Name: In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprenda a quantificar a angiogênese tumoral em xenoenxertos usando larvas de zebrafish transgênicos com vasos sanguíneos fluorescentes. Este método permite medir com precisão a vascularização em modelos de câncer in vivo.

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Agradecemos ao Sr. Alhad Mahagaonkar pela gestão da instalação de zebrafish da Universidade de Auckland e pela unidade de pesquisa de imagens biomédicas, escola de ciências médicas da Universidade de Auckland, para assistência na microscopia confocal de lapso de tempo. Este trabalho foi apoiado por um Conselho de pesquisa em saúde da Nova Zelândia projeto Grant (14/105), uma sociedade real de Nova Zelândia Marsden Fund Project Grant (UOA1602) e um Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) concedido a J.W.A.

1. preparação de agulhas de microinjecção
<ol><li>Gire sobre um extrator da micropipeta e ajuste os seguintes parâmetros (calibrados para o modelo do extrator da micropipeta alistado na tabela dos materiais): calor, 680; Puxe, 75; Velocidade, 40; Tempo, 55; Pressão: 530.</li>
	<li>Fixe um capilar de vidro de borosilicato no extrator de micropipeta e puxe o capilar para fazer duas agulhas. Repita o número de agulhas que desejar.</li>
</ol>2. cultura celular para implantação
Nota: Ao usar este protocolo, qualquer linha celular de câncer de mamíferos pode ser usada para a implantação em embriões de zebrafish como xenoenxertos. Entretanto, há muita variação na resposta angiogênica induzida entre as diferentes linhagens celulares5,11,12. As pilhas da melanoma de B16-F1 murino foram mostradas para induzir uma resposta angiogênica forte em embriões do zebrafish11 e são conseqüentemente apropriadas para o uso neste protocolo.
<ol><li>Cresça células B16-F1 a 37 ° c em um balão de 75 cm2 usando a mídia mem-α suplementada com soro bovino FETAL (FBS) para uma concentração final de 10% (v/v) e penicilina/estreptomicina, cada uma em uma concentração final de 100 μg/ml.</li>
	<li>Retire a mídia de um 95-100% confluente 75 cm2 balão de células B16-F1 e lave as células em 5 ml de temperatura ambiente tampão fosfato salina (PBS).</li>
	<li>Retire o PBS de 5 mL, adicione 2 mL de temperatura ambiente 0,25% de tripsina/ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) e incubar a 37 ° c para 60 s.</li>
	<li>Toque no lado do balão para determinar se as células estão começando a perder seu apego à parte inferior do balão.</li>
	<li>Adicionar 8 mL de temperatura ambiente MEM-α com 10% de FBS no balão, pipetar contra o interior do balão para trazer quaisquer células que permaneçam aderidas à parte inferior do balão em suspensão e pipetar a suspensão da célula para um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 800 x g, 4-8 ° c por 5 min, aspirar a mídia e proceder à rotulagem das células com corante.</li>
</ol>3. rotulagem de células B16-F1 com corante fluorescente
Nota: A fim diferenciar-se entre as pilhas implantadas do tumor e as outras pilhas no embrião, as pilhas do tumor devem ser etiquetadas com um corante fluorescente apropriado antes da implantação. Esta etapa pode ser ignorada se as células já expressam repórteres fluorescentes.
<ol><li>Incubar 2 mL de mídia MEM-α sem soro a 37 ° c.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque do corante escolhido e dilui-o em 2 mL pré-incubados de mídia MEM-α sem soro para fazer uma concentração viável (exemplos de corantes e concentrações apropriadas para células B16 F1 são fornecidos na tabela de materiais).</li>
	<li>Pipetar 1 mL da solução corante para o pellet celular (a partir do passo 2,6), misture bem com pipetagem, em seguida, adicione os outros 1 mL de solução de corante e misture.</li>
	<li>Incubar as células e a mistura de corante a 37 ° c por 40 min, misturando por agitação suave a 20 min.</li>
	<li>Centrifugue a suspensão da pilha em 800 x g, 4-8 ° c por 5 minutos.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e lavar as células rotuladas pipetando com 5 mL de PBS.</li>
	<li>Centrifugue a suspensão da pilha outra vez em 800 x g, 4-8 ° c por 5 minutos, Aspire o sobrenadante e coloc as pilhas no gelo até pronto para a implantação. Nota: A pelota final da pilha do tumor deve ter um volume de 20-40 μL.</li>
</ol>4. preparação de embriões para implantação
Nota: Escolha uma linha de zebrafish transgênica que tenha rotulado os vasos sanguíneos fluorescentamente (por exemplo, kdrl: RFP, fli1a: EGFP, etc.) 13 anos de , a 14.
<ol><li>Dois dias antes da implantação, geram o zebrafish como descrito previamente e coletam os embriões15. Nota: Como não estamos injetando esses peixes em uma fase inicial, eles não precisam ser coletados dentro de 20 min de desova, como descrito por Rosen et al.15, mas podem ser coletadas após algumas horas de acasalamento.</li>
	<li>Coloc os embriões em pratos da cultura de 100 milímetros em uma densidade de aproximadamente 100 embriões/prato.</li>
	<li>Adicionar 50 mL de E316 (suplementado com 5 μL de um 1% w/v solução aquosa de estoque de azul de metileno para evitar a contaminação) para cada prato, limpe todos os embriões mortos ou detritos e manter o prato em uma incubadora escura a 28 ° c até estar pronto para a injeção.</li>
	<li>Em 1 dia após a fertilização (DPF), adicionar 1-phenyl-2-thiourea (PTU) para cada prato para produzir uma concentração final de 30 mg/L PTU em E3. PTU previne a pigmentação, que pode interferir com a capacidade de ver as células tumorais e vasos sanguíneos.</li>
	<li>Em 2 DPF, use agulhas ou pinças para dechorionate manualmente todos os embriões que são unhatched. Usando um microscópio fluorescente, selecione tantos como embriões transgénicos como necessário para o xenotransplantar (50-200).</li>
	<li>Antes da implantação, anestesiam os embriões selecionados em uma solução de 300 μg/mL de tricaína no E3, a fim de evitar o movimento durante o procedimento de injeção.</li>
	<li>Encha um prato de 35 milímetros com um metilcelulose de 2% na solução E3 a um quarto do volume do prato.</li>
	<li>Use uma pipeta de transferência para colocar aproximadamente 50 embriões (minimizando o volume da solução E3 também transferidos) para a metilcelulose.</li>
	<li>Use uma ponta da pipeta do Microloader para arranjar os embriões de modo que estejam todos orientados verticalmente, com as cabeças à parte superior e com o lado esquerdo virado para cima. Nota: As etapas 4.7-4.9 podem igualmente ser executadas arranjando os embriões em um bloco do agarose como descrito previamente17, mas em nossa experiência, os embriões são arranjados mais facilmente quando vestiu na metilcelulose.</li>
</ol>5. injeção perivitelline de células cancerosas de mamíferos em embriões 2 DPF
Nota: Para garantir que as células se amontoam como enxerto quando implantadas, as células devem ser misturadas juntamente com uma mistura de matriz extracelular (ECM). Descrevemos as etapas de fazer uma mistura de célula/ECM ao usar uma mistura ECM referenciada na tabela de materiais. Se uma matriz alternativa for usada, as etapas devem ser ajustadas de acordo.
<ol><li>Divida um estoque de ECM em 100 μL de alíquotas em tubos de 500 μL e armazene a-20 ° c até que seja necessário.</li>
	<li>Descongelar uma alíquota de ECM e adicionar 100 μL de PBS para diluir a mistura para 50% (v/v). Nota: O ECM 50% diluído pode ser armazenado em 4 ° c por até 1 mês.</li>
	<li>Misture bem o ECM 50% com a pelota da pilha B16-F1 (da etapa 3,7) introduzindo com pipting e mexendo, para produzir uma mistura de Cells/ECM em uma relação 2:1 e armazene a mistura no gelo.</li>
	<li>Usando uma pipeta microcapilar, tome acima de 3-10 μL das pilhas.</li>
	<li>Insira cuidadosamente a ponta da pipeta numa agulha e ejecte a mistura B16-F1/Matrix até ao fim da agulha.</li>
	<li>Insira a agulha no suporte da agulha e incline-a num ângulo de 45 ° para o prato.</li>
