centrifugue a 12.000 x g por 2 min.</li>
			<li>Descarte o filtrado na parte inferior dos tubos de coleta. Adicionar 600 μL do tampão de lavagem à coluna, centrifugar a 12.000 x g durante 1 min e descartar o filtrado.</li>
			<li>Repita a etapa 1.1.3.3 uma vez.</li>
			<li>Coloque a coluna de volta no tubo de recolha e centrifugue a 12.000 x g durante 2 min para remover todo o tampão de lavagem restante.</li>
			<li>Coloque a coluna de adsorção em um tubo de centrífuga 1,5 mL esterilizado, adicione 50 μL de ddH2o ao centro da coluna de adsorção e centrifugue a 12.000 x g durante 1 min. Meça a concentração de ADN do eluato utilizando Espectrofotômetro.</li>
		</ol></li>
		<li>Digestão da limitação dos plasmídeos<ol>
<li>Digest pGEX-4T-1 vetor com BamHI e NotI. Para tal, misturar 4 μg de pGEX-4T-1, 5 μL de tampão de síntese 10x, 1 μL de BamHI e 1 μL de NotI e ddH2o para um volume de reacção final de 50 μL. Incubar a 37 ° c por 2 h.</li>
			<li>Vetor pRK5 Digest com BamHI e XhoI misturando 4 μg de vetor pRK5, 5 μL de buffer Digest 10x, 1 μL de BamHI e 1 μL de XhoI e ddH2o para um volume de reação final de 50 μL. Incubar a 37 ° c por 2 h.</li>
		</ol></li>
		<li>Analise o ADN do vetor pela electroforese do gel, corte a faixa desejada do tamanho do gel rapidamente com um bisturi uma lâmpada UV e coloc o em um tubo de centrifugação.</li>
		<li>Purify o ADN do vetor com um jogo da extração do gel como 1.1.3 que seguem a instrução do fabricante. Nota: o comprimento dos plasmís linearizados: pGEX-4T-1, 4,4 KB; pRK5, 4,7 KB.</li>
		<li>Configure uma reação de ligadura recombinante padrão combinando 0, 3 pmol de vetor linearizado, 0, 6 pmol de fragmento de cDNA, 2 μL de ligase e 4 μL de tampão de ligase 5x e ddH2O em um volume de reação final de 10 μL. Observação: clone MEIOB-A, C e e em um vetor pGEX-4T-1 e MOV10 em um vetor pRK5.</li>
		<li>Incubar a mistura a 37 ° c durante 30 min, e depois resfrie a reacção imediatamente durante 5 min no gelo. Transforme os plasmídos recombinantes MEIOB em bactérias BL21 e MOV10 plasmídos recombinantes em bactérias DH5α. Observação: Verifique todas as construções recombinantes por sequenciamento Sanger.</li>
		<li>Prepare estoques de glicerol de culturas bacterianas contendo plasmíos recombinantes verificados adicionando um volume igual de 50% de glicerol a culturas líquidas e armazene a-80 ° c. Nota: para cada experimento subsequente, a sequência de bactérias de estoques de glicerol em uma placa de agar fresco e usar uma única colônia para a expansão, conforme descrito na etapa 1,2.</li>
	</ol></li>
	<li>Extratos de proteínas MEIOB de bactérias<ol>
<li>Escolha uma colônia de cada cepa BL21 transfected com o plasmídeo vazio ou recombinante pGEX-4T-1 verificado por sequenciamento e inoculado em 3 mL LB contendo 100 μg/mL de ampicilina. Cresça durante a noite em 37 ° c com agitação em 220 rpm.</li>
		<li>Inocular 300 mL LB contendo 100 μg/mL de ampicilina a partir de 3 mL de cultura durante a noite (a partir do passo 1.2.1). Cresça as culturas com agitação em 37 ° c para 2 h até que o OD600 alcangue 0.5-1.0.</li>
		<li>Induzir a expressão protéica pela adição de isopropílico beta-D-tiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 0,2 mM. Incubar as culturas para um adicional de 3 h com agitação em 180 rpm e 18 ° c.</li>
		<li>Centrifugue a cultura bacteriana a 3.500 x g e 4 ° c durante 20 min.</li>
		<li>Ressuscita o pellet em 20 mL de tampão de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco gelado (DPBS). SONICATE a suspensão bacteriana no gelo por 25 ciclos em curto 10 s rajadas (potência de saída 20%) seguido por 2-3 s descansando no gelo.</li>
		<li>Centrifugar o lisado a 12.000 x g e 4 ° c durante 15 min. Transfira todo o sobrenadante para um tubo fresco.</li>
		<li>Pré-lavagem de contas.<ol>
<li>Adicione 300 μL de grânulos de glutationa-Sepharose a um tubo de 15 mL fresco e lave os grânulos com 10 mL de tampão PBS gelado.</li>
			<li>Centrifugador em 750 x g e 4 ° c por 1 minuto para pellet as contas e descartar a solução de lavagem.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicione o lisado aos grânulos lavados e incubar a 4 ° c por 2 h. centrifugador em 750 x g e 4 ° c por 1 minuto para pelota os grânulos. Enxágüe os grânulos em 10 mL de PBS frio-gelado 8x.</li>
		<li>Elute os grânulos com 1 mL do amortecedor da eluição (glutationa de 10 milímetros no Tris-HCl de 50 milímetros em pH 8,0) 6x, incubando em 4 ° c por 10 minutos antes de cada etapa da eluição. Centrifugador em 750 x g e 4 ° c por 1 minuto para pelota os grânulos. Colete e pool as 6 frações.</li>
		<li>Transfira as proteínas eluída para um filtro centrífugo e concentre-se por centrifugação a 7.500 x g para obter um volume final de 100-200 μl.</li>
	</ol></li>
	<li>MOV10 extratos proteicos de células HEK293T<ol>
<li>Expressar transientemente as proteínas MOV10 em células HEK293T cultivadas.<ol>
<li>Prepare o plasmídeo MOV10-pRK5 em uma concentração > 500 ng/μL.</li>
			<li>Sementes HEK293T células em pratos de 15 cm. Quando a densidade celular atinge ~ 70%-90%, substitua o meio de cultura celular com o meio de águia modificada de Dulbecco fresco (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.</li>
			<li>Para um transfection, diluir 60 μg do ADN do plasmídeo MOV10-pRK5 em 3 mL do meio de soro reduzido, a seguir adiciona 120 μL do reagente do potenciador do transfection, e mistura-se bem.</li>
			<li>Em um tubo separado diluir 90 μL do reagente do transfection com 3 mL do meio de soro reduzido (sem penicilina-Streptomycin) e misture bem.</li>
			<li>Adicione o DNA diluído a cada tubo de reagente de transfecção diluído. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.</li>
			<li>Adicione a mistura de transfecção para a cultura da célula e células de cultura para ~ 36-48 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Após 36-48 h, colete células de cada placa em um tubo de 50 mL. Centrifugador a 500 x g durante 5 min a 4 ° c. Lave cada pellet com 10 mL de PBS gelada e colete células por centrifugação a 500 x g por 5 min a 4 ° c.</li>
		<li>Ressuscitem o pellet em 3 mL de tampão de lise celular contendo um coquetel de inibidor de protease livre de ácido ehylenediaminetetraacético (EDTA). Incubar por 30 min no gelo. Centrifugar o lisado a 20.000 x g e 4 ° c durante 20 min.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de esferas magnéticas antibandeira por prato de células num tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Lave as esferas magnéticas 2x com tampão K150 (50 mM HEPES em pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).<ol>
<li>Ressuscita os grânulos magnéticos em 1 mL de tampão K150 Ice-Cold.</li>
			<li>Incubar os grânulos magnéticos por 2 minutos a 4 ° c com rotação suave e pellet os grânulos magnéticos com a ajuda de um ímã. Retire e descarte o sobrenadante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicione os grânulos magnéticos ao sobrenadante do lisado da pilha da etapa 1.3.3 e incubar em 4 ° c para 2 h.</li>
		<li>Lave a proteína ligada contas magnéticas 3x com K150 buffer, em seguida, 2x com K150 contendo 250 mM NaCl, em seguida, 3x com K150 buffer como 1.3.5.</li>
		<li>Ressuscita os grânulos em 300 μL de tampão de eluição de FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl a pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glicerol), adicione o PEPTÍDEO de Flag a uma concentração final de 0,5 μg/μl, e incubar com grânulos em um rotador a 4 ° c por 1 h , em seguida, pellet os grânulos magnéticos com a ajuda de um ímã.</li>
		<li>Colete o sobrenadante que contém as proteínas MOV10 eluidas, determine a concentração e armazene em-80 ° c para uso futuro.</li>
	</ol></li>
</ol>2. preparação de ácido nucleico