	<li>Quebre a ponta da agulha usando pinças para fazer um furo grande o suficiente para que as células sejam ejetadas da agulha sem apertar as células.</li>
	<li>Gire sobre o cilindro de ar pressurizado Unido ao instrumento da injeção e gire o injector no modo "contínuo" momentaneamente para empurrar as pilhas à ponta da agulha.</li>
	<li>Retire a agulha do prato e substitua o prato por um hemociômetro.</li>
	<li>Coloque uma gota de óleo no hemocitômetro e injete a agulha uma vez sobre esta gota.</li>
	<li>Contar o número de células ejetado com um único pulso usando o hemocitômetro e calibrar a agulha para ejetar aproximadamente 150 células por pulso, ajustando a duração do pulso. Nota: Ejting esta quantidade de pilhas por o pulso exigirá diversos pulsos a fim implantar um xenograft bem sucedido. Isto dará ao pesquisador mais controle sobre o tamanho final do tumor xenograft, permitindo-lhes ajustar moderadamente o número/localização de pulsos para fazer cada Xenoenxerto maior ou menor como eles vêem o ajuste.</li>
	<li>Aponte a agulha para o saco de gema de um embrião e empurre-a através do saco de gema em uma direção ventral até que a ponta da agulha emergiu do saco vitelino e está empurrando a epiderme embrionária no lado ventral do embrião apenas posterior ao coração. Nota: Posicione a agulha de modo a entrar no saco de gema embrionário anterior ao local final onde as células serão ejetadas. Isso garantirá que as células serão ejetadas em uma direção longe do coração, diminuindo a probabilidade de injetar as células na veia cardinais comum.</li>
	<li>Empurre com cuidado a ponta da agulha para a frente um pouco até que tenha criado um espaço (espaço do perivitelino) entre a epiderme e a membrana do saco de gema e Pulse então o injector para ejetar alguma da mistura da pilha no espaço do perivitelino.</li>
	<li>Repita os pulsos até que 500-800 células tenham sido injetadas no espaço perivitelino, criando uma protuberância visível que se estende pelo menos metade do caminho ao longo da parte inferior do saco de gema, em seguida, retire a agulha do embrião. Nota: Se as células bloqueiem a agulha ou estiverem danificadas durante a injeção, limpe a agulha momentaneamente alternando para o modo "contínuo" e depois volte para o "pulso". Isto deve desbloquear a agulha e permitir que as células sejam ejetadas livremente e sem danos.</li>
	<li>Continue a fazer o mesmo para todos os embriões no prato, carregando uma nova agulha com células tumorais quando necessário.</li>
	<li>Depois de injetar todos os embriões, retire a agulha e empurre todos os embriões em conjunto utilizando uma ponteira de pipeta microcapilar para que possam ser pipetadas com o mais pequeno metilcelulose possível.</li>
	<li>Transfira os embriões para um prato de recuperação contendo E3 (com PTU e azul de metileno) e lave-os gentilmente introduzindo o E3 em torno dos embriões. Nota: Neste ponto, os embriões xenografados podem ser tratados com as drogas separando os em pratos diferentes e adicionando uma solução da droga a um prato e a uma solução do controle (tal como o veículo da droga) ao outro prato.</li>
	<li>Incubar os embriões a 34 ° c e realizar duas vezes por dia verificações para remover embriões mortos ou oedematous do prato. Nota: o ° c 34 foi encontrado para ser a temperatura óptima para o vascularização do xenograft e foi usado igualmente por outros estudos que empregam o modelo embrionário da angiogênese do xenograft de zebrafish18. Os xenoenxertos podem ser fotografados a qualquer momento até 48 HPI (horas pós-implantação).</li>
</ol>6. imagem latente viva
<ol><li>Em 48 HPI, identifique 3-5 embriões saudáveis sem edema. Anestesie-os em 150 μg/mL de tricaína e monte-os lateralmente em 1% de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) como descrito anteriormente19. Nota: Como o agarose está solidificando, use uma ponta microcapilar da pipeta para manter os embriões posicionados lateralmente.</li>
	<li>Gire sobre o microscópio confocal, o controlador do microscópio, os lasers e o software de computador para controlar o microscópio.</li>
	<li>Coloque o prato em um microscópio confocal. Usando uma ampliação 20x, a água que mergulha a lente objetiva, posiciona o xenograft no centro do campo usando a imagem latente do brightfield.</li>
	<li>Selecione os lasers da excitação que são apropriados para detectar o corante usado para etiquetar as pilhas do tumor e o fluoróforo usado para etiquetar os vasos sanguíneos do zebrafish.</li>
	<li>Ajuste o ganho para cada laser a um nível que permita a deteção das pilhas do tumor e dos vasos sanguíneos. Nota: Uma vez que os ajustes confocais foram estabelecidos, assegure-se de que estes estejam mantidos inalterados durante todo o experimento de modo que as comparações possam ser feitas entre xenoenxertos.</li>
	<li>Usando o canal do laser apropriado para as pilhas do tumor, determine um volume a ser imaged que inclua o volume inteiro do xenograft, permitindo pelo menos uma ou dois seções óticas um ou outro lado do enxerto. Use intervalos de seção com cerca de 5 μm de distância para criar uma pilha z. Nota: É essencial que o z-Stack deve conter todo o volume do xenograft.</li>
	<li>Usando duas imagens de canal, imagem tanto o tumor xenograft e os vasos sanguíneos. Repita as etapas 6.6-6.7 para cada larva a ser imaged.</li>
</ol>7. imagem de lapso de tempo
Nota: Este modelo é altamente adequado para processos celulares dinâmicos de imagem devido à sua transparência e à disponibilidade de transgênicos zebrafish que rotulam de forma cDNAs diferentes tipos de células. Isso torna a imagem de lapso de tempo uma aplicação chave desse modelo.
<ol><li>Gire sobre a câmara ambiental e ajuste a 34 ° c pelo menos 2 h antes da imagem latente. Se a câmara não estiver humidificada, adicione os pratos de água.</li>
	<li>Anestesie 3-5 embriões (utilizando 120 μg/mL de tricaína a 2 DPF e 100 μg/mL de tricaína a 3 DPF) e monte-os lateralmente em 0,8% de agarose de LMP para a imagem de lapso temporal de acordo com o protocolo previamente descrito19. Nota: Como o agarose está solidificando, use uma ponta microcapilar da pipeta para manter os embriões posicionados lateralmente.</li>
	<li>Configurar o equipamento e a imagem o xenograft como descrito nas etapas 6.2-6.7, adquirindo z-pilhas do xenograft em intervalos de 10 minutos. Nota: O embrião deve ser mantido a 34 ° c à medida que está sendo fotografado e o E3 em cima das larvas em agar deve ser verificado e suplementado ocasionalmente para garantir que não seque.</li>
</ol>8. quantitation da resposta angiogênica ao Xenoenxerto de zebrafish
Observação: as etapas a seguir usam software de análise de imagem 3D. As etapas específicas variarão dependendo do software usado.
<ol><li>Transfira os arquivos de imagem Confocal da pilha z de um xenograft do tumor a uma pasta nova no software da análise de imagem 3D. Nota: A fim de quantificar os níveis de vascularização tumoral, os protocolos de medição devem ser criados com ajustes calibrados para que possam ser usados para medir o volume tumoral ou volume do vaso para todos os xenoenxertos.</li>
	<li>Para criar o protocolo "volume tumoral" para medir o volume dos xenoenxertos tumorais, vá para a guia "medição" no menu superior e, em seguida, arraste os protocolos nomeados "Find Objects" da lista de protocolos que aparece no lado esquerdo da janela para o espaço que é intitulado "arraste tarefas aqui para fazer medições".</li>
	<li>Assegure-se de que este protocolo esteja ajustado para medir objetos no canal do tumor, e arraste então os protocolos nomeados "grampo a ROIs" e "faça o ROI da população" da lista de protocolos ao espaço do "arraste tarefas aqui para fazer medidas". Assegure-se de que esses dois comandos se apliquem aos objetos identificados por "Find Objects".</li>
	<li>Antes de calibrar as configurações deste protocolo, vá para o menu suspenso acima do rótulo "modo" no canto superior esquerdo da janela e selecione a visualização "foco estendido".</li>