<ol><li>Comprar DNA e RNA oligonucleotídeos (oligos) com ou sem rótulos de biotina de uma fonte adequada. Diluir cada oligo em ddH RNase-livre2o a 20 μm e mantê-lo em-80 ° c para o uso futuro. Nota: as sequências de oligo de substratos de DNA/RNA utilizadas neste estudo estão listadas na tabela 2.</li>
	<li>Prepare a seguinte mistura para a reação de recozimento de RNA duplo-encalhado (dsRNA) para o ensaio de atividade de MOV10 helicase: misture 60 mM N-2-hidroxietil-piperazina-N-etano-ácido sulfónico (HEPES) em pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 O em um volume de reação final de 20 μl.</li>
	<li>Os oligos do RNA de Anneal para dar forma ao duplex do RNA aquecendo uma mistura da costa superior biotina-etiquetada (2 μm, concentração final) e um 1,5-fold de sua costa inferior complementar sem rótulo no amortecedor do recozimento (etapa 2,2) em 95 ° c por 5 minutos, e refrigeram-na então lentamente ao quarto temperatura (RT).</li>
</ol>3. ensaios bioquímicos in vitro
<ol><li>EMSA e reações enzimáticas<ol>
<li>Para o ensaio MeioB EMSA, misture 50 mm Tris HCl em pH 7,5, 2 mm MgCl2, 50 mm NaCl, 10 mm EDTA, 2 mm ditiotreitol (DTT), 0, 1% NP-40, 0,8 mm (ou outras concentrações relevantes, como mostrado na Figura 2 e Figura 3) proteína MeioB, e 10 Nm oligonucleotídeos com rótulo de biotina e DDH2O num volume de reacção final de 20 μl. Incubar em RT por 30 min, e adicionar 5x Stop buffer (125 mM EDTA, 50% glicerol) para parar a reação.</li>
		<li>Configure as reações de atividade da nuclease de MEIOB, conforme descrito na etapa 3.1.1, mas sem a adição de EDTA de 10 mM.</li>
		<li>Para o ensaio de atividade MOV10 helicase, misture 50 mm Tris-HCl em pH 7,5, 20 mm koac, 2 mm MgCl2, 0, 1% NP-40, 1 mm DTT, 2 U/μL de inibidor de RNase, 10 Nm substrato de RNA com rótulo de biotina, 2 mm trifosfato de adenosina (ATP), 100 nm RNA armadilha, e 20 ng de proteína MOV10 e DDH > 2O em um volume de reação final de 20 μl. Incubar a mistura de reacção a 37 ° c durante 10 min, 30 min e 60 min. Adicione o tampão de paragem 5x para interromper a reacção. Nota: a armadilha do RNA, um oligo biotina-unlabeled com seqüência, complementaridade ao oligo etiquetado, que impede o dsRNA desenrolado do recozimento outra vez.</li>
	</ol></li>
	<li>Géis de poliacrilamida<ol>
<li>Lave as placas de gel (16 cm x 16 cm) e pentes de 1,5 mm. Monte as unidades da electroforese do gel.</li>
		<li>Para preparar um gel de poliacrilamida 10% nativa, misture 14 mL de ddH2O, 1,25 ml de 10x Tris-ácido BÓRICO-EDTA (TBE), 8,3 ml de acrilamida a 30%, 1,25 ml de glicerol de 50%, 187,5 μL de persulfato de amônio recém-preparado a 10% (APS) e 12,5 μL de tetrametilethylenediamine (TEMED).</li>
		<li>Para preparar um gel de poliacrilamida 20% nativa, misture 5,5 mL de ddH2O, 1,25 ml de 10x tbe, 1,25 ml de glicerol de 50%, 16,7 ml de acrilamida a 30%, 187,5 ΜL de APS a 10% e 12,5 ΜL de TEMED.</li>
		<li>Despeje a solução de acrilamida imediatamente para o gel e insira o pente. Deixe a mistura polimerizar por aproximadamente 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Funcionamento do gel<ol>
<li>Retire o pente, encha os tanques com o amortecedor running da electroforese (0.5 x TBE).</li>
		<li>Enxágüe os poços da amostra com o amortecedor de 0.5 x TBE, a seguir Pre-Run o gel em 100 V no gelo por 30 minutos substitua o amortecedor running com 0.5 x novo TBE.</li>
		<li>Carregar 20-25 μL de amostras em cada poço.</li>
		<li>Use um gel nativo da acrilamida de 10% para o ensaio de EMSA e um gel nativo da acrilamida de 20% para os ensaios enzimáticos. Funcione a electroforese em 100 V no banho de gelo até que o marcador azul do bromofenol migrou ao quarto inferior do gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Desmontar as placas de gel, aparar o gel, removendo poços de carga e pistas não utilizadas. Coloque o gel em 0,5 x tampão TBE.</li>