	<li>Desmarque os canais não tumorais no painel na extrema direita clicando no círculo preto em cada direção do canal, para que apenas o canal do tumor possa ser visto. Use a ferramenta "mão livre" na parte superior da janela para desenhar uma "região de interesse" (ROI) em torno de todo o volume tumoral. Nota: Tome cuidado para garantir que nenhum do tumor é deixado de fora do ROI. Isso fornecerá uma região na qual executar o protocolo conforme você está calibrando as configurações.</li>
	<li>Selecione o rótulo "Resumo" no painel abaixo da imagem e defina a opção "exibir" para mostrar "população 2". Para calibrar, clique no asterisco na tarefa localizar objetos, que abrirá a janela de configurações. Ajuste o "limiar" usando "intensidade" e determinando o limiar "inferior" até que apenas as células tumorais sejam selecionadas e não a fluorescência de fundo. Nota: Isto é importante de modo que somente a fluorescência das pilhas do tumor no ROI selecionado (extraído em 8,5) esteja detectada e nenhuma da fluorescência do fundo esteja medida.</li>
	<li>Determine o "tamanho mínimo do objeto" para que apenas as células intactas sejam medidas em oposição a itens menores de detritos celulares (por exemplo, definindo o "tamanho mínimo do objeto" como 100 μm3). Salve este protocolo como "volume tumoral" clicando na guia medições no menu superior e clicando em "Save Protocol", e use as mesmas configurações para medir todos os xenoenxertos.</li>
	<li>Para medir o volume dos vasos sanguíneos associados ao Xenoenxerto, terá de fazer um novo protocolo. Vá para o menu superior, clique na guia medições e clique em "Clear Protocol". Arraste as tarefas "localizar objectos" e "clip para ROIs" para o espaço que é intitulado "arrastar tarefas aqui para efectuar medições" para este protocolo.</li>
	<li>Assegure-se de que o primeiro comando esteja ajustado para medir objetos no canal do vaso sanguíneo e que o seguinte comando esteja ajustado para aplicar-se aos objetos identificados pelo primeiro comando. Em seguida, desmarque os canais não-vasos no painel da extrema direita para que apenas os vasos sanguíneos podem ser vistos.</li>
	<li>Determine as configurações para o "volume do vaso" de forma semelhante ao protocolo "volume tumoral" e salve este protocolo como "volume do vaso" (ver 8.6-8.7).</li>
	<li>Limpe o protocolo e desenhe um ROI em torno do xenograft, tomando cuidado para não incluir qualquer autofluorescência não tumoral. Meça a soma do volume dos objetos no canal tumoral dentro deste ROI clicando na guia medições, selecionando o comando "Restore Protocol" e escolhendo o protocolo "volume tumoral".</li>
	<li>Usando o novo ROI feito pelo protocolo "volume tumoral", use o protocolo "volume do navio" para medir o volume total de objetos no canal do navio dentro deste ROI clicando na guia medições, selecionando o comando "Restore Protocol" e escolhendo o "navio Volume "protocolo.</li>
	<li>Divida o volume do vaso pelo volume tumoral e multiplique a resposta por 100 para obter um valor percentual de vascularização do enxerto.</li>
	<li>Repita as etapas 8,11 a 8,13 para todos os outros xenoenxertos.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunitinib+acts+primarily+on+tumor+endothelium+rather+than+tumor+cells+to+inhibit+the+growth+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRibatti%2C+D+%22Tumor+Angiogenesis+Assays%22">Tumor Angiogenesis Assays</a>. , 1st. edn, Humana Press. (2016).</li>
<li>Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+tumor+xenografts+induce+neovascularization+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos.</a> Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li>
<li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegfd+can+compensate+for+loss+of+Vegfc+in+zebrafish+facial+lymphatic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting.</a> Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).</li>
<li>Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barbigerone+inhibits+tumor+angiogenesis%2C+growth+and+metastasis+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+Journal+of+Cancer+Prevention%22%5BJournal%5D)">Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKLB1002%2C+a+novel+potent+inhibitor+of+VEGF+receptor+2+signaling%2C+inhibits+angiogenesis+and+tumor+growth+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).</li>
<li>Muthukumarasamy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+noreremophilane-based+inhibitors+of+angiogenesis+using+zebrafish+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).</li>
<li>Britto, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+enhance+Vegfa-driven+angiogenesis+in+an+embryonic+zebrafish+tumor+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).</li>
<li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish%2Ftumor+xenograft+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li>
<li>Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NXT2+is+required+for+embryonic+heart+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 5, 7(2005).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li>
<li>Eng, T. C. Y., Astin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Zebrafish+Facial+Lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics.</a> Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768(2011).</li>
<li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRN951%2C+a+highly+potent+inhibitor+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+tyrosine+kinases%2C+has+antitumor+activities+and+affects+functional+vascular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties.</a> Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).</li>
<li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+model+of+inflammatory+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis.</a> Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).</li>
<li>Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+architecture+of+human+xenotransplanted+tumors%3A+histological%2C+morphometrical%2C+and+ultrastructural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).</li>
<li>Vermeulen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+quantification+in+primary+colorectal+carcinoma%3A+an+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study.</a> British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).</li>
<li>Heilmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+System+for+Studying+Metastasis+Using+Transparent+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish.</a> Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).</li>
<li>Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Zebrafish+to+Identify+Anti-%28Lymph%29Angiogenic+Compounds+for+Cancer+Treatment%3A+Promise+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges.</a> Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cords+Promote+Tumor+Initial+Growth+prior+to+Vascular+Function+through+a+Paracrine+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism.</a> Scientific Reports. 6, 19404(2016).</li>
<li>Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+normalization+as+a+therapeutic+strategy+for+malignant+and+nonmalignant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486(2012).</li>
<li>Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+vascular+networks+in+zebrafish%3A+an+introduction+to+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography.</a> Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O primeiro passo crítico no protocolo é a implantação de células tumorais. É essencial que as células são injetadas em um local que permitirá que o xenograft implante com sucesso no embrião sem fazer o embrião edematoso. Uma injeção que é muito anterior pode permitir que as células se movam em direção ao coração, bloqueando a corrente sanguínea e levando ao edema, enquanto uma injeção que é muito posterior resultará em um Xenoenxerto mal implantado. Uma injeção anterior é melhor evitada introduzindo a agulha através do s...