	<li>Corte o papel de filtro e a membrana de nylon ao tamanho do gel. Pré-molhe o papel de filtro limpo e a membrana de nylon.</li>
	<li>Monte a pilha para transferência.<ol>
<li>Coloque a membrana pré-molhada no papel de filtro pré-molhado.</li>
		<li>Coloque o gel na membrana.</li>
		<li>Cubra o gel com outra camada de papel de filtro pré-molhado.</li>
		<li>Retire todas as bolhas de ar rolando uma pipeta limpa do centro para a borda.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira as amostras do gel para a membrana em um aparelho eletroforético semiseco a 90 mA por 20 min.</li>
	<li>Pare a transferência e, em seguida, seque a membrana em um novo papel de filtro por 1 min.</li>
	<li>Crosslink as amostras irradiando a membrana em 120 MJ/cm2 para 45-60 s em um chapéu cabeado da UV-luz equipado com os bulbos do nanômetro 254 (função do Crosslink do automóvel). Ar secar a membrana em RT por 30 min.</li>
	<li>Detecção de quimioluminescência<ol>
<li>Protocolo 1: Use um volume padrão de kit de detecção de ácido nucleico quimioluminescente comercial.<ol>
<li>Adicionar 20 mL de tampão de bloqueio para a membrana e incubar por 15-30 min com agitação suave em um rotador em 20-25 rpm.</li>
			<li>Prepare a solução tampão conjugada/bloqueadora adicionando 66,7 μL estabilizado streptavidin-horseradish peroxidase conjugada a 20 mL de tampão de bloqueio.</li>
			<li>Remova suavemente o buffer de bloqueio e substitua-o por buffer de conjugado/bloqueio. Incubar por 15 min em um rotador em 20-25 rpm.</li>
			<li>Lave a membrana 4x com agitação em 40-45 rpm por 5 min cada.</li>
			<li>Adicione 30 mL de tampão de equilíbrio de substrato à membrana. Incubar a membrana durante 5 min com agitação a 20-25 rpm.</li>
			<li>Prepare a solução de trabalho da carcaça adicionando 6 mL da solução do luminol/potenciador a 6 mL da solução estável do peróxido. Evite a luz.</li>
			<li>Cubra toda a superfície da membrana com a solução de trabalho do substrato e incubar por 5 min.</li>
			<li>Digitalizar a membrana em um sistema de imagem quimioluminescente para 1-3 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Protocolo 2: Use o kit de detecção de ácido nucleico químico diluído comercial 2x e siga as etapas 3.10.1.1-3.10.1.8.</li>
		<li>Protocolo 3: utilizar reagentes autofabricados6.<ol>
<li>Prepare o tampão de bloqueio: misture 0,1 M Tris-HCl em pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2e 3% de albumina de soro de bovinos fração V. AP 7,5 tampão: misture 0,1 m Tris-HCl em pH 7,5, 0,1 m NaCl e 2 mm MgCl2. Tampão do AP 9,5: Misture o Tris-HCl de 0,1 M em pH 9,5, em 0,1 M NaCl, e em 50 milímetros MgCl2. Tampão TE: misture 10 mM Tris-HCl a pH 8,0, 1 mM EDTA a pH 8,0.</li>
			<li>Mergulhe a membrana no tampão de bloqueio a 30 ° c por 1 h.</li>
			<li>Adicionar 8,5 μL de fosfatase alcalina de estreptavidina a 10 mL de tampão AP 7,5. Agitar a membrana suavemente nesta solução em RT por 10 min. Em seguida, lave a membrana 2x em 15 mL de tampão AP 7,5 por 10 min.</li>
			<li>Lave a membrana mais uma vez em 20 mL de tampão AP 9,5 por 10 min. Adicione 20 mL de tampão TE para interromper a reação.</li>
			<li>Adicionar 7,5 mL de solução de desenvolvimento para a membrana, e digitalizar a membrana em um sistema de imagem quimioluminescente para 1-3 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Luo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIOB+exhibits+single-stranded+DNA-binding+and+exonuclease+activities+and+is+essential+for+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination.</a> Nature Communications. 4, 2788(2013).</li>
<li>Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+proteins+MEIOB+and+SPATA22+cooperatively+associate+with+the+single-stranded+DNA-binding+replication+protein+A+complex+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks.</a> Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses é declarado.

A investigação de interações ácido proteína-nucleico é fundamental para a nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a diversos processos biológicos. Por exemplo, o MeioB é uma proteína específica do testis essencial para a meiose e fertilidade em mamíferos25,26,27. MeioB contem um domínio do OB que se ligue ao ADN single-encalhado e exiba 3 ' a 5 ' a atividade26do de, que se relaciona diret...

As interações ácido proteína-nucleico estão envolvidas em muitos processos celulares essenciais, como reparo de DNA, replicação, transcrição, processamento de RNA e tradução. Interações protéicas com seqüências de DNA específicas dentro da cromatina são necessárias para o controle apertado da expressão gênica no nível transcricional1. A regulamentação pós-transcripcional precisa de inúmeras codificadores e RNAs não codificantes requer interações extensas e complicadas entre qualquer proteína e RNA2. Essas camadas de mecanismo regulador de expressão gênica compreendem uma cascata de eventos intermoleculares dinâmicos, que são coordenados por interações de fatores de transcrição/epigenética ou proteínas de ligação de RNA com seus alvos de ácido nucleico, bem como interações proteína-proteína. Para dissecar se proteínas in vivo estão direta ou indiretamente associadas a ácidos nucleicos e como tais associações ocorrem e culminam, ensaios bioquímicos in vitro são conduzidos para examinar a afinidade vinculativa ou atividade enzimática de proteínas de interesse em substratos projetados de DNA e/ou RNA.
Muitas técnicas foram desenvolvidas para detectar e caracterizar complexos ácidos-proteicos nucleicos, incluindo o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA), também denominado ensaio de retardação de gel ou ensaio de desvio de banda3,4,5 . EMSA é um método bioquímico versátil e sensível que seja amplamente utilizado estudando o emperramento direto das proteínas com ácidos nucleico. A EMSA conta com a mudança eletroforética em gel em bandas, que são rotineiramente visualizadas usando quimioluminescência para detectar rótulos de biotina6,7, a fluorescência das etiquetas de fluoróforo8,9, ou por autoradiografia das etiquetas radioactivas 32P10,11. Outros fins de estudos bioquímicos são a identificação e caracterização da atividade de processamento de ácido nucleico de proteínas, tais como reações à base de nuclease para avaliar os produtos de clivagem de substratos de ácido nucleico12, 13 anos de , 14 e ensaios de desenrolamento de estrutura de DNA/RNA para avaliação das atividades de helicase15,16,17.
Em tais ensaios de atividade enzimática, os ácidos nucleicos com rótulo radioisótopo ou fluoróforo são freqüentemente usados como substratos devido à sua alta sensibilidade. A análise de radiografias de reações enzimáticas que envolvem os radiofármacos 32P etiquetados foi encontrada para ser sensível e reprodutível18. No entanto, em um número crescente de laboratórios no mundo, o uso de radioisótopos é restrito ou mesmo proibido devido aos riscos de saúde associados à exposição potencial. Além das preocupações com biossegurança, outras desvantagens são o necessário equipamento necessário para conduzir o trabalho com radioisótopos, necessária licença de radioatividade, meia-vida curta de 32P (cerca de 14 dias), e deterioração gradual da qualidade da sonda devido a Radiolise. Assim, métodos não-isotópicas alternativos foram desenvolvidos (ou seja, a rotulagem da sonda com fluoróforos possibilita a detecção por imagens fluorescentes19). No entanto, um sistema de imagem de alta resolução é necessário ao usar sondas com rótulo cDNAs. A biotina, uma etiqueta comumente usada, se liga prontamente a macromoléculas biológicas, como proteínas e ácidos nucleicos. O sistema de biotina-streptavidin Opera eficientemente e melhora a sensibilidade da deteção sem aumentar o fundo não-específico20,21. Além da EMSA, a biotina é amplamente utilizada para a purificação de proteínas e o RNA pull-down, entre outros22,23,24.
Este protocolo utiliza com sucesso os ácidos nucleicos rotulados com biotina como substratos para ensaios bioquímicos in vitro que incluem a EMSA, além de reações enzimáticas em que a biotina não foi comumente utilizada. O domínio MeioB OB é construído e dois mutantes (truncamento e mutação de ponto) são expressos como proteínas de fusão GST25,26,27, bem como a proteína de fusão de bandeira recombinante do mouse MOV1016. Este relatório destaca a eficácia deste protocolo combinado para a purificação da proteína e ensaios biotina-etiquetados para finalidades experimentais variadas.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Alemanha</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem quimioluminescente</td><td>Tanon, China</td><td>5200</td><td></td></tr><tr><td>Sonifer digital</td><td>Branson, EUA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 Watts; 50/60 HZ</td></tr><tr><td>Mata-borrão eletroforético semi-seco</td><td>Hoefer, EUA</td><td>TE77XP</td><td></td></tr><tr><td>Revólver de Tubo</td><td>Cristal, EUA</td><td>3406051</td><td></td></tr><tr><td>Reticulador de luz UV</td><td>UVP, EUA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Filtro Centrífugo&nbsp;</td><td>Milipore, EUA</td><td>UFC801096</td> Membrana de nylon de <td>4 ml/10 K</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>TG263940A</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura tratado com TC</td><td>Corning, EUA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Prato de Cultura Tratado com TC</td><td>Corning, EUA</td><td>430597</td><td>150 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de microtubos</td><td>AXYGEN, EUA</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos</td><td>Corning, EUA</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td><forte>Reagentes&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ampicilina</td><td>SunShine Bio, China</td><td>8h288h28</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 contas magnéticas</td><td>Sigma, EUA</td><td>M8823</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>591136 Kit de</td><td></td></tr><tr><td>desenvolvimento de cor de fosfatase alcalina BCIP / NBT</td><td>Beyotime, China</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>CelLyticTM M Cell Lysis Reagente&nbsp;</td><td>Sigma, USA</td><td>107M4071V</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II kit de clonagem de uma etapa&nbsp;</td><td>Vazyme, China</td> Kit de detecção de ácido nucleico quimioluminescente <td>C112</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>T1269950</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, EUA</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>tampão DPBS</td><td>Gibco, EUA</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>AM9260G</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease livre de EDTA</td><td>Roche, EUA</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de plasmídeo Maxi EndoFree&nbsp;</td><td>Vazyme, China</td><td>&nbsp; DC202</td><td></td></tr><tr><td>FastPure Gel Mini Kit</td><td>de Extração de DNA Vazyme, China</td><td>DC301-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, EUA</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FLAG peptídeo</td><td>Sigma, EUA</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma, EUA</td><td>SHBK3676</td><td></td></tr><tr><td>GST Bulk Kit</td><td>GE Healthcare, EUA</td><td>27-4570-01</td><td></td></tr><tr><td>Buffer HEPES</td><td>Sigma, EUA</td><td>SLBZ2837</td><td>1 M&nbsp;</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>KoAc</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>127-08-02</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Transfecção Lipofectamin 3000</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>AM9530G</td><td>1 M</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td>5 M&nbsp;</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, EUA</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco, EUA</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, EUA</td><td>10010023</td><td>Inibidor de RNase PH 7.4</td></tr><tr><td></td><td>Promega, EUA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina fosfatase alcalina</td><td>Promega, EUA</td><td>V5591</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Tampão Tris-HCI&nbsp;</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>15567027</td><td>1 M, PH 7.4</td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer&nbsp;</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>15568025</td><td>1 M, PH 8.0</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600560</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