A angiogênese é uma das características clássicas do câncer e representa um alvo de terapia anticancerígena1,2. Para estudar esse processo, foram criados modelos de câncer de Xenoenxerto, implantando células tumorais de mamíferos em animais como camundongos3. Um modelo do xenograft do zebrafish foi desenvolvido igualmente, que envolva a implantação de pilhas do tumor em 2 dias do borne da fertilização (DPI) zebrafish que conduz ao crescimento rápido de vasos sanguíneos do zebrafish no xenograft4.
Este protocolo descreve um modelo in vivo do xenograft do tumor do embrião do zebrafish em que a resposta angiogênica pode com precisão ser quantificados através do xenograft inteiro. Este método permite que o investigador examine, in vivo, os mecanismos moleculares que sustentam a resposta angiogênica do tumor. A tractabilidade genética do zebrafish permite que a contribuição do hospedeiro seja interrogada, enquanto a seleção de diferentes linhagens celulares tumorais permite que a contribuição tumoral para a angiogênese também seja examinada5,6,7. Além disso, como larvas de zebrafish são permeáveis a pequenas moléculas, inibidores de vias específicas podem ser usados ou bibliotecas de drogas podem ser rastreadas para identificar novos inibidores da angiogênese tumoral8,9,10, o 11.
O modelo de Xenoenxerto de embrião zebrafish apresenta vantagens únicas em comparação com outros modelos de xenoenxertos de mamíferos. Os xenoenxertos de zebrafish são mais baratos e mais fáceis de executar, um grande número de animais pode ser examinado e a imagem latente viva da pilha permite a examinação detalhada do comportamento da pilha4. Ao contrário de outros modelos in vivo, que requerem até várias semanas para observar o crescimento significativo dos vasos, a angiogênese em xenoenxertos de zebrafish pode ser observada dentro de 24 h após a implantação3,4. No entanto, a falta de um sistema imunológico adaptativo em zebrafish embrionário, embora benéfica para a manutenção do Xenoenxerto, significa que a resposta imune adaptativa e sua contribuição para a angiogênese tumoral não podem ser examinadas. Além, a falta de pilhas stromal do tumor, a inabilidade ao implante ortotópica o tumor e a diferença na temperatura da manutenção entre zebrafish e pilhas mamífero são fraquezas potenciais deste método. No entanto, a amenabilidade deste modelo para imagens ao vivo e a capacidade de quantitizar com precisão a resposta angiogênica torna-o excepcionalmente benéfico para o estudo dos processos celulares que regulam a angiogênese tumoral in vivo.

<table><tbody><tr><td>Cilindro de ar</td><td>BOC</td><td>011G</td><td>Xenotransplante</td></tr><tr><td>B16-F1 células</td><td>ATCC</td><td></td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>BD Matrigel LDEV-free (mistura de matriz extracelular)</td><td>Corning</td><td>356235</td><td>Xenotransplante</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borosillicado</td><td>Warner Instruments</td><td>G100T-4</td><td>OD = 1,00 mm, ID = 0,78 mm, Comprimento = 10 cm Célula de injeção celular</td></tr><tr><td> Placa de cultura 35 mm de diâmetro</td><td>Thermofisher NZ</td><td>NUN153066</td><td>Piscicultura</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células 100 mm de diâmetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167-500EA</td><td>Piscicultura</td></tr><tr><td>Frasco de cultura de células 75 cm2</td><td>In Vitro Technologies</td><td>COR430641</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>CellTracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td>Marcação celular, concentração de estoque (10 mM em DMSO), concentração de trabalho (0,2 &mu; M em meio sem soro)</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Tratamento medicamentoso, Marcação celular</td></tr><tr><td>E3 Meio (60x em 2 L de água) 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2&middot; 2H2O 9,78 g MgCl2&middot; 6H2O ajusta para pH 7.2 com NaOH</td><td>Internamente [1]</td><td></td><td>Piscicultura</td></tr><tr><td>Etil-3-aminobenzoato metanossulfonato (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Xenotransplante, Ponta de filtro de imagem</td></tr><tr><td>1.000 &mu; L</td><td>VWR</td><td>732-1491</td><td>Usado durante várias etapas</td></tr><tr><td>Ponta do filtro 200 &mu; L</td><td>VWR</td><td>732-1489</td><td>Usado durante várias etapas</td></tr><tr><td>Ponta do filtro 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>732-1487</td><td>Usado durante várias etapas</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Preparação de embriões</td></tr><tr><td>FBS (origem neozelandesa)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10091148</td><td>Luvas de cultura celular</td></tr><tr><td></td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>Usado durante várias etapas</td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células do hemocitômetro Neubauer</td><td>HawksleyVet</td> <td>aprimoradoAC1000</td><td>Xenotransplante</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R Centrifuge</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>75004500</td><td>Cultura celular, Rotulagem celular</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>62249</td><td>Marcação celular, Concentração de estoque (1 mg/ml em DMSO), concentração de trabalho (6 &mu; g/ml em meio sem soro)</td></tr><tr><td>Baixo ponto de fusão, UltraPure Agarose</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>16520050</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Methycellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9004 67 5</td><td>Xenotransplante</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Microloader de piscicultura</td></tr><tr><td>0.5-20 &mu; Ponta de pipeta L para carregar microcapilares</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Xenotransplante</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>Usado durante várias etapas</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas P 87</td><td>Instrumentos</td><td></td> Sutter <td>Xenotransplante</td></tr><tr><td>Incubadora de gaiola de microscópio</td><td>Okolab</td><td></td><td>Imagem de lapso de tempo</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Qualquer marca comercial</td><td></td><td>Óleo mineral de imagem</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3516</td><td>Xenotransplante</td></tr><tr><td>Meios essenciais mínimos (MEM) - alfa</td><td>Thermofisher Scientfic</td><td>12561056</td><td>Cultura de Células</td></tr><tr><td>MPPI-2 Injetor de Pressão Instrumentação</td><td></td><td></td> Científica Aplicada <td>Xenotransplante</td></tr><tr><td>Narishige micromanipulador Narishige</td><td>Grupo</td><td></td> <td>NarishigeXenotransplante</td></tr><tr><td>Nikon D Eclipse C1 Microscópio Confocal</td><td>Nikon</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>N-Feniltioureia (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Piscicultura</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>S1 pipeta filler</td><td>Thermoscientific</td><td>9501</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Stripette sorológica 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Stripette sorológica 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Stripette sorológica 5 mL</td><td>Corning</td><td>4485</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Stripette sorológica 2 mL</td><td>Corning</td><td>4486</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Terumo Needle 22 G</td><td>Amtech</td><td>SH 182</td><td>Piscicultura</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos</td><td>Thermofisher Scientfic</td><td>HeraCell 150i</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Tivozanib (AV951)</td><td>AVEO Pharmaceuticals</td><td>Tratamento medicamentoso</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência 3 mL</td><td>Mediray</td><td>RL200C</td><td>Piscicultura</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>T4049</td><td>Pinças de cultura de células</td></tr><tr><td></td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>11295-10</td><td>Software</td></tr><tr><td>Volocity para piscicultura (v6.3)</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td></td><td>Análise de imagem</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging e quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