As interações ácido proteína-nucleico desempenham papéis importantes em processos biológicos como transcrição, recombinação e metabolismo do RNA. Métodos experimentais para estudar interações ácido proteína-nucleico requerem o uso de etiquetas fluorescentes, isótopos radioativos, ou outros rótulos para detectar e analisar moléculas alvo específicas. A biotina, uma etiqueta de ácido nucleico não radioativo, é comumente usada em ensaios de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA), mas não tem sido empregada regularmente para monitorar a atividade protéica durante os processos de ácido nucleico. Este protocolo ilustra a utilidade da rotulagem da biotina durante reações enzimáticas in vitro, demonstrando que esta etiqueta trabalha bem com uma escala de ensaios bioquímicos diferentes. Especificamente, em alinhamento com os achados anteriores usando radioisótopos 32P-rotulados substratos, é confirmado via biotina-rotulada EMSA que MEIOB (uma proteína especificamente envolvida na recombinação meiótica) é uma proteína de ligação de DNA, que MOV10 (um O RNA helicase) resolve biotina-etiquetou estruturas do duplex do RNA, e isso MEIOB Cleaves biotina-etiquetou o ADN single-encalhado. Este estudo demonstra que a biotina é capaz de substituir 32P em vários ensaios bioquímicos relacionados ao ácido nucleico in vitro.