A angiogênese tumoral é um alvo-chave da terapia anticancerígena e este método foi desenvolvido para fornecer um novo modelo para estudar este processo in vivo. Um Xenoenxerto de zebrafish é criado através da implantação de células tumorais de mamíferos no espaço perivitelínico de dois dias-embriões de zebrafish pós-fertilização, seguidos pela mensuração da extensão da resposta angiogênica observada em um desfecho experimental até dois dias pós-implante. A vantagem chave a este método é a habilidade de quantificar exatamente a resposta angiogênica do anfitrião do zebrafish ao enxerto. Isto permite a examinação detalhada dos mecanismos moleculars assim como o anfitrião contra a contribuição do tumor à resposta angiogênica. Os embriões xenografados podem ser submetidos a uma variedade de tratamentos, como a incubação com potenciais fármacos antiangiogénese, a fim de investigar estratégias para inibir a angiogênese tumoral. A resposta angiogênica também pode ser imaged ao vivo, a fim de examinar processos celulares mais dinâmicos. A técnica experimental relativamente pouco exigente, custos de manutenção baratos de zebrafish e curto cronograma experimental tornam este modelo especialmente útil para o desenvolvimento de estratégias para manipular a angiogênese tumoral.

Por meio da imagem de um Xenoenxerto individual em 6, 24 e 48 HPI, a resposta angiogênica em diferentes temporais pode ser calculada como mostrado na Figura 1a-C. A maior resposta angiogênica é observada entre 24-48 h pós-implante, com os níveis máximos de vascularização do enxerto observados em torno de 2 DPI (Figura 1a-C). Um filme de lapso de tempo de uma resposta angiogênica típica a um xenog...

O objetivo deste método é gerar um modelo in vivo de angiogênese tumoral por xenoenxertos de células tumorais de mamíferos em um embrião de zebrafish que tem vasos sanguíneos com rótulo fluorescentamente. Por imagem do Xenoenxerto e vasos associados, uma medida quantitativa da resposta angiogênica pode ser obtida.