A estrutura proteica do MEIOB e os constructos de expressão utilizados neste estudo estão ilustrados na Figura 1A. As dobras do OB em MEIOB são estruturas barril-como compactas que podem reconhecer e interagir com os ácidos nucleicos single-encalhado. Um dos domínios do OB (AA 136-307, construção A) liga o ADN encalhado único (ssDNA), a proteína truncada (truncamentos do AA 136-178, a construção C) e o formulário do mutante do ponto (mutação de R235A, construção E) de MEIOB ...

São apresentados aqui protocolos para ensaios bioquímicos in vitro usando rótulos de biotina que podem ser amplamente aplicáveis para o estudo de interações ácido proteína-nucleico.

Ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Este protocolo oferece uma plataforma rotulada por biotina para o estudo de interações proteína-nucleic ácido que se mostra robusta, confiável, eficiente e acessível. O mesmo lote dos ácidos nucleicos rotulados por biotina pode ser usado durante um longo período de tempo, mantendo a reprodutibilidade dos experimentos. Finalmente, todos os ensaios rotulados por biotina descritos aqui podem ser realizados dentro de um dia e não necessitam de equipamentos especiais.Demonstrando o procedimento será Lina Yu, pós-graduada do nosso laboratório. Prepare as construções MEIOB e MOV10 e transforme-as nas bactérias apropriadas. Para extrair MEIOB, pelota as células através de centrifugação e resuspensá-las em 20 mililitros de fosfato de Dulbecco gelado tampão, ou DPBS, tampão.Sonicar a suspensão bacteriana no gelo. Em seguida, centrifugar o lysate a 12.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos, e transferir o sobrenante para um tubo fresco. Pré-lavar as contas de glutationa-sepharose e incubar-as com o lise a quatro graus Celsius por duas horas.Centrifugar a mistura a 750 vezes g e quatro graus Celsius por um minuto para pelotar as contas. Enxágüe as contas com 10 mililitros de PBS gelado oito vezes. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de eluição, incuba as contas a quatro graus Celsius por 10 minutos, e elute as contas através de centrifugação.Repita a eluição seis vezes, e misture as seis frações. Transfira as proteínas elucidadas em um filtro centrífuga, e concentre-se por centrifugação a 7.500 vezes g para um volume final de 100 a 200 microliters. Para extrair MOV10, expresse a proteína nas células HEK293T e pelota as células de acordo com as instruções do manuscrito.Resuspenda a pelota em três mililitros de tampão de lise celular com coquetel inibidor completo de protease sem EDTA, e incubar por 30 minutos no gelo. Em seguida, centrifugar o lysate a quatro graus Celsius. Prepare contas magnéticas anti-FLAG lavando-as duas vezes com tampão K150.Após a lavagem, resuspenja as contas em um mililitro de tampão K150 gelado e incuba-as por dois minutos a quatro graus Celsius com rotação suave. Colete as contas em um ímã, e remova o supernante. Adicione as contas ao lisetê celular e incubar a quatro graus Celsius por duas horas.Lave as contas com tampão K150 de acordo com as instruções do manuscrito, e resuspenja as contas em 300 microliters de buffer de elução FLAG. Coloque as contas em um ímã, colete o supernasce com as proteínas MOV10 e determine a concentração de proteínas. Prepare os oligonucleotídeos de RNA diluindo cada oligo a 20 micromolares e ressarando-os para formar duplexes de RNA de acordo com as instruções do manuscrito.Para o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética DO MEIOB, ou EMSA, misture os reagentes de acordo com as instruções do manuscrito. Adicione água para um volume final de reação de 20 microliters. Incubar a reação à temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, adicione 5x de buffer de parada.Para o ensaio de atividade helicase MOV10, misture os reagentes de acordo com as instruções do manuscrito e adicione água para um volume final de reação de 20 microliters. Incubar a reação a 37 graus Celsius por 10 minutos, 30 minutos e 60 minutos, e depois adicionar 5x tampão de parada para parar a reação. Em seguida, prepare um gel de poliacrilamida 20% nativo e carregue de 20 a 25 microliters de cada amostra em cada poço.Execute o gel a 100 volts em um banho de gelo até que o marcador azul bromofenol tenha migrado para o último quarto do gel. A crilamida é prejudicial e tóxica. É importante lidar com ele com equipamentos de proteção individual adequados.Desmonte as placas de gel e corte o gel removendo poços de carga e pistas nãousadas. Coloque o gel em tampão TBE 0,5x. Corte o papel do filtro e a membrana de nylon do tamanho do gel, pré-molhe o papel e a membrana e monte a pilha para transferência.Transfira as amostras do gel para a membrana em um aparelho eletroforético semi-seco a 90 miliamperes por 20 minutos. Em seguida, cruze as amostras irradiando a membrana a 120 milímetros por centímetro quadrado por 45 a 60 segundos. Para detecção de chemiluminescência, comece adicionando 20 mililitros de tampão de bloqueio à membrana e incubando-o por 15 a 30 minutos enquanto treme suavemente.Remova cuidadosamente o buffer de bloqueio e substitua-o por um tampão conjugado/bloqueador. Incubar a membrana novamente por 15 minutos. Lave a membrana quatro vezes enquanto treme por cinco minutos por lavagem.Em seguida, adicione 30 mililitros de tampão de equilíbrio de substrato à membrana, e incuba-o por cinco minutos enquanto treme a 20 a 25 rpm. Cubra toda a superfície da membrana com solução de trabalho de substrato e incuba por cinco minutos. Após a incubação, escaneie a membrana em um sistema de imagem quemiluminescente por um a três segundos.A purificação das proteínas MEIOB A, C e E pode ser verificada com coloração azul Coomassie e análise de manchas ocidentais. As setas vermelhas indicam as posições das proteínas MEIOB purificadas. Interações de MEIOB e DNA mono-encalhado podem ser visualizadas usando EMSA.A ligação dependente da concentração e o decote são observados. Como esperado, apenas o MEIOB-A do tipo selvagem interage com o DNA enquanto o mutante MEIOB-E e MEIOB-C não. Interações de MEIOB e RNA de fio único também podem ser observadas.O MEIOB do tipo selvagem mostra a vinculação dependente da concentração e a atividade de exonuclease no RNA de uma única cadeia. No entanto, a comparação quantitativa mostra que o MEIOB liga o DNA com maior eficiência do que o RNA. A purificação do MOV10 foi verificada com coloração azul Coomassie, e a atividade helicase da proteína foi medida em um duplex de RNA com uma saliência de cinco primos.À medida que o tempo de reação aumenta, o MOV10 desenrola progressivamente o RNA de duplar. Para reduzir o custo do ensaio, a detecção de quemiluminescência pode ser realizada com uma diluição dupla dos reagentes do kit de detecção ou com reagentes auto-fabricados. O protocolo descrito aqui usou com sucesso ácidos nucleicos rotulados com biotina como substratos para ensaios bioquímicos in vitro, como a EMSA e para reações enzimáticas nas quais a biotina não tem sido comumente usada.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Interação proteína-proteína testes é indispensável para dissecção de funcionalidade da proteína. Aqui, nós apresentamos...

Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro</em

Este vídeo demonstra uma técnica que usa peptídeos de penetração de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína intracelular. Os peptídeos que penetram nas células facilitam a entrada do peptídeo conjugado em uma célula e se ligam especificamente às suas proteínas de interação. A biotina, após se ligar à avidina, permite a purificação do complexo de proteínas que interagem a partir de um lisado celular.

Sonda de peptídeo penetrante de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para determinar a atividade helicase de uma proteína-alvo para desenrolar o substrato dsRNA marcado com biotina. A atividade da enzima foi identificada pela análise do deslocamento da mobilidade eletroforética, seguida por um ensaio de quimioluminescência usando estreptavidina conjugada com enzima quimioluminescente.

Medição da atividade helicase de uma proteína-alvo usando duplexes de RNA marcados com biotina

Foi desenvolvido um ensaio quantitativo de ligação de ADN à base de ELISA para medir as interacções com o factor de transcrição do ADN. Alta especificidade para a proteína RUNX2 foi conseguida com um oligonucleótido de ADN de reconhecimento de consenso e de anticorpo monoclonal específico. Detecção Colorimétrico com uma reacção do substrato, o anticorpo acoplado a enzima foi monitorizada em tempo real.

Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

Os protocolos aqui descrever os ensaios cinéticos de interações proteína-proteína com Bio-camada Interferometria. Tipo F ATP sintase, que está envolvida no metabolismo da energia celular, pode ser inibida pela sua subunidade ε em bactérias. Temos adaptado Bio-camada de interferometria para estudar as interacções do complexo catalítico com o domínio C-terminal do inibidor ε.

Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

São apresentados neste relatório dois métodos baseados em biotinilação, projetados para determinar a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas expressas na membrana plasmática.

Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Este é um protocolo para estudar as interações da proteína-proteína intracelular baseadas no sistema biotina-avidina suspenso com a novidade de combinar sequências de célula-penetrante. A principal vantagem é que a sequência de destino é incubada com células vivas em vez de lisados celulares e, portanto, as interações ocorrerá dentro do contexto celular.

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Aqui, apresentamos um método in vitro otimizado para descobrir, quantificar e validar interatores proteicos de sequências específicas de RNA, usando extrato proteico total de células humanas, esferas de estreptavidina revestidas com RNA biotinilado e análise por espectrometria de massas.

Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Este artigo descreve um protocolo para estudar as interações DNA-proteína usando um sistema de interferometria de biocamada (BLI) baseado em estreptavidina. Ele descreve as etapas e considerações essenciais para a utilização da cinética de ligação básica ou avançada para determinar a afinidade de ligação de equilíbrio (KD) da interação.

Analisando interações DNA-proteína com interferometria de biocamada baseada em estreptavidina

O protocolo apresenta um método para ligação covalente in vivo de biotina a proteínas com base em sua proximidade a uma biotina ligase fundida a uma proteína de interesse. Essa modificação permite um enriquecimento seletivo das proteínas usando grânulos de estreptavidina, conforme necessário em estudos de interação proteica.

In vivo Biotinilação de proximidade para estudos de interação proteica em Paramecium tetraurelia

Aprenda ensaios bioquímicos in vitro com rótulos de biotina para estudar interações proteína-ácido nucleico. Este método robusto e acessível permite realizar experimentos reprodutíveis em um dia, sem equipamentos especiais.

Ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico

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