In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Este protocolo descreve como as larvas transgênicas de zebrafish podem ser usadas para fornecer um ensaio quantitativo in vivo da vascularização do xenoenxerto tumoral. A principal vantagem dessa técnica em relação às técnicas anteriores é que permite ao pesquisador quantificar com precisão as mudanças nos níveis de vascularização do xenoenxerto. O passo fundamental é garantir que as células tumorais sejam injetadas corretamente em larvas de zebrafish para que as etapas subsequentes de imagem e quantitação não sejam comprometidas.Depois de crescer e rotular células B16-F1 com corante fluorescente, comece a preparar embriões para implantação. Encha um prato de 35 milímetros com uma solução de 2%de metilcelulose na solução E3 para um quarto do volume do prato. Utilizando uma pipeta de transferência, coloque aproximadamente 50 embriões transgênicos previamente preparados na metilcelulose, minimizando o volume da solução E3 transferida.Usando uma ponta de pipeta microcapillary, organize os embriões para que todos sejam orientados verticalmente com a cabeça até o topo, caudas até o fundo, e o embrião com o lado esquerdo para cima. Adicione 50% de ECM a uma pelota de célula B16-F1 previamente preparada para produzir uma mistura de células para ECM em uma proporção de dois para um. Misture bem por pipetar e mexer, e armazene a mistura no gelo.Use uma pipeta microcapilar para ocupar de 3 a 10 microlitres de células. Insira cuidadosamente a ponta da pipeta em uma agulha de microinjeção previamente preparada e, em seguida, ejete a mistura da matriz B16-F1 na extremidade da agulha. Insira a agulha no suporte da agulha e incline em um ângulo de 45 graus para o prato.Use pinças para quebrar a ponta da agulha para fazer um buraco grande o suficiente para que as células sejam ejetadas da agulha sem apertar as células. Ligue o cilindro de ar pressurizado ligado ao aparelho de injeção e, em seguida, gire momentaneamente o injetor no modo contínuo por não mais de um segundo para empurrar as células para a ponta da agulha. Aponte a agulha em direção ao saco de gema de um embrião, e empurre-a através do saco de gema em uma direção ventral até que a ponta da agulha tenha emergido do saco de gema e esteja empurrando a epiderme embrionária no lado ventral do embrião, apenas posterior ao coração.Empurre cuidadosamente e ligeiramente a ponta da agulha para a frente até que ela tenha criado um pequeno espaço entre a epiderme e a membrana do saco de gema. Pulso o injetor para ejetar um pouco da mistura celular neste espaço perivitelline. Olhe cuidadosamente para o tamanho, forma e localização do xenoenxerto como ele está sendo implantado, e ajuste o número de pulso e a posição da agulha de acordo para garantir um xenoenxerto corretamente implantado.Repita os pulsos até que 500 a 800 células tenham sido injetadas no espaço perivitelline, criando uma protuberância visível que se estende pelo menos metade do caminho ao longo da parte inferior do saco de gema. Remova a agulha do embrião. Depois de injetar todos os embriões, use uma ponta de pipeta microcapilar para empurrar todos os embriões juntos para que eles possam ser escoados com o mínimo de metilcelulose possível.Transfira os embriões para um prato de recuperação contendo E3 com PTU e azul metileno. Em seguida, gentilmente pipeta E3 em torno dos embriões para lavá-los, e, em seguida, incubar a 34 graus Celsius. Em seguida, imagem anesthetizado embriões usando um microscópio confocal.Use um canal laser apropriado para as células tumorais para determinar um volume a ser imageado, permitindo pelo menos uma ou duas seções ópticas de cada lado do enxerto. Use intervalos de seção com cerca de cinco micrômetros de distância para criar uma pilha Z. Use imagens de dois canais para fotografar os vasos sanguíneos e o xenoenxerto tumoral.Imagem do xenoenxerto tumoral e vasos sanguíneos para uma larva, e repita esses passos para que cada larva seja imagen. Para começar com a quantitação da resposta angiogênica ao xenoenxerto de zebrafish, transfira arquivos de imagem confocal de pilha Z previamente criados de um xenoenxerto tumoral para uma nova pasta no software de análise de imagem 3D. Para criar o protocolo Volume de Tumor para medir o volume de xenenerto tumoral, vá para a guia Medição no menu superior da janela e, em seguida, da lista de protocolos que aparece arraste o protocolo chamado Find Objects para o espaço que é intitulado Drag Tasks Here To Make Measurements.Depois de garantir que este protocolo seja definido para medir objetos no canal do tumor, arraste os protocolos chamados Clip To ROIs e Make ROI From Population da lista de protocolos para o espaço Drag Tasks Here To Make Measurements, certificando-se de que esses dois comandos se apliquem aos objetos identificados pelo Find Objects. Antes de calibrar as configurações deste protocolo, vá para o menu suspenso acima da etiqueta Mode no canto superior esquerdo da janela e selecione a exibição Extended Focus. Desmarque os canais não tumorais no painel à direita clicando no círculo preto sob cada direção do canal para que apenas o canal tumore pode ser visto.Em seguida, use a ferramenta Freehand na parte superior da janela para desenhar uma região de interesse, ou ROI, em torno de todo o volume do tumor. No painel abaixo da imagem, selecione o rótulo Resumo e, em seguida, defina a opção Exibir para mostrar a população dois. Para calibrar, na tarefa Encontrar objetos, clique no asterisco para abrir a janela de configurações.Ajuste o limiar usando intensidade e determine o limiar inferior até que apenas as células tumorais sejam selecionadas e não a fluorescência de fundo. Determine o tamanho mínimo do objeto para que apenas células intactas sejam medidas, em oposição a itens menores de detritos celulares, definindo o tamanho mínimo do objeto como 100 micrômetros cúbicos. Salve este protocolo como Volume de Tumor clicando na guia Medidas no menu superior e clicando em Salvar Protocolo.Use as mesmas configurações para medir todos os xenoenxertos. Para medir o volume dos vasos sanguíneos associados ao xenoenxerto, crie um novo protocolo indo para o menu superior e, em seguida, clicando na guia Medidas e, em seguida, Protocolo Claro. Arraste as tarefas Find Objects e Clip To ROIs para o espaço intitulado Arrastar tarefas aqui para fazer medições para este protocolo.Certifique-se de que o primeiro comando está definido para medir objetos no canal do vaso sanguíneo e que o seguinte comando está definido para aplicar aos objetos identificados pelo primeiro comando. Em seguida, desmarque os canais não-vasos no painel de extrema-direita para que apenas os vasos sanguíneos possam ser vistos. Determine as configurações do protocolo de volume de vasos de forma semelhante ao protocolo de volume de tumor descrito anteriormente e salve este protocolo como Volume de Vasos.Limpe o protocolo e desenhe um ROI em torno do xenoenxerto, tomando cuidado para não incluir nenhuma autofluorescência não tumoral. Para medir a soma do volume dos objetos no canal do tumor dentro deste ROI, clique na guia Medidas, selecione o comando Protocolo de Restauração, escolha o protocolo volume do tumor e clique em Restaurar. Usando o novo ROI feito pelo protocolo Volume do Tumor, clique na guia Medidas e selecione o comando Protocolo de Restauração, escolha o protocolo de volume de vasos e clique na linha de soma para calcular o volume total de objetos no canal da embarcação dentro deste ROI.Divida o volume do vaso pelo volume do tumor e multiplique a resposta por 100 para obter um valor percentual de vascularização do enxerto. Ao fotografar um xenoenxerto individual aos seis, 24 e 48 horas após a implantação, a resposta angiogênica em diferentes pontos de tempo pode ser calculada, com a maior resposta angiogênica entre 24 a 48 horas após a implantação e os níveis máximos de vascularização do enxerto vistos em torno de 48 horas. Imagens de lapso de tempo confocal de um xenoenxerto B16-F1 implantado em um embrião de zebrafish pós-fertilização pós-fertilização mostra vasos sanguíneos rotulados por GFP crescendo através do xenoenxerto, formando uma rede de torção com vasos de tamanho irregular e morfologia típicos da rede vascular anormal vista em tumores mamíferos.Os xenoenxertos incubados no inibidor VEGFR mostram grande redução de vasos em comparação com os xenoenxertos de controle incubados no DMSO. Em embriões de controle, houve uma rede vascular expansiva que se estende por toda a região do xenoenxerto, a resposta angiogênica típica observada após a implantação de células B16-F1. Quando quantificada, a resposta angiogênica mostra uma clara redução na vascularização do enxerto nos xenoenxertos tratados pelo inibidor VEGFR quando comparados aos controles.O canal do tumor mostra uma massa de células B16-F1 rotuladas fluorescentemente abaixo do saco de gema, que exibe autofluorescência. Portanto, um ROI deve ser cuidadosamente desenhado em torno do xenoenxerto, tomando cuidado para não incluir qualquer uma das autofluorescência do saco de gema. O protocolo de volume tumor identificou todas as células B16-F1 no ROI, mediu seu volume e cortou o ROI em seu volume.O Protocolo de Volume de Vasos tumorais neste novo ROI cortado permitiu a identificação de todos os vasos associados à massa de células B16-F1 e mediu seu volume. Os valores dos protocolos de volume de tumor e volume de vasos tumorais podem ser usados para dar uma medida de vascularização do enxerto. A trato e a permeabilidade genética dos zebrafish permitem a investigação de altas vias de sinalização na angiogênese tumoral, e também pode atuar como uma plataforma de triagem para identificar compostos anti-angiogênicos.

in-vivo-imaging-quantitation-host-angiogenic-response-zebrafish-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve um método de microinjeção para entrega de células de câncer de mama no espaço perivitelino de embriões transgênicos de peixe-zebra. Após a incubação, visualizamos o embrião sob um microscópio fluorescente para observar a invasão, disseminação e metástase das células cancerígenas.

zPDX-Análise de Invasividade: Investigando o Comportamento Invasivo de Células Cancerígenas Metastáticas em Xenoenxertos de Embrião de Peixe-Zebra

Este vídeo descreve o ensaio de xenoenxerto de peixe-zebra para avaliar a formação de tumores in vivo e estudar o efeito de agentes terapêuticos.

Ensaio de Xenoenxerto de Peixe-Zebra: Um Método para Avaliar a Eficácia Anticancerígena da Terapêutica na Tumorigenicidade em Peixe-Zebra In Vivo

Este método utiliza embriões de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular. células cancerosas fluorescentes são injectados para dentro do seio precardiac ou saco vitelino de embriões em desenvolvimento. invasão vascular e celular do cancro do extravasamento é avaliada através de microscopia de fluorescência da região da cauda de 24 a 96 horas mais tarde.

Teste da capacidade Vascular invasiva das células cancerosas no peixe-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Aqui, descrevemos modelos peixe-zebra xenotransplante usando dois locais de injecção diferentes, ou seja, espaço perivitelínico e duto de Cuvier, para investigar o comportamento invasivo e avaliar a intravasation e extravasamento potencial das células de câncer de mama humanos, respectivamente.

Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

O transplante de células cancerosas é uma ferramenta importante para a identificação de mecanismos de câncer e respostas terapêuticas. As técnicas atuais dependem de animais imune-incompetentes. Descrevemos aqui um método para transplantar células tumorais de zebrafish em embriões imunocompetentes para a análise a longo prazo do comportamento de células tumorais e respostas de fármacos in vivo .

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo do rato do tumor-rolamento para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência.

Imagem de bioluminescência dupla de progressão tumoral e angiogênese

Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Os modelos pré-clínicos visam avançar no conhecimento da biologia do câncer e predizer a eficácia do tratamento. Este trabalho descreve a geração de xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) à base de peixe-zebra com fragmentos de tecido tumoral. Os zPDXs foram tratados com quimioterapia, cujo efeito terapêutico foi avaliado em termos de apoptose celular do tecido transplantado.

Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Descrevemos um protocolo de xenotransplante na gema de embriões transparentes de peixe-zebra que é otimizado por um método de estadiamento simples e rápido. As análises pós-injeção incluem sobrevida e avaliação da carga da doença de células xenotransplantadas por citometria de fluxo.

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Aprenda a quantificar a angiogênese tumoral em xenoenxertos usando larvas de zebrafish transgênicos com vasos sanguíneos fluorescentes. Este método permite medir com precisão a vascularização em modelos de câncer in vivo.

In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

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